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【關鍵詞】超聲微泡;雙自殺基因慢病毒載體;基因治療
【中圖分類號】R341 【文獻標識碼】A 【文章編號】1004-7484(2012)13-0013-02
目前,基因治療已成為一種全新的腫瘤治療模式,其中自殺基因治療是一種頗具臨床應用潛力的治療策略, 但是由于治療的靶向性成為關系到治療安全性的瓶頸問題。近年來研究表明[1-5],超聲微泡造影劑有望成為一種新型的體內(nèi)靶向給藥的載體系統(tǒng)。本研究旨在構建超聲微泡包裹的特異性雙自殺基因慢病毒載體,為臨床實時可視狀態(tài)進行超聲定位控釋和載質粒微泡基因治療奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 雙自殺基因慢病毒載體pLenti6-EGFP-KDRP-CD/TK的構建與包裝
1.1.1目的基因的擴增與TA克隆
提取正常人外周血gDNA,并通過PCR方法擴增出KDRP、CD、TK基因;回收
PCR產(chǎn)物并分別將其鏈接到pMD18-T載體上,構成重組T質粒;抽提質粒,并對各重組T質粒的酶切鑒定及測序;
1.1.2 慢病毒載體構建與包裝鑒定
將經(jīng)測序證實的T-KDRP、T-CD、T-TK三種質粒上的KDRP、CD、TK元件通過特定的限制性內(nèi)切酶酶切后,依次連接到經(jīng)相應酶酶切的pLenti6-EGFP載體上,經(jīng)脂質體法轉染至293T細胞,24h后通過熒光顯微鏡即可見GFP熒光表達,72h后收集上清,0.45um濾器過濾,25000rpm離心90min,沉淀溶于Hanks溶液,-80℃貯存?zhèn)溆?。將梯度稀釋的病毒液,加?93T細胞中,72h后置于熒光顯微鏡下觀察GFP的表達情況,計數(shù)發(fā)熒光細胞數(shù)目,根據(jù)病毒用量和稀釋度計算滴度。按公式計算病毒滴度:
病毒滴度=GFP細胞陽性數(shù)×病毒上清稀釋倍數(shù)/0. 4m1(pfu/ml)。
1.2 載藥粒微泡的制備于鑒定
1.2.1載藥粒微泡的制備
聲諾維sonovue為磷脂包裹的六氟化硫(SF6),按使用說明注入生理鹽水5 ml震蕩形成微泡混懸液。取50ul微泡懸液于1.5mlEP管內(nèi),再滴加入100MOI病毒載量的病毒上清液,輕輕混勻后室溫孵育20 min。
1.2.2載藥粒微泡的鑒定方法。
采用Malvern激光測量儀檢測載藥微泡的粒徑大小,光學顯微鏡觀察其外觀,采用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)測定載藥微泡的包封率和載藥量。
(1)粒徑大小比較
載質粒微泡為白色混懸液,PBS(Phosphate buffered saline 磷酸鹽緩沖生理鹽水)沖洗,靜置后分三層,上層、中間層為微泡,下層為PBS液。去除上層及下層液,取中層液,測定其粒徑大小,鏡下比較觀察載藥微泡與空白微泡外觀。
(2)包封率的測定
將制備好的含有慢病毒載體的微泡溶液中加入5%乙醇1 mL混勻,6℃,16000 rpm高速離心20min,去上層微泡,取下層液體,加5%乙醇0.5 mL稀釋沖洗,再加入適量乙醚,漩渦振搖,6000 rpm離心15 min,取乙醚層,50℃水浴揮干后,加0.5 mL甲醇溶解作為樣液,進樣量10μL。采用RP-HPLC測定雙自殺基因慢病毒載體pLenti6-EGFP-KDRP-CD/TK的包封率,按下式計算包封率:
包封率(%)=[(投入藥量―游離藥量)/投入藥量]×100%
(3)載藥量的測定
以下式計算載藥量:
載藥量%=(Wt~Wi)/Wc×100%
其中Wt為脂質微泡溶液中藥物總含量,Wi為游離藥物量,Wc為磷脂用量。
(4)穩(wěn)定性測定
4℃冰箱貯存,對短期內(nèi)的載藥微泡溶液的質量進行監(jiān)測。
取少量載藥微泡混懸液分別于1d、2d、5d、8d、10 d經(jīng)光學顯微鏡(×400)進行觀察其形態(tài)變化。第10 d的取該樣品由Malvern粒徑測量儀檢測粒徑。4℃冰箱貯存10 d后,RP-HPLC測定載藥微泡溶液的包封率。
2 結果
2.1 病毒滴度檢測結果:
經(jīng)熒光顯微鏡下觀察GFP的表達情況,計數(shù)發(fā)熒光細胞數(shù)目,根據(jù)病毒用量和稀釋度,獲得病毒滴度為(3.5×1012pfu/L)的雙自殺基因慢病毒載體pLenti6-EGFP-KDRP-CD/TK。
2.2 載藥微泡質量鑒定:
2.2.1包裹有pLenti6-EGFP-KDRP-CD/TK的聲諾維微泡與空白聲諾維微泡粒徑的對比觀察:
載質粒微泡呈乳白色混懸液,用磷酸鹽緩沖生理鹽水(Phosphate buffered saline PBS)沖洗,靜置后分三層,上層、中間層為微泡,下層為PBS液。
鏡下比較觀察載質粒微泡(圖A)與空白微泡(圖B)的形態(tài),其形態(tài)相近,為近似的圓形微泡。其粒徑范圍92%在2~5μm之間,平均粒徑約2.90μm(圖A),粒徑大小均相似。
2.2.2 包封率和載藥量測定結果
采用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)測定載藥微泡的包封率和載藥量,
得到結果:
包封率為90.6±3.1%。載藥量為29.2±0.9%。
2.2.3 穩(wěn)定性測定:
4℃冰箱貯存10 d后,可見仍為乳白色混懸液,光鏡下觀察,微泡粒徑大小未見明顯變化,微泡形態(tài)好,大小均勻,相互之間無明顯聚集現(xiàn)象,分層情況基本同前,樣品經(jīng)光鏡下觀察及Malvern測量儀檢測發(fā)現(xiàn),與制備初始相比,平均粒徑大小約3.08μm),未見明顯變化;RP-HPLC測得包封率:86.1±2.8%,沒有出現(xiàn)明顯藥物滲漏。
3 討論
基因治療已成為一種全新的腫瘤治療模式,其中自殺基因治療是近年來新興的腫瘤基因治療的研究熱點。自殺基因療法是利用基因工程技術將自殺基因轉入腫瘤細胞進行表達,注入體內(nèi)的無毒或低毒的前藥在表達的特異性酶作用下轉化成毒性產(chǎn)物,該產(chǎn)物可作為DNA合成的核苷替代物摻入到DNA中,干擾細胞DNA的合成,從而引起腫瘤細胞的死亡[6]。
本研究所采用的克隆方法并不是將PCR產(chǎn)物直接與表達載體相連接,而是先將PCR產(chǎn)物TA克隆,構建成重組T質粒后再將目的基因與表達載體酶切連接,主要是考慮到:PCR產(chǎn)物直接進表達載體成功率不高;而先進T載體,再酶切連接表達載體,可減少堿基錯配,提高成功率。目前己發(fā)現(xiàn)的自殺基因體系已有十多種,本實驗選擇胞嚓陡脫氨基酶基因(CD)和單純疤疹病毒胸普激酶基因 (HsV-TK簡稱TK)來構建雙自殺基因質粒,是因為研究表明[7],二者作用機制具有很強的互補性,將其連接在一起,構成融合基因,使兩個自殺基因體系協(xié)同作用,能顯著增強對腫瘤細胞的殺傷作用。同時選用腫瘤特異性啟動子KDRP,突破對腫瘤細胞類型的依賴性,擴大腫瘤基因治療譜。運用增強型GFP綠色熒光蛋白作為報告基因,可直觀的檢測目的基因的檢測和計算病毒滴度。而慢病毒載體最大的特點是可以感染分裂期及非分裂期細胞,容納外源性目的基因的片段大,可以在體內(nèi)長期地表達,不易誘發(fā)宿主免疫反應,安全性較好,可在更多范圍的宿主細胞內(nèi)生成高滴度的病毒,己成為當前基因治療中載體研究的熱點。
超聲微泡造影劑聲諾維可作為一種新型基因載體。在一定劑量超聲波的輻照下,利用微泡在超聲介導下的空化效應介導目的基因的靶向釋放和導入。國內(nèi)外許多學者通過體內(nèi)外實驗證實空化效應是超聲介導基因轉染的主要機制,微泡造影劑作為外源性空化核被引入體內(nèi)后大大增加了單位體積內(nèi)空化核的數(shù)量,降低超聲波的空化閉值,增強空化效應,從而提高基因轉染效率[3-4],尤其在抗腫瘤治療、溶栓治療等方面具有潛在的重要應用價值。經(jīng)靜脈注入載藥微泡后,用超聲輻照特定部位,含氣體的超聲造影劑在超聲波作用下會不斷地產(chǎn)生非對稱性收縮和膨脹,當聲能達到一定強度時,微泡破裂藥物被釋放到超聲所輻照的局部組織中。在這一過程中,微泡作為空化核增強空化效應,依靠能量輻射作用,使微泡破壞后釋放的藥物能夠進入血管壁甚至組織間隙,從而發(fā)揮定位靶向治療作用[2]。
而載藥微泡的外觀、粒徑大小、包封率、載藥量等是衡量載藥脂質微泡質量的最重要指標。我們制作的載雙自殺基因慢病毒載體微泡乳化良好,大小均勻,粒徑范圍92%在2-5μm,與空白微泡相似。微泡內(nèi)藥物的包封率為90.6±3.1%,載藥量為29.2±0.9%,均達到較理想的水平。此外穩(wěn)定性也是衡量載藥脂質微泡特性的主要指標之一,它能反映脂質微泡溶液包封率隨時間變化的情況。脂質微泡作為藥物載體穩(wěn)定性是指被包裹藥物在脂質微泡中的滯留性。經(jīng)由本實驗證實,我們制作的載藥微泡同時也具有較高的穩(wěn)定性。
本研究聯(lián)合了雙自殺基因的殺傷效應、KDR啟動子的腫瘤特異性、慢病毒載體的高載性和超聲微泡靶向的可控釋性等多種技術優(yōu)點,制備出了較為理想的載有靶向基因藥物的微泡,期望為進一步臨床實施可視狀態(tài)下的腫瘤的基因治療提供一種更加安全、高效的策略。
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作者簡介:
郝軼,碩士,主治醫(yī)師,新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院,830011。
基金項目:
新疆維吾爾自治區(qū)自然科學基金(編號:2011211B19)Correspondence to:HAO Yi(郝軼)
鈣離子循環(huán)在心肌細胞的興奮收縮耦聯(lián)中起著至關重要的作用。心肌細胞興奮去極化激活L-型鈣通道,少量Ca2+迅速內(nèi)流,胞內(nèi)鈣濃度增高,激活肌漿網(wǎng)上鈣釋放通道(ryanodinereceptor,RyR2),導致肌漿網(wǎng)內(nèi)貯存的Ca2+釋放入胞漿,此過程即鈣觸發(fā)鈣釋放(calcium-inducedcalciumre-lease,CICR)。胞漿中游離鈣達到10-5mol/L時,肌鈣蛋白被激活,肌鈣蛋白的構象改變,肌球蛋白和肌動蛋白接觸,引起心肌細胞收縮。肌漿網(wǎng)上的鈣泵(sarcoplasmicreticulumcalciumadenodinetriphosphatase,SERCA2)將胞漿內(nèi)游離Ca2+泵回肌漿網(wǎng)貯存,胞漿內(nèi)游離鈣降至10-7mol/L時,肌球蛋白和肌動蛋白分離,心肌舒張。心肌的收縮-舒張過程受到多種因素的調(diào)節(jié)。受磷蛋白(phospholamban,PLN)是存在于肌漿網(wǎng)縱行小管的膜蛋白,非磷酸化的PLN與SERCA2結合,通過蛋白-蛋白之間的相互作用抑制SERCA2與Ca2+的親和力,降低SERCA2的活性。環(huán)磷酸腺苷(cAMP)依賴性蛋白激酶A(PKA)和Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶(CaMBKⅡ)則使PLN磷酸化,磷酸化的PLN與SERCA2解離,消除其抑制作用,活化SERCA2??Х纫?、ATP、Na+、K+及磷酸化等都可以刺激RyR2的開放,而H+、釕紅和去磷酸化等則可以抑制RyR2的開放。FKBP12.6可以穩(wěn)定RyR2關閉時的構象狀態(tài)。S100A1作為一種鈣結合蛋白,對Ca2+有很強的結合力,可以調(diào)節(jié)RyR2和SERCA2的功能以及肌漿網(wǎng)鈣含量。β-腎上腺素受體的激活可以增強鈣循環(huán),加快心肌收縮和舒張的節(jié)律。
