生物工程角膜應用的研究

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0引言

角膜盲是我國第2位致盲性眼病。因受到同種異體角膜供體缺乏的制約，面對這樣龐大的角膜盲患者群體的需求，我國每年開展的角膜移植手術卻不到10000例。因此構建人工生物角膜成為了眼科界討論的熱點和難點。現(xiàn)有生物工程角膜是使用生物材料作為載體，通過細胞工程和組織工程技術，在體外重建的與正常角膜功能等效、形態(tài)與結構相仿的生物角膜組織。

1生物工程角膜的制備

取新鮮或保存后的同種異體或異種角膜基質，去除角膜內皮、上皮細胞后，在其表面分別種植相對應的細胞，構建成為正常角膜結構的人工組織工程化生物角膜。在角膜基質表面種植的細胞可以是同種異體角膜緣干細胞、誘導分化的胚胎干細胞源性角膜細胞，也可以是角膜內皮細胞。前期大量的研究已表明，采用異種角膜或轉基因豬的細胞可能成為解決角膜供體材料的方案之一，可用于大量生產角膜重建的生物材料[1]。角膜基質與角膜上皮、角膜內皮三層結構相比較，免疫原性是最低的。角膜基質層占細胞總免疫原性的1.62％，而內皮細胞層和上皮細胞層則分別占細胞總免疫原性的70.75％和27.63％[2]。吳靜等[3]分別利用新鮮豬角膜基質植片和脫水豬角膜植片制備異種角膜基質，在大鼠眼球上施行角膜移植，證實了豬角膜基質免疫原性低，移植于大鼠角膜后不會引起體內強烈的免疫排斥反應，是進行體外重建異種生物角膜很好的載體。

2生物角膜基質在臨床的應用

經過前期的開發(fā)和臨床試驗，由我國科學家自主研發(fā)的脫細胞豬角膜基質(APCS)，全球首個生物工程角膜于2015年通過了我國食品藥品管理局的上市批準。APCS取材于豬眼角膜，經病毒滅活與脫細胞等工藝制備而成，在脫細胞處理、去除細胞成分的同時，完好地保留了細胞外基質的成分和結構。其主要成分為膠原纖維骨架結構，保留了天然角膜的前彈力層和部分基質層，移植于受體角膜植床以后，由受體的角膜細胞附著、移行、增生到生物角膜基質中，促進組織再生和修復?？芍饾u被機體細胞所改建，形成與正常角膜相似的結構，恢復角膜的透明性，在臨床上替代角膜供體施行板層角膜移植手術[4]。豬與人在解剖生理方面有很多相似性，倫理上豬作為人體器官的替代來源也是可以接受的。角膜是相對免疫赦免的器官，脫細胞處理后的豬角膜基質不會產生嚴重的免疫排斥反應。在制備脫細胞豬角膜基質的時候，經過冷凍脫水、酶學消化、紫外線照射等處理，既去除了含抗原的細胞成份，又保留了天然的膠原纖維和基底膜骨架，是一種比較理想的人工生物角膜載體材料。APCS具有完整的細胞外基質、膠原纖維和前后彈力膜，適合角膜細胞。膠原纖維排列整齊規(guī)則，具有人角膜的天然形態(tài)，這是目前人工合成材料無法達到的。自生物角膜基質材料問世以來，我國已在多家大型醫(yī)院開展了使用生物工程角膜進行板層角膜移植手術，并做出了相關的報道，對其臨床效果進行評價。Zhang等[5]使用APCS移植，治療了47例真菌性角膜炎患者。通過最少6mo的隨訪，證實了APCS應用在人角膜移植中的安全性和有效性。在其隨訪期間，沒有觀察到感染復發(fā)的情況，同時也沒有發(fā)現(xiàn)明顯的排斥反應。說明APCS在臨床應用中提供了良好的組織相容性和低免疫原性。生物角膜與人角膜相似，在施行板層移植手術后的3~7d左右，植片完全上皮化。之后角膜植片水腫逐漸消退，1mo左右呈現(xiàn)正常角膜的透明形態(tài)。故治療感染性角膜炎時，在控制感染的同時，使患者在視功能上也得到恢復[6]。王素娟等利用激光共焦顯微鏡對APCS移植術后的角膜進行觀察發(fā)現(xiàn)，術后不同時間點的上皮細胞密度值穩(wěn)定[7]。術后6mo左右，可見到植片上皮下有神經纖維長入。在觀察中還發(fā)現(xiàn)，移植的APCS內未見有基質細胞的長入。由此推測豬角膜基質可能不適合人角膜基質細胞的生長，同時也不排除是因為APCS本身的缺陷問題，需要臨床上的進一步觀察和探討。目前APCS在臨床上應用的主要適應證是治療感染性角膜病。但也有使用生物工程角膜材料施行板層角膜移植治療角膜白斑[7]和角鞏膜皮樣瘤的報道。另外，還有學者想到使用生物角膜來治療老視[8]。利用角膜層間植入術在角膜上做加法(植入透鏡)，生物工程角膜材料打破了人角膜供體材料相對不足的局限，隨著人類老齡化的加劇，使用生物角膜治療老視有很大的前景。APCS在臨床上使用的時間不長，累計報道的病例有限，術后排斥反應和遠期的并發(fā)癥，植片與人角膜植片相比的形態(tài)學差異，以及在除感染性角膜病之外的臨床應用均需要進一步的研究與觀察。

