基因工程綜合性實驗教學(xué)改革實踐

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【摘要】綜合基因工程實驗課稱重幾個獨立的實驗內(nèi)容為一個綜合性實驗，以充分利用實驗教學(xué)時間，增加內(nèi)容，改進(jìn)試驗方法，由學(xué)生毒理設(shè)計實驗方案，獨立完成實驗內(nèi)容，讓學(xué)生在實驗教學(xué)過程中處于主導(dǎo)地位，達(dá)到了培養(yǎng)學(xué)生獨立思考，獨立操作以及獨立解決問題的綜合能力的目的。

【關(guān)鍵詞】基因組；PCR；基因重組；載體構(gòu)建；篩選；教學(xué)改革

基因工程是一門實踐性較強(qiáng)的科學(xué)，其要求從事基因工程操作的專業(yè)技術(shù)人員不但要有深厚的理論基礎(chǔ)，而且具有較強(qiáng)的動手能力。通過幾年的教學(xué)實踐，我們嘗試將基因工程中動物胸腺或脾臟有核細(xì)胞基因組DNA的提取、核酸的瓊脂糖凝膠電泳、DN段的回收與純化、PCR反應(yīng)及其產(chǎn)物檢測、限制性內(nèi)切酶切割DNA、DNA的重組和連接、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和重組DNA分子的轉(zhuǎn)化、重組轉(zhuǎn)化子DNA的鑒定（藍(lán)白斑篩選法）、轉(zhuǎn)化克隆的篩選和鑒定等獨立的實驗內(nèi)容整合為綜合設(shè)計性實驗，將原有的驗證性實驗轉(zhuǎn)化為探索式的設(shè)計性實驗，根據(jù)實驗要求，學(xué)生自主性選擇實驗組和，提出實驗方案，在老師指導(dǎo)下，獨立完成實驗內(nèi)容，達(dá)到啟發(fā)式教學(xué)的目的，提高學(xué)生學(xué)習(xí)的積極性和主動性。

一、教師準(zhǔn)備

1.確定實驗?zāi)康摹嶒炃?，教師確定本次綜合性實驗的實驗?zāi)康臑闃?gòu)建小鼠β-actin基因的表達(dá)載體，讓學(xué)生圍繞本實驗?zāi)康?，運用所學(xué)的理論知識，來設(shè)計相應(yīng)的實驗方案，并通過實施自己的實驗方案來鍛煉學(xué)生的綜合運用理論知識的能力及實驗設(shè)計和操作的能力。2.實驗材料準(zhǔn)備。小鼠，恒溫水浴鍋，高速離心機(jī)，高壓滅菌鍋，解剖剪，鑷子，微量移液器（1000ul、200ul、100ul、20ul、10ul、2.5ul），加樣槍頭（1000ul、200ul、10ul）離心管，PCR管，瓊脂糖凝膠電泳儀，瓊脂糖，核酸染料，β-actin基因PCR反應(yīng)試劑，膠回收試劑，大腸桿菌JM109等3.實驗分組。本次實驗共有一個年級三個班級的學(xué)生參與，根據(jù)學(xué)號分組，兩人一小組，四人一大組，小組人數(shù)不可太多，人說太多就會造成有些同學(xué)對實驗的參與度不夠，要讓每一個同學(xué)都參與到實驗當(dāng)中。4.試驗用具準(zhǔn)備。固定兩個實驗室，實驗準(zhǔn)備老師將實驗用到的儀器設(shè)備等都準(zhǔn)備好，供學(xué)生使用。