2.心力衰竭的基因治療
心臟收縮-舒張過程中任何一個環(huán)節(jié)的功能障礙都可能導致心肌的收縮和/或舒張功能降低,從而誘發(fā)心力衰竭的產(chǎn)生。心力衰竭的基因治療靶點即針對此過程中的鈣循環(huán)相關蛋白和調(diào)控因子?;蛑委煱ㄈ齻€基本要素:基因載體、轉移方式和靶基因。
(1)基因載體靶基因需要通過特定的載體轉移到靶細胞中去,目前常用的基因載體主要分為非病毒載體和病毒載體兩大類。非病毒載體可大致分為質粒DNA、脂質體DNA復合物和高分子DNA復合物。寡核苷酸類及其類似物,亦可單獨或以復合物的形式作為一種非病毒載體用于基因轉移。一種可降解的高分子聚合納米粒子,具有強大的核酸容量,避免了腺病毒轉染有關的安全問題,適合作為基因載體,已得到了美國FDA的批準[3]。病毒載體在臨床前研究中應用更為廣泛,主要包括腺病毒載體、腺相關病毒載體(AAV)、反轉錄病毒和慢病毒載體,病毒載體的應用大大提高了基因轉移的效率。重組人類腺病毒載體是轉基因治療模型中最常用的載體,它的優(yōu)勢在于:擴增相對容易,可以達到較高的病毒滴度發(fā)揮功能,對靶細胞存在尤其是對心血管系統(tǒng)廣泛親嗜性。無論在體內(nèi)還是體外環(huán)境下,絕大部分心肌細胞都可以被腺病毒有效轉染。然而,將腺病毒應用于臨床仍面臨許多挑戰(zhàn)。腺病毒進入機體后,可能會引起強烈的免疫和炎癥反應,這將限制其后續(xù)的表達。病毒可能感染所有的器官(尤其是肝臟),不能呈現(xiàn)理想的組織選擇性。相對于腺病毒,雖然AAV、反轉錄病毒和慢病毒載體有著較低的免疫原性,但是AAV難以達到高效價的病毒滴度,對靶基因的裝載能力有限以及人體本身存在中和抗體等。反轉錄病毒載體不能轉染類似心肌細胞的不分裂細胞,慢病毒的生物安全性尚待評價。
(2)載體轉移途徑目的基因轉移到靶細胞,除了需要適宜的載體,還要有適合的轉移途徑。一些可增加血管通透性的化學物質曾被用于促進載體從血管腔轉移至心肌,如硝酸甘油、硝普鈉、5-羥色胺、緩激肽、組胺及血管內(nèi)皮生長因子等,但是對于臨床心力衰竭患者,考慮到以上物質有降低血壓的作用,需謹慎應用。常用的轉移途徑包括:①順向注射法:一種為阻塞冠狀動脈的順向注射法,即用球囊阻塞冠狀動脈近端,使病毒載體不會逆流或被稀釋,但此法存在安全隱患,因為即使短時間的冠狀動脈阻塞也可能不能耐受;另一種為非阻塞冠狀動脈的延長順向注射法,此法用于AAV的轉移最為有效,而且可作為心力衰竭患者不能耐受冠狀動脈阻塞法的最佳選擇。盡管這種方法并不能感染所有心肌(約60%),但它更符合冠狀動脈的正常生理血流特點。重度心力衰竭患者接受攜帶SERCA2a的AAV1轉染的臨床研究,即采用了延長順向注射法。另一種為循環(huán)灌注技術,通過經(jīng)皮的最小微創(chuàng)手術建立心肌的獨立灌注區(qū)域,使冠狀動脈和冠狀竇之間形成一個閉合回路,此法在攜帶SERCA2a的腺病毒載體和AAV轉染綿羊心力衰竭模型中應用,證實可顯著改善心肌收縮力[4]。②逆向注射法:經(jīng)冠狀靜脈逆向注射對于有冠狀動脈疾病的患者來說是一個非常好的選擇。然而,逆向注射法對不能耐受冠狀動脈阻塞的患者也存在操作困難。③直接注射法:經(jīng)過外科手術或經(jīng)皮介入將載體直接注入到心肌組織,此法可避免許多血管內(nèi)途徑帶來的潛在弊端:肝臟和脾臟的首過消除作用、中和抗體的效應、T細胞應答以及血管內(nèi)皮屏障的不滲透性。直接注射法僅將病毒載體轉移至注射部位心肌。④心包腔途徑:經(jīng)由心包將載體轉移,載體會優(yōu)先在心包鄰近的心肌細胞中表達。如何最優(yōu)化心包轉移法的治療效應主要取決于多少比例的靶組織需要被糾正。局灶性的基因轉移適于局部缺血的心肌組織,彌散性的基因轉移更適于糾正整體的心功能不全。⑤手術轉移:通常需對實驗動物進行開胸手術,繼而采用直接、順向或逆向注射。然而,臨床心力衰竭患者能否耐受此法尚待進一步研究證實。
(3)靶基因理想的靶基因應具備以下特性:在心力衰竭動物模型證實能改善心功能,無致心律失常性,量效關系明確,即靶基因表達越多,心臟功能的改善越明顯[5]。如表1所示,迄今用于心力衰竭轉基因治療的靶基因包括[6-18]:鈣循環(huán)相關蛋白:①過表達SERCA2a:早在20余年前,Gwathmey等即發(fā)現(xiàn),無論心力衰竭病因如何均存在明顯的鈣循環(huán)異常,且部分歸因于SERCA2a的活性下降。大量的心力衰竭動物模型結果顯示,過表達SERCA2a基因可顯著增加心肌收縮功能,在容量負荷過重所致的心力衰竭豬模型,甚至可改善心室重構[6-7]。另外,過表達SERCA2a可修復心肌能量供應和利用的失衡,降低室性心律失常發(fā)生,增加冠狀動脈血流[8,19]。②抑制PLN:抑制PLN的表達,可起到與過表達SERCA2a相似的效應,進一步改善心肌的收縮和舒張功能。在起搏誘導的羊心力衰竭模型,通過基因沉默抑制PLN的表達,2周后,即顯示PLN抑制組左心室舒張末徑顯著減小,射血分數(shù)顯著增加[9]。利用RNA干擾技術,將攜帶抑制PLN表達的基因序列的AAV9,通過靜脈注射轉染心臟結果顯示:PLN蛋白表達下降了75%,SERCA2a的活性部分恢復,心力衰竭大鼠的血流動力學特性顯著改善,收縮功能、舒張功能各項指標均恢復正常,心室肥厚、心肌纖維化程度均明顯下降[10]。③S100A1:S100是一類鈣結合蛋白,其中S100A1主要在心臟表達。S100A1參與了對細胞內(nèi)外Ca2+調(diào)控的多個環(huán)節(jié),可增加肌漿網(wǎng)SERCA2a和RyR2的活性促進心肌的收縮和舒張,調(diào)節(jié)細胞膜的順應性和對Ca2+的反應性,調(diào)控Ca2+介導的線粒體的能量代謝[20-21]。在心肌梗死后心力衰竭豬模型,通過冠狀靜脈逆向轉移法,將AAV-S100A1注射至左心室非梗死區(qū)結果顯示:注射14周后,S100A1治療組修復了肌漿網(wǎng)的鈣循環(huán)障礙,抑制了進行性的心功能下降,逆轉了左心室重構,且不增加室性心律失常的誘發(fā)率,證實了S100A1轉基因治療的長期有效性和安全性[11-12]。β腎上腺素受體(β-AR)系統(tǒng):心力衰竭患者的β-AR往往呈現(xiàn)為表達下調(diào)。將攜帶β2-AR的腺病毒經(jīng)冠狀動脈轉染兔心肌細胞,發(fā)現(xiàn)在轉染后第1周、3周時,反映心肌收縮力的指標dP/dtmax明顯增加,且心肌細胞對β-AR激動劑異丙腎上腺素的反應性顯著增強[22]。過表達β2-AR的小鼠亦顯示心臟功能得到明顯改善。G蛋白偶聯(lián)受體激酶(GRK):β-ARs與G蛋白之間的相互作用是通過激酶對偶聯(lián)受體的磷酸化調(diào)節(jié)作用來實現(xiàn)的。GRK2是心臟中表達最多的GRK,它在心力衰竭時表達增加,導致β-AR信號通路敏感性下降,功能障礙。在心肌梗死后心力衰竭小鼠模型,選擇性的抑制GRK2表達,結果發(fā)現(xiàn)10天后,GRK2抑制組小鼠生存率增高,心室重構延緩,心肌的收縮力增強[23]。β-ARKct多肽是GRK2介導的β-AR失敏的抑制劑。將攜帶β-ARKct的腺病毒感染心梗后心力衰竭兔,發(fā)現(xiàn)轉染后3周,心室功能明顯改善[16]。β-ARKct過表達的陽性結果在豬的心力衰竭模型上亦得到驗證[17]。腺苷酸環(huán)化酶(AC):心肌細胞接受兒茶酚胺刺激,經(jīng)由β-AR使細胞內(nèi)AC激活,生成cAMP,這是正常的生理反應。分離過表達VI型AC的轉基因小鼠心肌細胞,發(fā)現(xiàn)cAMP表達增高,心功能增強[24]。在起搏誘導的心力衰竭豬模型,轉染攜帶Ⅵ型AC基因的腺病毒,結果顯示可顯著改善心臟功能和逆轉心室重構,且這種效應與cAMP的生成增多具有明顯相關性[18]。
3.心力衰竭基因治療的臨床試驗
靶基因在細胞模型、嚙齒類動物模型和大動物模型上均得到驗證,合適的載體和適宜的轉移途徑,這些是開展臨床試驗的前提。誠然臨床試驗開始前還需要充分評價機體對病毒載體的免疫反應、明確心功能指標的評價標準以及評價罹患心律失常的風險[25]。既往因病毒載體所導致的嚴重不良事件,如注射重組腺病毒后誘發(fā)的多器官衰竭、注射反轉錄病毒后出現(xiàn)的T細胞淋巴瘤等,限制了基因治療的發(fā)展。隨后新的研究進展和新的病毒載體的迅速出現(xiàn),突破了以上技術瓶頸,為轉基因治療領域帶來了新的曙光[26]。心力衰竭轉基因治療第一項臨床試驗始于2007年,是在美國發(fā)起的多中心CUPID(calciumup-regulationbypercu-taneousadministrationofgenetherapyincardiacdisease)研究,旨在評價AAV1-SERCA2a基因治療對晚期心力衰竭患者的安全性及生物學療效。第一期試驗共納入12例患者,通過冠狀動脈內(nèi)注射給藥,四組內(nèi)的每3例患者均依次增加給藥劑量。隨訪至第12個月時,試驗結果顯示安全性尚可,41.7%的患者顯示癥狀改善,33.3%顯示功能改善,16.7%顯示生物標志物改善,50%有左心室功能和重構改善[27]。在二期試驗中,共39例晚期心力衰竭患者隨機接受AAV1-SERCA2a治療,分為低劑量組、中等劑量組、高劑量組和安慰劑組。在第6個月時,評價患者的癥狀(NYHA分級、明尼蘇達心力衰竭問卷)、功能狀態(tài)(6分鐘步行實驗、最大氧耗量)、NT-BNP水平、心臟超聲各項指標等。組間和組內(nèi)患者比較,以上臨床指標具有一致性的改善才被認為是試驗成功。高劑量AAV1-SERCA2a治療組達到了預設定的成功標準。與安慰劑相比,AAV1-SERCA2a治療的患者顯示NYHA分級、明尼蘇達心力衰竭評分、6分鐘步行實驗、最大氧耗量、NT-BNP水平和左心室收縮末期容積得到改善或穩(wěn)定。所有接受AAV1-SERCA2a治療的患者心血管事件發(fā)生率均降低,不良反應、疾病相關事件及心律失常均未見增加[28]。隨訪至3年,SERCA2a基因仍在表達,治療的臨床效果仍然存在[29]。入選250例,以SERCA2a為靶基因的CUPID2b期試驗(NCT01643330)即將完成[30]。另兩項以SERCA2a為靶基因的試驗也正在進行當中。第一項試驗在英國實施,納入的是在AAV6-SERCA2a治療前接受左心室輔助裝置治療至少1個月的晚期心力衰竭患者。另一項二期臨床試驗AGENT-HF(AAV6-CMV-Serca2aGENetherapytrialinheartfailure)在法國實施,是一項單中心、雙盲、隨機、安慰劑對照的平行研究,主要探討AAV6-CMV-SERCA2a治療對嚴重心力衰竭患者心臟重構的影響。此外,尚有以AC6、SDF-1為靶基因的臨床試驗正在進行中。
[關鍵詞]基因編輯技術; CRISPR/CAS9; ZFNs; TALENs