3生物角膜內皮的研究前景

角膜病的患病率高，致盲性強，依靠生物角膜基質施行板層角膜移植手術僅能解決部分角膜供體匱乏的問題，故目前研究的熱點和難點是在體外構建有功能的生物角膜內皮細胞，為施行穿透性角膜移植提供新的細胞材料來源，使足量的角膜內皮可以用來彌補角膜供體的不足。角膜內皮通過調節(jié)角膜基質含水量來維持角膜透明度，當角膜內皮功能失代償時，角膜失去其原有的透明性，只有通過角膜內皮移植或穿透性角膜移植手術才能使患者復明。而目前使用捐獻的人角膜供體實施角膜移植手術，遠遠不能滿足角膜盲患者的需求。由于角膜內皮細胞幾乎沒有增殖能力，尋找新的細胞來源構建生物工程角膜內皮是目前研究的一大難點。通過體外培養(yǎng)和擴增獲得的人類供體來源的角膜內皮細胞(HCEC)，被認為是修復受損角膜內皮的優(yōu)質來源。理想的模型是，HCEC成功在體外培養(yǎng)后，放置在細胞載體或生物合成材料上，移植到前房內，替代人角膜內皮細胞，并長期維持角膜的透明性。已經有實驗在體外成功地擴增了人角膜內皮細胞，前期大量的動物實驗為角膜內皮移植和全層組織工程人工角膜的構建提供了理論的依據。Jin等利用可擴增的HCEC，并通過將細胞接種到脫細胞人角膜基質上，研究生物工程角膜組織構建的可行性。其使用角膜移植手術后廢棄的人角膜緣干細胞進行體外分離和培養(yǎng)角膜內皮細胞，并發(fā)現(xiàn)不同年齡供體均可以作為角膜內皮細胞的來源，但從年輕供體中可以收獲更多[9]。最終證實HCEC可以在體外的脫細胞角膜基質上保持活性，使用HCEC構建新生角膜可能成為高質量角膜移植材料的新來源。原始HCEC、人HCEC系和干細胞已被用于角膜內皮組織工程。在角膜移植手術后，通過角膜環(huán)鉆鉆取保留下來的供者角膜緣和不適合角膜移植的尸眼角膜為原始HCEC提供了來源。不同年齡階段的捐獻者均可以作為原始HCEC的培養(yǎng)基，但使用老齡供體進行體外培養(yǎng)HCEC，其增殖能力明顯減少[10－12]。干細胞是包括角膜內皮在內的許多器官工程的潛在來源，它們是器官特異性成人干細胞、定向分化能力強的胚胎干細胞，以及誘導的多能干細胞。成人干細胞被認為是位于角膜內皮和前部小梁網的連接處[13]。胚胎干細胞具有多能性和無限增殖能力的特點，然而由于倫理問題、免疫排斥和畸胎瘤形成的風險限制了胚胎干細胞在臨床試驗中的應用。同時生物安全問題、體細胞表觀遺傳記憶、非預期的基因組改變以及使用逆轉錄病毒或慢病毒轉導載體加劇的相關腫瘤發(fā)生，臨床試驗中使用誘導多能干細胞(IPS)也受到限制。球形HCEC和人類角膜基質前體可能是角膜內皮細胞的潛在來源[14－16]。在體外實驗中，對于承載HCEC的生物底物可有多種選擇。