二、實驗過程

1.討論并制定實驗方案。以班級為單位，查閱資料，制定相應(yīng)的實驗方案，實驗方案要結(jié)合運用動物胸腺或脾臟有核細(xì)胞基因組DNA的提取、核酸的瓊脂糖凝膠電泳、DN段的回收與純化、PCR反應(yīng)及其產(chǎn)物檢測、限制性內(nèi)切酶切割DNA、DNA的重組和連接、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和重組DNA分子的轉(zhuǎn)化、重組轉(zhuǎn)化子DNA的鑒定（藍(lán)白斑篩選法）、轉(zhuǎn)化克隆的篩選和鑒定等基因工程技術(shù)，每個班級都要提出一個技術(shù)方案或流程。經(jīng)討論，最后確定了一個實驗?zāi)康牡娜N實驗技術(shù)方案。方案一：提取小鼠肝臟細(xì)胞基因組DNA→瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA→PCR擴(kuò)增β-actin基因→PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測→表達(dá)載體構(gòu)建→大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞構(gòu)建→遺傳轉(zhuǎn)化→重組子篩選（藍(lán)白斑篩選）。方案二：提取小鼠肝臟細(xì)胞基因組DNA→瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA→PCR擴(kuò)增β-actin基因→PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測→表達(dá)載體構(gòu)建→遺傳轉(zhuǎn)化→重組子篩選（藍(lán)白斑篩選）。方案三：提取小鼠肝臟細(xì)胞基因組DNA→瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA→PCR擴(kuò)增β-actin基因→PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測→膠純化目的片段→表達(dá)載體構(gòu)建→遺傳轉(zhuǎn)化→重組子篩選（藍(lán)白斑篩選）。實驗的實施：各班級按照既定的實驗方案進(jìn)行實驗，實驗過程以小組為單位進(jìn)行，針對實驗方案中的每一步的技術(shù)流程進(jìn)行討論，總結(jié)試驗中出現(xiàn)的問題及解決方法。實驗結(jié)束后每組同學(xué)提交一個實驗報告，針對試驗方法的優(yōu)缺點展開討論，提出自己的建議，針對實驗結(jié)果進(jìn)行分析。實驗結(jié)果：三種實驗方案都能達(dá)到預(yù)期實驗?zāi)繕?biāo)，即通過重組子篩選（藍(lán)白斑篩選）可以得到構(gòu)建成功的重組表達(dá)載體。方案一結(jié)果：電泳檢測提取基因組DNA，得到條帶整齊明亮，且對應(yīng)Marker質(zhì)量大小的條帶；PCR產(chǎn)物的電泳檢測，得到整齊明亮且對應(yīng)Marker質(zhì)量大小的單一條帶；標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化制備的感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞，得到大量藍(lán)斑菌落；重組子篩選得到清晰的藍(lán)白斑菌落。方案二結(jié)果：直接用標(biāo)準(zhǔn)的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞做遺傳轉(zhuǎn)化，降低了感受態(tài)細(xì)胞制備不成功給實驗帶來的風(fēng)險，成功了更高。方案三結(jié)果：對PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠純化，以純化的片段作為目的片段進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，提高了轉(zhuǎn)化子的純度。討論與分析：實驗結(jié)束后，以班級為單位，組織學(xué)生討論，針對本次實驗過程中出現(xiàn)的問題進(jìn)行總結(jié)，提出改進(jìn)方法。總結(jié)未得到陽性重組子的小組在試驗中的問題，并提出驗證方案。

三、討論

對于這樣的綜合性實驗教學(xué)改革，我們總結(jié)了近五年的實踐經(jīng)驗，每年組織一個年級，三個班級進(jìn)行實踐，大部分同學(xué)都能很積極主動的完成實驗內(nèi)容，增強(qiáng)學(xué)生對實驗課堂的主動性與主導(dǎo)性。并通過這樣的實驗教學(xué)方式鞏固理論學(xué)習(xí)，提高自身的操作技能水平，提高學(xué)生的團(tuán)結(jié)協(xié)作精神，科研素養(yǎng)及獨立解決問題的能力。實驗的方案設(shè)計、實施操作，數(shù)據(jù)記載。結(jié)果分析等全部過程都由學(xué)生獨立完成，教師在實驗過程中起到輔助作用，充分發(fā)揮學(xué)生的主導(dǎo)地位，為開放式教學(xué)提供了實踐經(jīng)驗。

作者:朱婷 石曉衛(wèi) 張靖 張展召 單位:新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院