基因編輯技術是一項對基因組進行精確定點修飾的技術,可對特定DN段進行敲除、加入和替換等,從而在基因組水平上進行精確的基因編輯。此過程模擬了基因的自然突變,修改并編輯了生物的基因組,使研究人員可以在極短時間內(nèi)模擬自然界漫長時間的基因演變,甚至能夠完成自然進化中無法完成的基因組改變。在科研領域,該技術可以快速構建模式動物,節(jié)約大量科研時間和經(jīng)費;在農(nóng)業(yè)領域,該技術可以人為改造基因序列,使之符合人們的要求,研制如改良水稻等糧食作物;在醫(yī)療領域,該技術可以更加準確、深入地了解疾病發(fā)病機制和探究基因功能,以及改造人的基因,達到基因治療的目的等。因此,基因編輯技術具有極其廣泛的發(fā)展前景和應用價值。
鋅指核酸酶(zincfinger nucleases,ZFN)、轉錄激活因子樣效應物核酸酶 (transcription activatorlike effector nucleases,TALENs)和成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復序列CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)是三大基因編輯技術。這3種技術皆是通過在特定的靶向序列處引入雙鏈斷裂缺口(doublestrand break,DSB),繼而通過NHEJ途徑(nonhomologous end joining,NHEJ)和HR(homologous recombination,HR)途徑這2種細胞內(nèi)DNA修復機制完成修復。NHEJ途徑(nonhomologous endjoining,NHEJ)使基因MDNA缺口處有堿基的插入或者缺失,造成移碼突變,導致基因的敲除;HR(homologous recombination,HR)途徑在提供外源DNA模板的條件下使基因組DNA得到精確的基因修復或靶向基因的添加[1]。由此可見,這3種基因編輯技術本質上均是利用非同源末端鏈接途徑修復和同源重組修復,聯(lián)合特異性DNA靶向識別及核酸內(nèi)切酶完成的DNA序列改變。
11ZFNs每個鋅指核酸酶單體都是由鋅指蛋白(zinc finger protein,ZFP)與非特異核酸酶結合的人工合成酶。此酶的N端部分是能識別含有特定DNA序列的鋅指蛋白,C端部分則由非特異性切割結構域Fok I以及連接DNA結合結構域和內(nèi)切酶的肽段組成[23]。ZFN的特異性取決于ZFP,因此篩選高質量的ZFP是獲得高效、特異性的ZFN的前提[47]。ZFP通常由3~6個鋅指組成,每個鋅指識別基因組中連續(xù)的3個堿基。ZFP一旦與基因組中的特定序列結合,F(xiàn)ok I核酸內(nèi)切酶便會形成二聚體發(fā)揮內(nèi)切酶活性,產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂的缺口,繼而通過細胞內(nèi)修復機制對斷裂部位的基因進行修飾[811](圖1)。ZFN的基因打靶效率一般能夠達到30%,可以做到針對特定序列設計ZFN來實現(xiàn)對靶基因的修飾。然而ZFN識別結構域存在的上下文依賴效應大大降低了ZFN設計和篩選效率。目前尚不能針對任意一段序列均可設計出滿足要求的ZFN,也不能在每一個功能性染色體區(qū)段都能夠順利找到適合的ZFN作用位點。在ZFN的篩選和設計方面存在較大的技術困難之外,其制備價格也比較昂貴。此外,ZFN的脫靶切割也往往會導致細胞毒性。綜上這些因素使得ZFN在基因治療領域的應用有一定的局限性。
12TALENsTALEN是植物病原菌黃單胞桿菌Xanthomonas sp.產(chǎn)生的TALE蛋白的中央?yún)^(qū)域結構域與FokⅠ核酸內(nèi)切酶結構域組合而成的一類重組核酸酶。TALE蛋白的中央?yún)^(qū)域結構域是該蛋白識別特異DNA序列的結構域。它包含了155~195個蛋白單元模塊,每個模塊單元有34個氨基酸殘基,其中除第12和13位氨基酸可變外,其他氨基酸都是保守的。因此,這第12和13位氨基酸被稱作重復可變的雙氨基酸殘基(repeat variable diresidues,RVDs) 位點[12],是靶向識別的關鍵。由于TALE存在多種變體,所以可以構建出靶向基因組中預設DNA靶位點的多種TALEN。相比ZFN技術,TALEN使用了TALE蛋白的中央?yún)^(qū)域結構域代替ZFP作為人工核酸酶的識別結構域,更好地解決了DNA序列識別特異性低的問題。TALE蛋白中央?yún)^(qū)域結構域對堿基的識別只由2個氨基酸殘基決定:組氨酸天冬氨酸特異識別堿基C,即HD(His Asp)C;天冬酰胺異亮氨酸識別堿基A,即NI(Asn Ile)A;天冬酰胺甘氨酸識別堿基T,即NG (AsnGly)T;天冬酰胺天冬酰胺識別堿基G或A,即NN(AsnAsn)G或A;天冬酰胺賴氨酸識別堿基G,即NK(Asn Lys)G;天冬酰胺絲氨酸可以識別A,T,G,C 中的任一種NS (AsnSer)A,T,C,G [1314](圖2)。這種與DNA堿基一一對應的方式在設計上相對于ZFN要簡單得多。然而,在實際構建過程中,TALE分子的模塊組裝和篩選過程也比較繁雜,通常需要大量的測序工作。這使得該技術的使用成本較高,對于普通實驗室的可操作性較低。此外,TALEN分子比ZFN大得多,因而在不能高效導入細胞方面也限制了它的應用。
13CRISPR/Cas9CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences/CRISPRassociated protein)系統(tǒng)是在細菌和古細菌中發(fā)現(xiàn)的一種獲得性免疫系統(tǒng)[15],由成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復序列CRISPR與Cas蛋白組成,能特異性識別外源病毒或質粒的核酸物質,并對其進行剪切,起到防疫外源核酸入侵的作用[16]。其中CRISPR簇通過轉錄生成一段非碼RNA,即CRISPR前體
的靶標可設計為針對一個基因,也為針對多個基因,都能達到有效的特異性位點編輯的效果。CRISPR/Cas9系統(tǒng)已被公認為是繼“鋅指核酸內(nèi)切酶(ZFN)”、“類轉錄激活因子效應物核酸酶(TALEN)”之后出現(xiàn)的第3代“基因組定點編輯技術”。ZNFs和TALENs作用時均是采用蛋白質對DNA序列的識別,而CRISPR/Cas9對靶序列的識別是RNA與DNA的堿基配對過程。該識別方式使得CRISPR/Cas9與前二者相比更為精準,降低了脫靶切割的幾率,減低了細胞毒性。CRISPR/Cas9所有成分都可以通過導入質粒進行表達,因此也省去了耗時耗力的蛋白質工程過程。同時,研究人員可以通過生物信息學分析,設計出針對絕大多數(shù)基因的特異性靶標識別crRNA。因此,與前2代技術相比,CRISPR/Cas9成本低、制作簡便、快捷高效、脫靶率低的優(yōu)點使其迅速風靡于世界各地的實驗室,成為科研、醫(yī)療等領域的有效工具,逐漸成為當今分子生物學領域最炙手可熱的技術之一。然而CRISPR/Cas9 系統(tǒng)也存在著一些不完美之處:Cas9 蛋白對于目標序列的識別除了依靠crRNA序列的匹配之外,目標序列附近必須存在一些小的前間區(qū)序列鄰近基序(PAM),因此Cas9 蛋白對于設定序列的切割仍有局限性;另外和ZFNs及TALENs技術一樣,CRISPR/Cas9也面臨著如何控制雙鏈斷裂之后的非同源末端連接修復可能會隨機產(chǎn)生細胞毒性的問題。
14 NgAgoCRISPR是以RNA為向導尋找靶向序列,而NgAgo則是以DNA來擔任向導。韓春雨等的工作顯示,NgAgo可結合24個堿基的gDNA,比CRISPR結合19個堿基的gRNA要長5個堿基,因此理論上精確性要高1 024倍,脫靶率也較低。然而,不同于CRISPR/Cas9技術大量運用已獲得了實踐驗證,NgAgo的作用效果還有待于今后工作的檢驗。
2基因編碼技術的應用
21在基因治療中的應用隨著DNA雙螺旋結構的發(fā)現(xiàn)和以DNA重組技術為代表的現(xiàn)代分子生物學技術的發(fā)展,以及人類對疾病認識的不斷深入,越來越多的證據(jù)表明,許多疾病都與基因突變、缺失或表達異常有關,由此基因治療技術順勢而生?;蛑委熓侵笐没蚬こ碳夹g將正?;蚧蛴兄委熥饔玫幕蛞牖颊呒毎麅?nèi),以糾正致病基因的缺陷而根治疾病。其最核心的策略是通過細胞內(nèi)基因修飾來治療疾病。近兩三年來,基因編碼技術作為該策略的新生力量開始活躍在基因治療的舞臺上,在癌癥、遺傳性疾病和逆轉錄病毒相關的傳染病等疾病的治療方面取得許多堪稱跨時代的佳績。
癌癥治療方面:2015年11月英國倫敦大奧蒙德街醫(yī)院(Great Ormond Street Hospital)的醫(yī)生第一次依靠使用“分子剪刀”修改基因的療法,成功地治愈了一名患有“無法治愈的”白血病的1歲女孩“萊拉”(Layla)。其治療方案是利用TALEN蛋白對異體T細胞進行基因編輯,去除內(nèi)源性TCR(提高腫瘤殺傷特異性)及CD52(避免藥物alemtuzumab的干擾),并命名為antiCD19 CART細胞,再將這些經(jīng)過設計的“人工培育的免疫細胞”輸入患者體內(nèi)去捕捉和殺傷腫瘤細胞。經(jīng)過1個月的治療,這名女孩目前擺脫了癌癥,身體狀況很不錯,成為世界上首次用基因編輯治愈的白血病女孩[18]。此外,科學家們在過去的幾十年中已經(jīng)確定了許多腫瘤治療中相關的基因,包括原癌基因、抑癌基因、基因組修飾類、基因抗藥性基因。近2年,研究者們已經(jīng)開始利用基因編碼技術對上述基因開展了大規(guī)模的基因編輯修飾研究,預計今后幾年內(nèi)會出現(xiàn)多項癌癥治療方面的重大突破。
遺傳性疾病治療方面:2015年底《Nature》雜志發(fā)表的對2016年熱點研究領域的展望(The science to look out for in 2016)中提到美國加利福尼亞州里士滿Sangamo生物科學公司將計劃開展利用ZFN糾正導致血友病基因缺陷的人體試驗,并對其研究成果表示非常期待。另外該公司還與馬薩諸塞州劍橋市的Biogen公司合作開始了另一項試驗,嘗試通過該技術提高β地中海貧血患者體內(nèi)一種血液球蛋白的功能[19]。已有研究證實人β珠蛋白(HBB)基因的突變可能導致地中海貧血癥。我國中山大學黃軍就和他的團隊利用CRISPRCas9基因編輯技術,修改了人類胚胎HBB基因的DNA,為治療地中海貧血癥提供了可能。該研究中一共使用了86個胚胎,48 h后有71個胚胎存活,其中在54個接受了基因測試的胚胎中僅有28個胚胎的基因被成功修改,但其中只有一小部分包含替代的遺傳物質。該研究是史上第一例利用基因編輯技術改造人類胚胎細胞的案例。盡管該研究使用的胚胎均為無法發(fā)育成嬰兒、不能正常出生的胚胎,該成果的倫理問題在西方仍引發(fā)巨大爭議,由此《Nature》的記者和編輯們最終將黃軍就選入了年度十大人物之列[20]。多種肌肉營養(yǎng)障礙癥(duchenne muscular dystrophy,DMD)是表達dystrophin蛋白的基因發(fā)生移碼突變,導致不能形成有功能的抗肌萎縮蛋白dystrophin所引發(fā)的一種遺傳性疾病。2014年研究者已利用CRISPR技術成功修復了小鼠胚胎中的dystrophin基因缺陷。今年,西南醫(yī)學中心的Chengzu Long,杜克大學的Charles Gersbach,哈佛大學Amy Wagers 與MIT張鋒合作研究組這3個獨立的研究組又分別完成了小鼠成年體的基因修復。其中Chengzu Long研究組的研究方案為利用腺病毒將gRNA以及CRISPR/Cas9導入肌肉細胞,利用CRISPR/Cas9切除有缺陷的DN段,使小鼠能夠產(chǎn)生較短版本的有功能的dystrophin蛋白[21]。