使用去除角膜內皮的脫細胞角膜材料作為HCEC基質[17－18]的好處在于它們提供了角膜所需的形狀、機械支撐和透明度，無需大量重新設計。羊膜(AM)在眼表疾病中的應用非常廣泛，其抗炎和非免疫原性特性使其成為承載HCEC的生物底物的重要因素。樊廷俊等以去上皮層的羊膜為載體，以非轉染人角膜內皮單克隆細胞為種子細胞，在體外構建組織工程人角膜內皮，并通過穿透性角膜移植手術將組織工程角膜移植到獼猴右眼。其發(fā)現(xiàn)移植眼的角膜沒有出現(xiàn)明顯的炎癥和免疫排斥反應，角膜維持透明，證明了體外構建的組織工程人角膜內皮具有與正常人角膜相似的形態(tài)結構，具有正常的角膜內皮功能[19]。人晶狀體囊膜也可以作為組織工程化角膜內皮的潛在基質，Bert等將HCEC接種在去上皮化的晶狀體囊膜上，結果表明晶狀體囊膜可維持透明性，適合體外HCEC的培育，是組織工程角膜生物底物合適的替代品[20]。同時，天然聚合物，其中包括層黏連蛋白和硫酸軟骨素的混合物、纖維連接蛋白、明膠、膠原、層黏連蛋白、來自培養(yǎng)牛角膜內皮細胞的細胞外基質都可作為HCEC的載體[19，21－27]。目前不同基質在角膜內皮組織工程中的開發(fā)和應用進展緩慢，研究合適基質的發(fā)現(xiàn)和衍生、HCEC培養(yǎng)技術的優(yōu)化顯得非常有價值，需要對人體角膜內皮的微環(huán)境進行深入的分析和洞察，并將這些特性應用到HCEC移植中，最終通過生物工程角膜滿足供體角膜日益有限的需求。角膜移植是治療角膜盲的主要手術方法，面對日益增長的角膜盲患者的需求與短缺的角膜供體材料之間的矛盾，尋找新的角膜材料來源是目前解決這一問題的重要手段。組織工程學是一門應用工程學與生命科學原理相結合的方法，通過不同的組織構建，使細胞與載體相結合，形成特定的具有生物活性的人工器官或組織。它標志著醫(yī)學將超越組織和器官移植僅能依靠人體捐獻的舊模式進入人工制造的時代。隨著生物工程角膜基質在臨床上的應用，其標準化的生產，干燥保存，且有不同厚度，可以滿足臨床上各類板層角膜移植的需求，為急需手術控制感染、保住眼球的患者帶來復明的希望。與此同時，還需要提高手術醫(yī)師的技巧、規(guī)范手術流程和術后管理，以提高生物角膜的移植成功率。但是，由于角膜內皮和上皮細胞，尤其是內皮細胞的體外增殖能力有限，使用生物工程角膜內皮移植和全層組織工程人工角膜的構建仍在一個探索的階段，動物實驗的觀察時間尚短，應用于臨床還有一段距離。需要應用我們所獲得的有關角膜的知識，更充分地了解角膜內皮細胞周期，尋找是否確實存在內皮周圍的干細胞群，為未來的發(fā)展提供幫助，為穿透性角膜移植提供新的具有可行性的組織工程材料來源。

作者：林莉