逆轉錄病毒相關傳染病的治療方面:HIV病毒的基因會整合到病人的基因組上。利用抗逆轉錄病毒藥物治療僅能抑制HIV病毒的復制但對整合在細胞中的病毒DNA不起作用,一旦停止服用藥物這些病毒余孽就會起死回生,開始產(chǎn)生艾滋病原體。因此只有清除整合在宿主靶細胞上的HIV病毒基因才能實現(xiàn)根治艾滋病的夢想。2013 年,朱煥章等設計并獲得了一對能特異靶向多數(shù)HIV亞型基因保守區(qū)LTR (long terminal repeat) 的ZFN,并證實該ZFN能特異性靶向HIV感染及潛伏細胞系上的HIV1前病毒LTR,且介導了HIV1整合基因的高效切除,畝獲得了顯著抗HIV感染的效果[22]。今年,Rafal等[23]利用CRISPR/Cas9技術使帶有HIV病毒的T細胞失去活性,同時病毒復制在受感染細胞中降低了90%。這一治療方案預計在兩三年后開展臨床試驗。
22在新方法學及動物模型制備上的應用當前,各類基因敲除(knockout)和基因嵌入/置換(knockin)基因工程動物及細胞系已經(jīng)成為現(xiàn)代醫(yī)學認識疾病發(fā)生發(fā)展規(guī)律、研究疾病預防和治療的重要實驗工具和手段。傳統(tǒng)的基因工程動物制備工藝――基因打靶技術是基于胚胎干細胞的一種同源重組技術。利用該技術制備基因修飾動物周期較長且存在生殖系統(tǒng)傳遞失敗的風險。新型的基因編碼技術系統(tǒng)可在小鼠受精卵中直接進行基因組編輯,因而快速、高效、低成本、無物種限制地一步生成基因工程動物。復旦大學生命科學學院遺傳工程國家重點實驗室的研究人員通過CRISPR/Cas9技術進行凝血因子Ⅸ(Factor Ⅸ,F(xiàn)Ⅸ)基因敲除,快速、高效地構建血友病乙模型小鼠,以期為血友病乙的研究提供更加便捷的途徑[24]。Park 等[25]使用TALEN 技術將誘導的多能干細胞中含有F8 基因的140 kb染色體片段倒置,建立了小鼠血友病A模型,并且再次通過TALEN基因編輯工具將其之前倒置的染色體片段再重新恢復到正常。實驗結果表明TALEN基因編輯工具既可以建立疾病模型,又可以介導疾病的再次糾正。軍事醫(yī)學科學院的研究人員利用CRISPR/Cas9介導的同源重組,將有絲分裂降解結構域MD(Mitosisspecial degradation domain,MD)插入到進基因組表達框上游,以期周期性持續(xù)降解細胞內(nèi)CTCF(CCCTC binding factor,CTCF)蛋白,從而獲得CTCF蛋白特異性降解細胞系,為后續(xù)研究CTCF功能奠定基礎[26]。
此外,隨著現(xiàn)代生物技術的不斷發(fā)展和完善,基因編輯技術已經(jīng)變?yōu)榭蒲腥藛T的新寵,越來越多的科學家運用其與其他技術相結合進行各種學術研究。第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院和重慶大學的研究人員通過CRISPR/Cas9介導的同源重組修復方法,用GFP標記HCC細胞中的內(nèi)源多功能性因子Nanog,證明雄激素/雄激素受體軸可以通過直接結合其啟動子,增加Nanog的表達,并促進HCC細胞的干性和腫瘤發(fā)生[27],從而初步闡明了肝癌發(fā)生的性別差異的機制。CRISPR/Cas9技術的成熟使得利用多重sgRNA載體高效、高通量編輯細胞內(nèi)基因成為可能,為新型功能遺傳篩選創(chuàng)造了條件。IAA2(indole acetic acid 2)是擬南芥Aux/IAA生長素響應基因大家族中的一員。由于沒有該基因的失去功能型突變體,其功能和作用機制的研究受到了阻礙。研究人員在GoldenGate克隆技術的基礎上,將每3個sgRNA串聯(lián)到同一個入門載體中,再將入門載體與含Cas9表達框的目標載體LR反應,獲得最終的表達載體。結果表明,設計的6個sgRNA有4個發(fā)揮了作用,產(chǎn)生了堿基插入突變和大片段缺失突變等多種可遺傳的突變,所得到的突變體為后續(xù)的IAA2功能研究提供了良好的材料[28]。
23其他應用前景目前,世界各地的實驗室已將基因編輯技術應用于生物學研究的各個領域。
預防瘧疾:利用CRISPR/Cas9對蚊子的基因進行改造,使其攜帶一種抗瘧疾的基因,從而對瘧原蟲產(chǎn)生抑制,進而遏制瘧疾的傳播[29]。另一種改造為導入不孕基因,使瘧蚊滅絕[30]。
器官移植:利用CRISPR/Cas9基因編輯技術,對豬胰島素基因進行了無痕定點修飾,使豬胰島素基因編碼生產(chǎn)人胰島素,成功建立了完全分泌人胰島素的基因編輯豬。這為糖尿病人提供更為理想的臨床異種胰島移植供體。另外,有研究改造了豬肺基因以利于用于人體肺移植,以及去除了豬器官上的內(nèi)源性逆轉錄病毒(PERV)以防止移植器官帶來的病毒感染[31]。
生物制藥:北京蛋白質組研究中心張普民教授及其研究團隊利用CRISPR/Cas9技術對豬受精卵的基因組進行了基因編輯,在豬白蛋白的基因區(qū)域插入了人白蛋白的編碼DNA,使豬只產(chǎn)生人白蛋白而不產(chǎn)生豬白蛋白[32]。
農(nóng)業(yè)育種改良:利用CRISPR/Cas9技術幾年內(nèi)可實現(xiàn)至少50~100年才能完成的育種改良工作。圣保羅Recombinetics公司利用該技術培育出不會長角的牛,從而使牛無須經(jīng)歷被切去牛角的痛苦過程。目前該公司正致力于培育永遠不需要被的豬。
滅絕物種復活:加州大學圣克魯斯分校Ben Novak將滅絕的候鴿的博物館標本DNA與現(xiàn)存鴿子進行序列比對,并嘗試對現(xiàn)存鴿子進行基因改造,使這些鴿子變得更接近滅絕的候鴿。
3基因編碼技術的爭議與思考
基因編輯技術可謂當今生命科學界炙手可熱的前沿科技。顧名思義,該技術能夠對最基本的遺傳單位――基因直接進行設計和修改,其意義和價值可想而知。這使得各大公司迅速加入到基因編輯的產(chǎn)業(yè)之中。2015年8月,比爾及梅林達?蓋茨基金會和谷歌風投基金投資Editas醫(yī)藥公司1.2億美元;2015年10月杜邦與Caribou生物科學公司達成了合作協(xié)議,使用CrisprCas9技術來改進農(nóng)作物(http://wwwnaturecom/news/genomeediting7factsaboutarevolutionarytechnology118869)。中國基因編輯技術產(chǎn)業(yè)已走在世界的前列:在CRISPR技術數(shù)上中國僅次于美國,位居世界第2;目前50多家中國研究機構已提交了基因編輯專利;勁嘉股份與黃軍就團隊合作開展CRISPR技術治療地中海貧血在臨床應用方面的研究。中泰證券的分析師認為未來5年僅地中海貧血基因治療的國內(nèi)潛在市場空間超過500億元。與此同時,隨著基因編碼技術的不斷發(fā)展,CRISPR/Cas9系統(tǒng)相對前兩代技術效率提升了10倍以上,操作容易程度提升了100~1 000倍,構建周期縮短至原來的1/12,成本由5 000美元降低至30美元,脫靶率依據(jù)最新技術已降低至目前檢測技術檢測不到的水平。脫靶率、效率、便攜性及成本的極大改善,使得該技術更平民化,技術門檻越來越低。它已成為許多車庫生物學家/草根生物學家以及生物黑客的新寵。都柏林生物黑客和企業(yè)家Andreas Stürmer說,CRISPR是有史以來最了不起的工具,可以在自己的家里玩(http://wwwnaturecom/news/biohackersgearupforgenomeediting118236)。
但任何事物都有其雙面性,基因編輯技術產(chǎn)業(yè)雖然能夠造福于人類,然而上面所述的巨大的經(jīng)濟利益驅動以及越來越低的技術門檻,再加上人類對自身健康改良的迫切心態(tài)極可能導致對該技術的濫用,進而對人類和地球環(huán)境形成威脅,甚至造成意想不到的生態(tài)災難。在美國國家情報總監(jiān)詹姆斯?克拉珀的威脅評估報告中,“基因編輯”已經(jīng)被列入“大規(guī)模毀滅性武器和武器的擴散”威脅名單,與核武器并列(https://wwwtechnologyreviewcom/s/600774/topusintelligenceofficialcallsgeneeditingawmdthreat/)。因此,關于該技術運用的爭議從其誕生之日就已出現(xiàn),并呈愈演愈烈之勢?,F(xiàn)有爭議最集中之處為關于人類胚胎改造的倫理學爭議。史上第一、二例基因編輯技術改造人類胚胎細胞的研究皆出現(xiàn)在中國。2015年4月,中山大學黃軍就和他的團隊利用CRISPRCas9基因編輯技術,為治療地中海貧血癥修改了人類胚胎基因組[33]。2016年4月29日廣州醫(yī)科大學范勇團隊,宣布他們用基因編輯技術制造出一個能對艾滋病毒免疫的人類胚胎[34]。盡管這2例基因編輯研究都使用的是人類三核受精卵(不能正常發(fā)育的受精卵),但在國際上仍引起了廣泛的關注和全球科學家激烈的討論。討論的焦點不在于文章的學術價值,而在于改造人類胚胎細胞的倫理問題。由于基因編譯技術引發(fā)的倫理問題迫在眉睫,2015年12月1日,由美國國家科學院、美國國家醫(yī)學院、中國科W院和英國皇家學會聯(lián)合組織召集的人類基因組編輯國際峰會在華盛頓召開。會議重點了解各方對基因編輯技術的倫理問題的態(tài)度和想法。美國再生醫(yī)學聯(lián)盟主席蘭菲爾(Edward Lanphier)等在《Nature》雜志上發(fā)表評論文章稱,希望研究人員暫時不要對人類生殖細胞進行基因編輯,否則可能對后代產(chǎn)生無法預測的后果[35]。然而,人類胚胎改造的研究終究為大勢所趨。2016年2月1日,英國政府批準了倫敦弗朗西斯?克里克研究所 Kathy Niakan研究員對人類胚胎進行編輯的請求。這項研究成為世界首例獲國家監(jiān)管機構批準的人類胚胎編輯研究。
綜上所述,日漸成熟的基因編輯技術已經(jīng)成為了強力的生物、醫(yī)學工具,在癌癥、遺傳性疾病和逆轉錄病毒相關的傳染病等疾病的治療方面帶了巨大的突破,可以快速構建實驗新方法和動物模型,推動科研的發(fā)展,并在器官移植、生物制藥、農(nóng)業(yè)育種改良、滅絕物種復活和中藥現(xiàn)代化等方面具有廣闊的應用前景。其價值甚至引起了普通民眾的廣泛關注。人類暢想將來它不僅可去除遺傳缺陷、治療疾病,還可導入長壽、健康、強力的基因,甚至制造完美人類。當然,任何事物都是一把雙刃劍,在樂觀暢想基因編輯技術可使人類變得更加完美的同時,也不要忘記濫用技術可能帶來的潛在風險和生態(tài)災難。建立針對基因編輯技術安全有效的檢測手段,制定合理健全的法律道德制度,才能使這項技術更好地應用和造福人類。
4基因編輯在中藥發(fā)展中的潛在前景
如何讓傳統(tǒng)中藥跟上生命科學現(xiàn)代化的步伐,使傳統(tǒng)中醫(yī)藥走出國門,讓世界接受中草藥,是當今中醫(yī)藥工作者面臨的難題。長期以來,由于中醫(yī)藥與現(xiàn)代醫(yī)學、生命科學之間缺乏有效溝通的橋梁,有逐漸被邊緣化的趨勢。中藥基因組計劃將現(xiàn)代生命科學的最新技術和研究成果應用于中藥研究,有望徹底改變中藥研究手段和方法的落后局面,架起傳統(tǒng)中醫(yī)藥學與現(xiàn)代生命科學之間溝通的橋梁。中國中醫(yī)科學院中藥研究所陳士林團隊在著名植物學雜志《Molecular Plant》發(fā)表丹參全基因組[36],標志著作為常用中藥丹參的遺傳密碼被破譯,為揭示丹參主要藥理活性成分丹參酮和丹參酚酸生物合成及其調(diào)控的分子機制,促進丹參優(yōu)良品種選育提供了重要的遺傳背景基礎。該工作構建了世界上首個藥用植物基因組框架圖,標志著我國中藥研究進入了基因組學時代。目前已有多個中草藥如印度大麻、赤靈芝、牛耳草、鐵皮石斛等完成了基因組測序。中草藥基因組研究的飛速發(fā)展為基因編輯技術在中草藥研究中的應用帶來了極佳的時機和廣闊的前景。今后研究者們可以以丹參研究為模板,借鑒國外的植物基因組研究計劃的經(jīng)驗,對中草藥在結構基因組學、功能基因組學和生物信息學等方向展開研究。在此基礎上,利用基因編輯技術開展中藥藥效成分、藥材的生長及抗性相關基因的研究和改造工作,結合先進的育種方法,篩選出既保持“道地血統(tǒng)”,又優(yōu)質、高產(chǎn)、抗病的中藥材優(yōu)良品種。該工作既有利于實現(xiàn)中藥標準化生產(chǎn),使中藥質量可控,又有利于解決當前中藥材資源面臨的“斷糧”困境。
中藥藥材是現(xiàn)代藥物研發(fā)最大的遺傳信息資源之一。我國在該方面具有得天獨厚的優(yōu)勢?!侗静菥V目》中記載了1 892種藥用植物,1995年出版的《中華本草》收集了8 000多種藥用植物,而且其中不乏很多名貴,稀缺的藥材如人參,蟲草等。另有統(tǒng)計表明,我國中草藥已有12 000多種?;蚓庉嫾夹g的成熟也為開發(fā)這個藥物基因資源帶來了良機?;蚓庉嫾夹g在中藥資源的引入和應用,將會為解決這一問題帶來新的前景。通過基因編輯技術可以快速獲得藥材靶基因的突變或是導入異源基因,從而快速鑒定出該基因產(chǎn)物與藥理活性成分的相關性和重要性,發(fā)掘出新的或更高效的藥物相關基因,并可更清晰地闡明藥理活性成分生物合成及其調(diào)控的分子機制。
盡管將基因編碼技術引入中藥研究能為傳統(tǒng)中草藥帶來新發(fā)展和突破,但與當今各個領域廣泛應用基因編碼技術相比,其在中藥研究中的應用還處于起步階段,還有許多基礎工作有待完善。比如這一技術的應用必須以完善的中藥基因資源為基礎,如果沒有對中藥特別是具有豐富藥理藥效學和臨床應用價值的名貴中藥的基因資源的研究與開發(fā),基因技術體系的應用必然大打折扣。此外,也不能盲目的為了中藥的基因而基因,浪費大量的人力物力資源,應有的放矢的將目標集中在既具有重要臨床應用價值的名貴或瀕臨滅絕的中藥基因資源的研究與應用上,為中藥現(xiàn)代化搭建良好的基礎技術平臺,讓現(xiàn)代基因技術更好的為傳統(tǒng)中藥的發(fā)展服務。
[致x]李連達院士對本文的選題、框架設計等給予了諸多寶貴意見。
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生物化學是基礎醫(yī)學課程中重要的基礎課,但由于其知識的抽象性、寬泛性,一度成為讓學生頭疼的科目之一,“生化、生化,生而難化”也成為了大家對生物化學的印象。然而,隨著生物化學在現(xiàn)代醫(yī)學中越來越普遍的應用,其重要性也受到愈來愈多的關注。因此,必須要對傳統(tǒng)的生物化學授課方法進行全面改革,達到全面培養(yǎng)學生創(chuàng)新能力和綜合素質的目標。
1 生物化學與臨床學科之間的聯(lián)系
生物化學式研究生物體內(nèi)化學分子與化學反應的科學,它聯(lián)系著生物科學的許多分支,尤其是分子生物學、遺傳學、細胞生物學等,一度被公認為生命科學的基礎和前沿學科。生物化學作為一門重要的基礎課程,與臨床有著緊密的聯(lián)系。無論是從分子水平探討疾病的病因、闡明疾病發(fā)生發(fā)展的機制,還是對疾病做出診斷、尋求防治等,都能運用到生物化學的理論與技術。
2 目前??粕锘瘜W教學中存在的問題
2.1 生物化學教學不受重視。
以山東滕州棗莊科技職業(yè)學院為例,筆者發(fā)現(xiàn),生物化學被定義為考察課,課時相對較少。就開課時間來看,在三年制的教學計劃中,生物化學于第一年下學期開課,與生理學、病理學、病理學、病原生物與免疫學、局部解剖等學科基礎課以及計算機、英語等公共基礎課同期開設。加之計算機與英語統(tǒng)考,生物化學的課時被很無奈的削減(約54-60學時,其中還包括實驗課10-16學時)。由于課程的減少,教程的內(nèi)容難以完成,其效果可想而知,更不用談如何與臨床相聯(lián)系了。
2.2 教材更新速度較慢。
就目前山東滕州棗莊科技職業(yè)學院所采用的生物化學教材來看,其版本遠遠落后于本科教材,書中缺少很多相關內(nèi)容,如基因育基因組、朊病毒、癌基因與抑癌基因、腫瘤標志物、基因診斷與基因治療等等。教材的落后,導致學生所接觸的知識遠遠更不上實際,直接影響其與臨床學科的結合,影響其在臨床學科上的應用。
2.3 師資隊伍存在缺陷。
就山東滕州棗莊科技職業(yè)學院教授生物化學的教師隊伍來看,部分教師第一學歷并非出自醫(yī)學院校,而是來自綜合、師范等大學。這導致了教師隊伍中臨床醫(yī)學知識的缺乏,直接影響教師對教程中與臨床學科相關知識的講授,致使課程講授的不夠深入與透徹,更別談引入更多臨床應用的實例。因此,將生物化學的教學與臨床學科結合顯得步履維艱。
2.4 教學方法滯后。
由于生物化學理論比較抽象,代謝反應錯綜復雜且相互聯(lián)系,大多數(shù)同學在學習該課程的過程中采取死記硬背的方式來應付期末考試,并不能理解生物化學的意義。而在后面幾個學期學習診斷學、內(nèi)科學等學科時也沒有結合生物化學的理論知識來理解各種疾病與其癥狀及各項診斷指標的聯(lián)系,進入臨床實習后對生物化學的記憶更加所剩無幾,以至于只知道機械的看化驗單而不明白各檢驗指標的真正涵義。
3 改革策略
3.1 適當調(diào)整課程設置
學院應當重視起生物化學的教學地位,建立統(tǒng)一的大綱來對教學過程進行參照與約束,適當增大生物化學課程時間,調(diào)整其授課比例,對于學好、用好教材、完成生物化學教學目標起到保證性的作用。
3.2 快速更新教材
??粕锘瘜W教材版本少,更新慢。由于培養(yǎng)方向的不同,在章節(jié)方面,??平滩膽c本科有所區(qū)別,在保留傳統(tǒng)章節(jié)的基礎上,創(chuàng)立新的章節(jié)、補充新內(nèi)容。在教學內(nèi)容方面就是要增加新的知識點,如基因、基因組和人類基因組計劃,癌基因與抑癌基因、腫瘤標志物、基因診斷與基因治療等,以加強與臨床學科應用的聯(lián)系。
3.3 探索新的教學方法
在教學中將生物化學理論知識與臨床疾病相關知識相結合,達到融會貫通的效果。在講授生物化學知識時應密切聯(lián)系臨床,如在講解正常的糖代謝的同時要引導學生分析可能會出現(xiàn)的疾病狀態(tài)下的血糖變化,并針對各種不同病因提出可應用的生化指標及檢測的意義。通過這種與臨床病例相結合的教學方式,使學生牢牢掌握生物化學的核心內(nèi)容,并是枯燥的理論趣味化、實際化,使生物化學的基礎教學與臨床應用達到完美統(tǒng)一。
3.4 增強師資隊伍建設
生物化學教師平時備課時要注重病例的收集和疾病相關生化知識的積累,多與臨床醫(yī)師進行交流,不斷完善和更新自身知識結構,實現(xiàn)生化基礎與臨床知識的統(tǒng)一。另外,要充分利用來自醫(yī)學院校生物化學教師臨床知識豐富的特點,采取集體備課、研討教材、互通有無等方式達到優(yōu)勢互補。
4 小結
【關鍵詞】醫(yī)學分子生物學;教;課程設置
【中圖分類號】G424 【文獻標識碼】B 【文章編號】1006-1959(2009)10-0245-02
分子生物學是研究生物大分子的結構、功能及基因結構、表達與調(diào)控的科學,從分子水平探討生命現(xiàn)象的本質。醫(yī)學分子生物學是研究人體在正常和疾病狀態(tài)下生命活動及其規(guī)律,從分子水平開展人類疾病的預防、診斷和治療研究的一門科學。分子生物學已成為生命科學領域的重要基礎學科和前沿學科,廣泛滲透到醫(yī)學各學科領域,推動了醫(yī)學各學科的發(fā)展,使醫(yī)學科學從宏觀到微觀,從整體、細胞水平逐步進入了分子水平。醫(yī)學各專業(yè)的學生,有必要很好地學習有關分子生物學基礎理論,掌握必要的分子生物學實驗技術,了解當今分子生物學的研究進展。加強醫(yī)學分子生物學的教學,對培養(yǎng)具有廣博知識的復合型醫(yī)學高級人才具有及其重要的意義。近幾年來,我們對醫(yī)學分子生物學的教學進行了一些探索,取得較好的效果,積累了一些經(jīng)驗,特總結如下。
1 優(yōu)化課程設置
醫(yī)學教育的特點決定了醫(yī)學分子生物學不同于綜合性大學、農(nóng)林、師范院校的課程,醫(yī)學分子生物學偏重于與臨床的結合,但又不能忽略基礎知識的強化。正確處理分子生物學基礎和臨床應用的教學是解決醫(yī)學分子生物學教學的關鍵[1]。為了和生物化學教學內(nèi)容銜接,本課程不再講授基因信息傳遞,僅講授基因組的結構與功能,補充介紹網(wǎng)絡生物信息資源。著重介紹分子生物學的基本技術和新技術,如PCR和各種衍生的PCR技術、DNA序列測定、分子雜交、基因工程、基因芯片等,并兼顧介紹一些新的技術如RNAi等。聯(lián)系臨床介紹癌基因與抑癌基因、基因診斷與基因治療等。教師結合自身的科研經(jīng)歷展開授課,使課堂教學生動,給學生留下的印象深刻,讓學生學有所獲、學有所樂。
分子生物學是一門技術性很強的學科,如果只學習理論知識而不做實驗,往往如空中樓閣,不知所云[2]?在堅持醫(yī)學分子生物學理論教學的同時,通過開設相關實驗將理論教學與實踐操作有機結合,有助于加深對醫(yī)學分子生物學理論的理解,增強學生的動手能力,使學生在教學過程中體會到所學知識的應用價值,提高學生的學習興趣。我們在保證總課時36學時不變的情況下,調(diào)整了教學時數(shù)的分配,壓縮理論課時,增加實驗課時。將理論課由28學時減少到18學時,實驗課由8h增加到18學時。將教師的科研成果應用于實踐教學中,利用獲得的重組DNA克隆作為實驗材料,連續(xù)開設了質粒DNA的提取、感受態(tài)細胞的制備、質粒DNA的轉化和篩選、核酸的體外擴增、DNA的瓊脂糖凝膠電泳共六個實驗。在實驗中著重介紹每個技術的原理和應用,利用實驗步驟中間隔的等待時間講解一些背景知識和需要補充的理論知識,使實驗課內(nèi)容充實而飽滿。實驗完成后進行總結,分析成功的經(jīng)驗和存在的問題,找到實驗失敗的可能原因,有利于學生學習知識和積累經(jīng)驗,為今后的臨床及科研工作奠定基礎。
2 開展雙語教學
雙語教學是我國高等教育與國際接軌,迎接新世紀挑戰(zhàn)和教育改革發(fā)展的必然趨勢,也是當前教學改革的重點和熱點[3]。分子生物學進展極為迅速,其中大多數(shù)信息儲存在英文資料和文獻中,如果采用英文資料和課件進行講授,學生可更準確的把握其含義,并且可及時獲得分子生物學的最新進展,有助于高素質復合型高素質人才的培養(yǎng)。我們在參考相關專業(yè)教材的基礎上,選定了DNA序列測定、核酸分子雜交、PCR三章內(nèi)容進行了雙語教學,制作了中文和英文兩個課件,教師采用英文課件授課,學生利用中英文兩個課件進行復習,使學生既掌握了基本技術,又強化了自身的英文水平,教師的整體教學水平也得到了提高。
3 完善考核體系
考試是督促學生學習的一個重要手段,考試目的是檢測教育教學的效果。醫(yī)學分子生物學是一門專業(yè)限選課,由于課時少,內(nèi)容多,進展快,學生學習存在一定困難,有些學生并未引起足夠的重視。如果只注重閉卷考試,會導致學生死記教材,不注重查閱文獻和了解新進展,達不到創(chuàng)新性教育的目的。如果完全放棄閉卷考試,有些學生會放松對基本理論的學習,也達不到掌握基本知識和基本技能的效果[4]。為此,我們結合課程的教學特點,制訂了閉卷考試、實踐考核與撰寫綜述相結合的醫(yī)學分子生物學考核方案,規(guī)定閉卷考試成績總成績的70% ,文獻綜述占10% ,實驗成績占15%,平時成績占5%,將培養(yǎng)學生動手能力和思維能力全面地體現(xiàn)在考核成績中。并且在第一次開課就提出課程的考核方式和考核要求,讓學生在學習上引起足夠的重視。為防止學生直接下載或復印別人的同類文章,教師限定寫作內(nèi)容,稿件一律用手寫,并附5篇以上文獻(含英文文獻2篇以上),抄襲稿件計零分。這種綜合考核方式使學生既能掌握醫(yī)學分子生物學的知識體系,又能準確把握醫(yī)學分子生物學的脈絡和發(fā)展動態(tài),熟悉互聯(lián)網(wǎng)資源的查詢和利用,提高了學生的文獻查閱能力和英語水平,從而改變學生“讀死書、死讀書”的現(xiàn)狀。
經(jīng)過幾年的教學探索,我們積累了一些教學經(jīng)驗,初步建立了一套適于醫(yī)學生的醫(yī)學分子生物學教學體系,收到了較好的教學效果。當然,現(xiàn)有的教學中仍存在一些不足,需要進一步開展教學改革。我們將充分利用多媒體教學資源,擴大雙語教學內(nèi)容,不斷豐富和更新教學體系,創(chuàng)新教學手段,增加分子生物學軟件使用的培訓,適當介紹國內(nèi)外最新理論和技術,緊跟分子生物學不斷發(fā)展的步伐,以提高學生綜合素質為目的,逐步提高教學質量。
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1各種干細胞移植在心血管領域的研究
1.1胚胎干細胞(Embryonic Stem Cells,ESCs)1994年Soonpaa等[1]首次將小鼠的胚胎干細胞移植給成熟的心臟,發(fā)現(xiàn)移植的細胞不但能增生和存活,還與宿主之間形成了超微結構連接。但人胚胎細胞移植卻面臨著諸如胚胎細胞來源、道德倫理等問題。另外,胚胎干細胞的轉化條件尚不明了,在體外進行定向誘導還具有相當?shù)碾S意性。
1.2自體干細胞因無免疫排斥及倫理道德等優(yōu)點,而具有更為廣闊的應用前景。
1.2.1自體骨骼肌衛(wèi)星細胞骨骼肌衛(wèi)星細胞是成體骨骼肌中未分化的成肌細胞,參與骨骼肌損傷后形態(tài)和功能的恢復。Jain[2]研究證實移植組的心室重建得到緩解,心功能明顯改善。該細胞的優(yōu)點是形成的骨骼肌纖維在損傷區(qū)存活時間長,存活能力強。但這種細胞數(shù)量極少,不易獲得。另外,移植區(qū)與宿主心肌間的收縮常不一致,易引起心律失常。
1.2.2自體心臟干細胞近來有觀點認為在心臟中存在具有組織特異性的干細胞,稱為心臟干細胞。Sakai等[3]在動物實驗中證實自體心房肌細胞移植能改善受損心臟的功能。理論上說,該細胞的移植要優(yōu)于其他干細胞。但對于擴張型心肌病這種全心病變來說,只能考慮其他細胞的移植。
1.3成體干細胞(Adult stem cells,ASCs)上世紀90年代末以來,在Nature、Science、Cell均有報道ASC可分化為其他系列的細胞,即ASC具有“可塑性”或“橫向分化”潛能。2002年,Nature刊發(fā)了Verfaillie[4]教授小組的研究證實在成體的許多組織中余存著一種稀有數(shù)量的胚胎原始干細胞,其表達ESC的遺傳。所謂的ASC "可塑性"很可能是這些細胞所為,這提示ASC與ESC可能存在相似性和同源性。
1.3.1成人干細胞主要分為造血干細胞(Hematopoietic Stem Cells,HSCs)和間充質干細胞(Mesenchyrnal Stem Cells,MSCs)。此外,內(nèi)皮祖細胞(Endothelial Progenitor Cells, EPCs)等也屬于成體干細胞。
1.3.2造血干細胞2001年Orlic[5]等人在Nature上著文,稱造血干細胞直接注射心梗區(qū)可轉化為心肌細胞[5],結果引起了廣泛關注和研究。然而,2004年4月第428期Nature上同時發(fā)表了兩篇沒有重復出Orlic等人研究結果的論文報道。
1.3.3骨髓間充質干細胞Wakitani等[6]首先證實MSCs可分化為骨骼肌細胞。繼而人們想到將骨骼肌細胞分化為心肌細胞。1999年,Makino等人[7]首次報道在體外利用5-氮雜胞苷(5-aza)誘導MSCs分化為心肌細胞。Wang等[8]用同基因成年大鼠作為供體及受體模擬自體移植,并用DAPI染色標記。結果發(fā)現(xiàn),移植后各時相點均可見到DAPI陽性的存活細胞。然而,由于移植細胞在宿主身上的生存力差,長期效果不理想,也限制了其應用。鑒于此,Mangi等人[9]將小鼠MSCs進行基因改造,以病毒為載體,在該細胞中加入1個單肽Aktl,后者能阻斷細胞凋亡信號。將這些改造的干細胞注射到小鼠心臟的梗死部位后,Aktl被激活,并使干細胞長期存活。該研究還發(fā)現(xiàn),移植的效果呈劑量依賴性。
1.3.4血管內(nèi)皮祖細胞1997年Takayuki等[10]在Science上報道EPCs分離成功,并可用于體內(nèi)血管新生(Angiogenesis)。當時提出的EPCs被認為是假定的。近來隨著干細胞研究的深入,EPCs的存在已基本確認。Maeda等[11]將EPCs接種于移植的血管,結果發(fā)現(xiàn)這些細胞主要集中在血管外膜與內(nèi)膜表面,內(nèi)膜表面的移植祖細胞能很好地附著,在血管腔面發(fā)育形成內(nèi)皮細胞。該研究證實,EPCs具有促進血管新生的作用。
2臨床研究
干細胞移植為心血管疾病的治療開辟了一條新的途徑,已由動物實驗逐步應用于小樣本臨床治療。2001年9月Strauer[12]等在世界上進行了首例自體骨髓干細胞移植治療急性心梗的實驗,他們將該干細胞在PTCA中經(jīng)導管植入到梗死相關動脈,10周后,通過SPECT、超聲心動圖和核素心室造影顯示心肌梗死范圍減少,EF升高,舒張末壓降低。2003年,Perin等[13]報道借助NOGA系統(tǒng)經(jīng)心內(nèi)膜對14例因嚴重心肌缺血致心衰患者進行自體骨髓干細胞移植,術后2個月,核素顯像顯示移植組患者的左室功能有明顯改善;術后4個月,EF從20%上升到了29%,心臟收縮末期容積亦有顯著下降。
3展望
目前,細胞移植的研究僅限于單種細胞的移植,將2種或2種以上細胞聯(lián)合移植,以及和基因工程結合的研究還比較少。在心臟缺血時,不但有血供障礙,還有心肌損傷。我們在MSCs的基礎上聯(lián)合EPCs移植,一方面,植入的MSCs替代壞死心肌,改善心功能;另一方面,EPCs通過再血管化改善心肌血供。另外,還可以對干細胞進行基因修飾,然后再進行細胞移植。將基因治療和干細胞治療結合起來能夠大大提高控制細胞行為的能力。值得注意的是干細胞動員療法與干細胞移植相比具有無創(chuàng)傷、方法簡便、易開展的特點,臨床應用更具優(yōu)勢,近來研究發(fā)現(xiàn)粒細胞集落刺激因子具有心臟保護作用,能動員自體骨髓源干細胞遷移到心肌梗死部位,修復受損心臟。因此,利用細胞因子動員干細胞修復受損的心肌也有可能是干細胞治療的新策略。
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1作用溫和緩慢
中藥作用強度總體上是溫和緩慢的,中藥多矢量作用合力的微量累計是中藥治病的優(yōu)勢,也是其副作用較輕較少的原因。由于一首復方中各有效物質的濃度相對于單一的化學藥物來說較低,進入人體后就更低了。而中藥這種多種微量單體對眾多環(huán)節(jié)的微調(diào),使機體歸復于平衡是中藥治病的重要基礎。但新藥藥效標準評價對此是否定的,至少是不完整的。由于中藥的這些特點,我們唯一可做的就是盡可能采用現(xiàn)代科學技術,得出令人信服的科研結果,進而有權重新制定或完善新藥評價體系。
2現(xiàn)代生物技術與中藥作用機制的發(fā)現(xiàn)
隨著生命科學的發(fā)展,尤其是分子生物學在各學科的滲入,中醫(yī)藥實驗研究深入到了分子、基因、蛋白質組水平?,F(xiàn)代藥理研究表明,中藥作用原理與其生物活性成分調(diào)控基因表達有關[5]。研究發(fā)現(xiàn):對即刻早期基因(IEGs)的表達產(chǎn)物是細胞核內(nèi)的第三信使,在細胞間信號傳導過程中發(fā)揮重要的生理作用,共有c-fos、c-jun、c-myc、c-egr4個家族。c-jun基因表達基因轉錄生成mRNA,核糖體以mRNA為模板翻譯成c-jun蛋白,c-jun蛋白與同時表達的c-fos蛋白通過亮氨酸拉鏈區(qū)結合構成異構二聚體AP-1。AP-1通過與靶基因promoter區(qū)TGAC/GTCA序列結合,刺激靶基因表達[6]。任永欣等在國內(nèi)首次復制了硝酸甘油型試驗性偏頭痛動物模型,并用免疫組化方法觀察IEGs,c-fos,c-jun的表達,結果顯示:硝酸甘油型試驗性偏頭痛大鼠腦干、下丘腦c-fos、c-jun基因表達明顯增強,復方中藥頭風飲能顯著抑制偏頭痛大鼠腦干、下丘腦c-fos、c-jun基因的增強表達,與對照組比較差異有顯著性[7]。還有對神經(jīng)肽相關基因表達的影響,對凋亡相關基因的影響等等。人類基因組計劃(HGP)為某一疾病多基因表達調(diào)控的研究帶來了機會,通過HGP篩選和分離出每種疾病相關的致病基因,再以其作為藥物作用靶標研究中藥作用的分子機制,這可能是未來中藥藥理研究發(fā)展的趨勢之一。另外,基因芯片技術以其檢測迅速、分辨率高、檢出基因多而成為研究的先進方法之一。生物芯片主要包括基因芯片和多肽芯片。生物芯片技術是指將大量(每平方厘米點陣密度高于400)探針分子(DNA、RNA、多肽等)固定于支持物(膜、玻片、硅片等)上后與標記的樣品分子雜交,通過檢測每個探針分子的雜交信號強度,對樣品分子進行定性、定量和結構分析,其原理是利用生物大分子具有特異性互相識別能力,具快速、準確、自動化的優(yōu)點。利用基因芯片及mRNA差異顯示技術從分子水平探討中藥對疾病多基因治療作用機理,應成為今后研究的主要方向之一。
3蛋白質組學技術在新醫(yī)學研究中的應用
所謂蛋白質組是指一個細胞或一個組織基因組作表達的全部蛋白質,它具有整體性、動態(tài)性、系統(tǒng)性的特點。一方面,強調(diào)蛋白質組是對應于一個基因組的全部蛋白質所構成的整體;另一方面,明確提出蛋白質組還是一個在時間和空間上都動態(tài)變化的整體。蛋白質組的研究流程大體上分為分離、鑒定、分析3個步驟[8]。即先從組織或細胞中提取蛋白質,進行雙向電泳實現(xiàn)蛋白質的分離,含多種蛋白質的樣品展開成為有近千個蛋白質點的繁星圖;然后進行蛋白質樣品的顯色,對不同疾病、不同證候的蛋白質與對照樣品進行比較,尋找具有統(tǒng)計學意義和豐度差異的蛋白點;切下待分析的蛋白點,使用胰蛋白酶消化;接著對消化后得到的多肽片斷進行生物質譜分析測定,得到肽指紋圖譜;最后,通過在數(shù)據(jù)庫中檢索對蛋白質進行鑒定及功能分析,利用生物信息學的方法進行比較研究。蛋白質組學是從整體的角度,分析細胞內(nèi)動態(tài)變化著的蛋白質組成成分、表達水平和修飾狀態(tài),了解蛋白質之間相互作用和聯(lián)系,揭示蛋白質功能與細胞生命活動規(guī)律的科學。其不僅研究蛋白質的構象,更重要的是進一步闡明不同蛋白質、不同構象功能的表現(xiàn)。它不是單純對蛋白質的個體進行研究,而是對人體的整個蛋白質,即在蛋白質組的基礎上進行研究。蛋白質是機體生物功能最終的執(zhí)行分子,單個蛋白質的研究方式亦無法滿足后基因時代的要求。這是因為:生命現(xiàn)象的發(fā)生往往是多因素的,必然涉及多個蛋白質;多個蛋白質的參與是交織成網(wǎng)絡或平行發(fā)生,或呈級聯(lián)因果;執(zhí)行生理功能時的蛋白質表現(xiàn)是多樣的、動態(tài)的。因此要對生命的復雜活動有全面和深入的認識,必然要在整體、動態(tài)、網(wǎng)絡的水平上對蛋白質進行研究。
4蛋白質組學技術與中醫(yī)藥發(fā)展
中醫(yī)藥研究一直在謀求現(xiàn)代化發(fā)展,謀求為現(xiàn)代醫(yī)學有所闡釋而走向世界。但在此之前對單個分子的研究,很難反映中醫(yī)學的“整體觀念”和中藥作用“整體調(diào)節(jié)”的最基本特征。蛋白質組學研究時代的到來,為中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展帶來了新的契機。蛋白質組學的“整體、動態(tài)、網(wǎng)絡”的特點,與中醫(yī)理論“整體觀念”、“辨證施治”和中藥作用“整體調(diào)節(jié)”,“多層次、多靶點”調(diào)節(jié)等思想不謀而合。利用功能蛋白質組學技術和策略,分析中醫(yī)證候及經(jīng)中藥處理過的組織、細胞或體液表達的蛋白質組,并比較處理前后蛋白質表達差異、蛋白質功能結構及相互作用的變化,系統(tǒng)地對證候本質及中藥的多環(huán)節(jié)、多靶點調(diào)整作用機理進行研究,最終揭示證候的物質基礎及中藥作用和配伍規(guī)律。目前中醫(yī)藥蛋白質組學研究主要集中在中藥藥理研究,單味中藥或復方的藥效和藥理研究是中藥作用研究的核心。利用蛋白質組學技術研究治療前后的蛋白質譜變化,在整體水平上評價中藥藥效,揭示中藥作用的靶點、作用環(huán)節(jié)和作用過程,力求闡明中藥多靶點、多層次作用的分子機理。文獻檢索結果顯示,目前蛋白質組學研究主要涉及少量中藥復方和少量中藥單體的研究。如苗蘭等研究血府逐瘀湯對氣滯血瘀證模型大鼠血清蛋白質組表達的影響,經(jīng)雙向電泳分離血清總蛋白,并行圖像分析比較,發(fā)現(xiàn)血府逐瘀湯可影響7個蛋白點差異表達,分析可能與其作用機理相關[9]。申定珠等采用雙向凝膠電泳分離健胃愈瘍顆粒處理組和未處理組大鼠胃組織的總蛋白,結合圖像分析、質譜鑒定和數(shù)據(jù)庫搜查,發(fā)現(xiàn)處理組有12個蛋白質表達變化,且大多數(shù)蛋白質與潰瘍復發(fā)的形成、生長、凋亡及免疫相關[10]。運用蛋白質組學的思路和方法研究中醫(yī)藥理論,雖然已取得了一定的進展,但就實驗研究方面來看,依然存在明顯的不足。具體表現(xiàn)在:(1)相當部分研究僅停留在蛋白質成分分離和差異蛋白點顯示,未進一步采用質譜等鑒定分析,未對差異靶點之間進行生物學分析,或未對差異靶點的確切意義進行研究,使實驗結果的應用價值受到影響。(2)研究結果大多為平行發(fā)生或晚期事件,幾乎所有試驗報道均未證實蛋白質差異表達是必要的早期事件。(3)大多數(shù)研究缺乏必要的對照組。(4)對表達豐度較低的重要蛋白質組的研究不足,對亞細胞蛋白質組的研究未見報道。針對上述問題,我國藥學工作者應關注生物醫(yī)學研究進展,了解更多的生物技術;利用各種生物學數(shù)據(jù)庫,對差異蛋白質進行信息學分析,初步預測差異蛋白質之間的相互聯(lián)系及可能參與的信號通路網(wǎng)絡;在研究中加設對照組,盡可能排除藥物或方法造成的干擾;對重要的差異蛋白質作進一步深入的研究,適時引入基因過表達或RNA干擾,或反義核酸技術,以明確差異蛋白質在中藥調(diào)節(jié)中的必要作用;以蛋白質組學篩選研究為基礎,利用系統(tǒng)生物學的思路和技術,對具有確切作用的重要靶蛋白進行更深入的中藥相關研究;對于蛋白質檢測,可根據(jù)需要靈活采用不同分辨率的染色技術;由于中藥作用多靶點、多層次的特點,在中醫(yī)藥蛋白質組學研究中,極可能篩選出某些未能確知生物學功能的差異蛋白質,再根據(jù)研究結果提示,進行生物學作用鑒定,有可能成為中醫(yī)藥學對生命科學研究的重要貢獻。所以中醫(yī)藥蛋白質組學研究不僅在于發(fā)現(xiàn)種種現(xiàn)象,更應努力揭示現(xiàn)象的本質,重視持續(xù)的深入研究,由點到面,由面及點,交叉整合蛋白質組學、分子生物學和生物信息學技術,推動中醫(yī)藥研究的現(xiàn)代化。
5結論與展望
關鍵詞 干細胞治療 安全性 有效性 合法
干細胞是一類具有不同分化潛能,并在非分化狀態(tài)下自我更新的細胞。用于治療的干細胞主要包括成體干細胞、胚胎干細胞以及誘導的多能性干細胞。技術人員可以應用人自體或異體來源的干細胞經(jīng)體外分離、純化、培養(yǎng)、擴增、修飾、誘導分化、凍存及凍存后的復蘇等過程后回輸(或植入)人體,用于疾病預防和治療。干細胞預防和治療疾病的預期有望優(yōu)于現(xiàn)有的手段,尤其對于尚無有效干預措施的疾病,以及威脅生命和嚴重影響生存質量的重大疾病。正是由于這個重大發(fā)現(xiàn),在全世界掀起了一股干細胞研究熱潮,并迅速同時形成了新興的干細胞產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟。但是有一些干細胞企業(yè)為追求暴利而漠視科學發(fā)展的客觀規(guī)律以及社會倫理與法律問題。干細胞這項新技術是一柄雙刃劍,需要法律對其進行規(guī)制,才能切實保護患者的合法權益,真正造福人類。
1干細胞治療進展
干細胞能夠分化為不同類型的細胞,成為了人類的一種“修復元件”??梢酝ㄟ^注射干細胞制劑治療疾病,比方說修復受損的神經(jīng)系統(tǒng),恢復神經(jīng)系統(tǒng)的功能,治愈因神經(jīng)細胞受損導致的癱瘓。干細胞也可分化成新的胰腺細胞分泌胰島素治療糖尿病。從理論上講,干細胞有望治愈用傳統(tǒng)方法無法治愈的疾病,如糖尿病、老年癡呆癥、心臟衰竭、紅斑狼瘡、黃斑變性、類風濕、惡性腫瘤等疾病。因此干細胞似乎成了萬能細胞,受到醫(yī)療界高度重視。2009年1月23日,美國Geron公司胚胎干細胞用于脊髓損傷被FDA批準用于臨床試驗。(這是美國首次對胚胎干細胞臨床研究發(fā)放通行證)。2010年3月,美國Advanced Cell Technology公司宣布用于治療少年型黃斑變性的胚胎干細胞療法“MA09-hRPE”被FDA批準臨床試驗,獲得了FDA授予孤兒藥地位(FDA批準的第二項干細胞療法)。2011年1月3日,美國Advanced Cell Technology公司宣布用于治療老年黃斑變性的胚胎干細胞療法被FDA批準臨床試驗。2010年6月,Osiris Therapeutics公司的Prochymal 在三種疾?。肆_恩病、預防骨關節(jié)炎、心肌損傷)治療中完成三期臨床試驗。2010年11月,美國國立衛(wèi)生院批復有11種干細胞進入FDA審批程序,并稱近期還有30種干細胞陸續(xù)進入FDA審批。中國在這方面比較落后,目前還從沒有批準過胚胎干細胞制劑治療技術的臨床試驗。
干細胞治療技術的美好愿景刺激了干細胞產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。我國雖然尚未批準胚胎干細胞技術的臨床試驗,但是從事干細胞技術研究開發(fā)的科研機構或者企業(yè)也為數(shù)不少,遍布全國各地。有北京經(jīng)開區(qū)的漢氏聯(lián)合干細胞研究院、上海浦東新區(qū)的上海科醫(yī)聯(lián)創(chuàng)生物科技有限公司、上海市長寧區(qū)的臻景醫(yī)療公司、廣州市生物島的軍事醫(yī)學科學院華南干細胞與再生醫(yī)學研究中心、深圳市高新科技產(chǎn)業(yè)園的深圳市北科生物科技有限公司、中國濱海新區(qū)華夏干細胞聯(lián)盟、濱海新區(qū)科技園的昂賽細胞基因工程公司、無錫的奧斯達干細胞有限公司、湖南長沙市麓谷高新區(qū)人類干細胞國家工程研究中心等。并且也有上市公司,如滬深兩市中唯一家以干細胞產(chǎn)業(yè)為主營業(yè)務的上市公司中源協(xié)和干細胞生物工程股份公司(股票代碼:600645)等。這些企業(yè)形成了一個新興的干細胞行業(yè)。
2干細胞治療的安全性、有效性
干細胞制劑無論是作為藥品還是醫(yī)療技術在應用于人體臨床治療之前,都必須證明它的安全性、有效性。而這個驗證過程漫長而復雜,首先是動物實驗、其次是第三方檢測、然后再是臨床試驗。只有證明安全性與有效性后才能應用于臨床治療。
英國《每日郵報》報道了一個典型案例,前奧運選手馬克斯?特魯克斯患帕金森癥而接受了干細胞療法。醫(yī)生從胎兒那里提取干細胞,通過體外培養(yǎng),擴增、純化等技術制成干細胞制劑注入患者大腦中。但是當這名病人去世后,病理學家們發(fā)現(xiàn),這名病人的軟骨、皮膚和骨頭都堆積在大腦內(nèi)。也就是說注入的干細胞并沒有按照醫(yī)生的意圖分化成神經(jīng)細胞,而是分化成了軟骨、骨頭與皮膚。當然,隨著技術的發(fā)展,像上述案例中干細胞不定向分化的情況已經(jīng)非常少了。但是很多學者還是總結出干細胞治療的隱患或者存疑的地方。
2.1免疫排異反應
我們身體的免疫系統(tǒng)天天在擊退微生物、病毒、有毒物質的入侵。我們的免疫系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)這些異物(包括移植手術),便會發(fā)動一系列有害的攻擊行為。這就是我們常說的免疫排斥反應。如果干細胞來自于異體,那就有可能引起免疫排斥反應。當然科學家可以通過對干細胞加工的方法,使它能夠應對免疫系統(tǒng),但這需要臨床驗證。
2.2非定向分化
上述英國《每日郵報》報道的前奧運選手馬克斯?特魯克斯案例,就是一個干細胞非定向分化的案例。當醫(yī)生期望注入的干細胞能夠分化成為健康的神經(jīng)細胞,修復神經(jīng)系統(tǒng),但是它卻分化成了骨頭與皮膚。如何準確地誘導干細胞分化成為制定的細胞,這還需要進一步研究。
2.3細胞生長失控與致瘤性
正常的細胞生長是受控的,能夠精確自我復制、恰當時候停止再生、專門分工、各司其職、受損自我凋亡。但是異體注入的干細胞制劑卻不一定遵循這套嚴格的程序,不一定定向分化、不一定停止再生。當注入的細胞生長失控,就有可能生成腫瘤,比如iPS細胞致瘤性高達20%。
2.4作用機理不太清楚
注入的干細胞制劑如何分化、如何分工、如何修復系統(tǒng)功能,以及異體干細胞存活多久,如何在體內(nèi)發(fā)揮作用。對于這些問題還不是完全清楚。
從這些問題可以看出,干細胞治療目前存在安全性問題。
另外在治療腫瘤方面,根據(jù)國內(nèi)所報道的案例,療效不明顯。2014年3月15日與3月16日在中央電視臺“焦點訪談” 連續(xù)兩天報道浙江無錫“非法干細胞治療事件”:
2011年,58歲的昆明市民張某被查出身患結腸癌晚期,一個偶然的機會,他們聽說,無錫某干細胞公司擁有一種非常有效的治療方法,說人體干細胞很有用,能治好。并且其董事長跟他們說:“一般的癌癥根本沒有問題。你這個病很有希望的,如果不來我們這里的就沒救了?!币粋€劑量12萬元,一個療程36萬元。張某的女兒湊足了36萬元,匯到該公司的賬戶上。第二天該公司把張某夫婦帶到了無錫市濱湖區(qū)的一家社區(qū)醫(yī)院為張某進行胚胎干細胞治療。2012年3月30日,公司人員告訴他們,治療結束,效果很好,可以回家休養(yǎng)。而當一家人回到昆明,張某的病情遠沒有像該公司所承諾的那樣,向好的方向發(fā)展,能再活十年,而是急轉直下,短短三個月便不幸去世。
干細胞治療技術還處于初級階段,還有許多難題有待克服。國家應該大力支持干細胞研究,以盡快解決技術難題,攻克科技難關。但是當技術還不成熟,在安全性、有效性沒有確證的時候,為了贏利而匆促應用于臨床,這就嚴重侵犯了患者的利益。
3干細胞治療的管理
2010年10月7日Nature雜志發(fā)文“Stem-cell laws in China fall short”,從立法層面指出中國規(guī)制干細胞技術的相關法律欠缺,現(xiàn)有法律缺乏可操作性。認為準確清晰、詳細的配套規(guī)則是必須的。
2012年4月11日Nature雜志繼續(xù)發(fā)文“China’s stem-cell rules go unheeded”從執(zhí)法層面指出中國干細胞規(guī)制收效甚微。未按要求申報批準、未經(jīng)臨床試驗驗證的干細胞治療方法廣泛應用于臨床治療,并且禁而不止。
目前中國干細胞市場被公認存在以下弊?。?/p>
3.1未經(jīng)臨床試驗驗證、未按要求申報批準而擅自應用于臨床
2009年3月2日衛(wèi)生部組織制定了《醫(yī)療技術臨床應用管理辦法》,并于5月1日施行。干細胞治療技術被列入第3類醫(yī)療技術,由衛(wèi)生部負責技術審定和臨床應用管理。2013年,我國出臺了《干細胞臨床試驗研究管理辦法(試行)》,第四條規(guī)定:“干細胞臨床試驗研究必須在干細胞臨床研究基地進行,干細胞臨床試驗研究基地由衛(wèi)生部與國家藥品食品監(jiān)督管理局組織進行遴選和確定?!币簿褪钦f所有干細胞制劑只要應用于臨床治療,就必須經(jīng)過臨床試驗驗證??墒聦嵣现袊S多醫(yī)院都在開展干細胞治療技術,卻未經(jīng)臨床試驗。
3.2虛假宣傳擴大療效
如同2014年3月15日報道的無錫某干細胞公司聲稱她們的技術治療一般的惡性腫瘤根本沒有問題,最壞也能帶著癌癥生存10年。干細胞技術治療惡性腫瘤,如果未經(jīng)臨床試驗驗證,意味著其安全性、有效性尚未確定。很多企業(yè)不顧這些基本事實,為追求高額利潤,任意擴大其療效以吸引患者。
3.3無收費依據(jù)與收費標準擅收高價
干細胞臨床試驗研究管理辦法(試行)第七條規(guī)定:開展干細胞臨床試驗研究,不得向受試者收取費用,不得市場化運作,不得干細胞治療廣告。這說明干細胞技術的臨床試驗不能收取費用。另外中國還沒有批準干細胞的臨床試驗,所以未經(jīng)臨床試驗的干細胞技術沒有資格應用于臨床治療,更談不上收取費用了。即使干細胞治療技術獲得了臨床批文,準許應用于臨床,也不能擅自收取高價,而是必須作為三類醫(yī)療技術通過另外的程序申請物價批文。
3.4干細胞供體未經(jīng)檢測
我國《人體細胞治療研究和制劑質量控制技術指導原則》強調(diào)無論細胞來源如何,都必須提供細胞的組織來源及細胞類別的確證資料,其中包括形態(tài)生化或表面標志等。
若體細胞來源于同種異體,需說明供體的年齡、性別,供體必須符合國家對獻血員的要求,并提供測試的方法及符合條件的依據(jù)。供體必須經(jīng)過檢驗證明HBV抗原、抗HCV、抗HIV-1/2、梅毒抗體、細菌、霉菌均為陰性,必要時需說明供體的既往病史、家族史等臨床資料。對于那些需通過激活體內(nèi)免疫功能發(fā)揮作用或需體細胞在體內(nèi)長期存活的體細胞治療項目,除ABO血型外,還必須對供體做HLA-I類和II類分型檢查,并證明與受體(病人)相匹配,同時提供檢測方法和依據(jù)。若體細胞來源于動物,必須提供動物的來源,遺傳背景,健康證明(如重要病原體,包括人畜共患疾病的病原體),飼養(yǎng)條件,應用此類體細胞的必要性和安全性。
可是許多開展干細胞治療的醫(yī)院與企業(yè)為節(jié)約成本,利益最大化,忽略或簡化了對細胞與供體的檢測。
3.5干細胞來源的倫理問題
事實上目前許多醫(yī)院或者企業(yè)的干細胞來源是流產(chǎn)的嬰兒或者剩余胚胎。通過私下與婦產(chǎn)科達成某項協(xié)議而獲得胚胎干細胞。這種獲得方式即使作為科研也必須通過倫理審查。如果流產(chǎn)胎兒是成為企業(yè)營利的“原材料”,幾乎不可能會通過倫理審查。
【關鍵詞】 急性梗死
關鍵詞: 心肌/細胞學;急性梗死;新生血管化,病理性;移植
摘 要:目的 觀察移植的胚胎心肌細胞在成年兔急性梗死心肌組織內(nèi)的生長發(fā)育過程和其與宿主心肌組織的相互作用,以及對周圍心肌血運的影響. 方法 將培養(yǎng)的兔胚胎心肌細胞,經(jīng)DAPI標記后,直接注入成年兔的急性梗死心肌組織內(nèi)(通過結扎左冠狀動脈前降支建立急性心肌梗死模型),同時設立對照組.4wk后處死動物,進行組織學和電鏡觀察. 結果 4wk后的心肌組織切片中,移植心肌細胞與宿主心肌細胞之間形成閏盤,其排列方向與宿主心肌肌纖維方向平行,同時,與對照組相比,心肌梗死區(qū)面積減少及移植區(qū)血管密度增高(P
Keywords:myocardium/cytology;myocardial infarction;neovascularization,pathologic;transplantation
Abstract:AIM To investigate the interaction between im-planted fetal cardiomyocytes and host cardiomyocytes and the angiogenesis effects of implanted fetal cardiomyocytes on the host cardiomyocytes and the development of fetal cardiomy-ocytes implanted into adult acute infarction myocardium.METHODS After labelled with DAPI,cultured rabbit fetal cardiomyocytes were implanted into the actue myocardial in-farction site of adult rabbits via direct injection.The myocar-dial infarction model was established by ligating the left ante-rior decending artery.Specimens were harvested4weeks af-ter the cell implantation.The results were observed by histo-logic methods and electronic microscopy examination.RESULTS Intercalated disks were observed between the graft-ed and the host cardiomyocytes,with the implanted car-diomyocytes parallel to the host myocardium in an aligning di-rection.The area of myocardial infaction decreased and the vascular density of implantationsites increased compared with those of the control groups(P
0 引言
將體外培養(yǎng)的兔胚胎心肌細胞直接移植到成年兔急性梗死區(qū)的心肌內(nèi),分別觀察研究其在受體心肌組織內(nèi)的生長發(fā)育和與宿主心肌細胞的相互作用情況,以及對周圍心肌血運的影響,驗證細胞移植治療缺血性心臟病的作用,為臨床上應用細胞移植治療缺血性心臟病提供實驗基礎.
1 材料和方法
1.1 材料 成年健康兔18只,雌雄不限,體質量2.0~2.5kg,購自第四軍醫(yī)大學實驗動物中心.小牛血清(Hyclone),DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone),胰蛋白酶(Gibco),Hanks平衡鹽液(Gibco),4’,6-二脒基-2-苯茚二酮(Sigma),第Ⅷ因子抗體(Sigma).
1.2 方法
1.2.1 胚胎心肌細胞的分離和培養(yǎng)[1-3] 取胚胎兔浸入950mL L-1 乙醇30s,取出心臟,分離心室,用培養(yǎng)液洗滌2次,將心室肌肉剪碎,加入0.25g L-1 胰蛋白酶消化30min,反復吹打,室溫下540g離心5min,收集消化的細胞,用含100mL L-1 小牛血清的DMEM培養(yǎng)液,置37℃含50mL L-1 CO2 孵箱中培養(yǎng)2h,然后將培養(yǎng)瓶翻置,將未貼壁的心肌細胞繼續(xù)培養(yǎng),2d換液1次.
1.2.2 胚胎心肌細胞標記 心肌細胞培養(yǎng)第4日,用0.2g L-1 4’,6-二脒基-2-苯茚二酮(DAPI)熒光標記細胞4h以上,用Hanks平衡鹽液漂洗6次以去除未結合的DAPI.0.25g L-1 胰蛋白酶消化后,離心收集細胞,加入DMEM培養(yǎng)液制成細胞懸液(細胞密度為104 μL-1 ),以備用于細胞移植.
1.2.3 兔急性心肌梗死模型的建立及細胞移植 將健康兔隨機分成胚胎心肌細胞移植治療組及對照組.用戊巴比妥鈉30mg kg-1 iv,氯胺酮10mg kg-1 im麻醉.左前外側切口,切斷第3,4肋骨進胸,顯露左冠狀動脈前降支,距離其根部大約1.0~1.5cm,用4-0普理林線直接縫扎,見其遠端供血區(qū)心肌組織顏色發(fā)暗,急性心肌梗死模型即告成立.1h后,用微量注射器向梗死區(qū)心肌組織內(nèi)注射移植用心肌細胞懸液,3點注射,每處50μL,對照組以相同量的DMEM細胞培養(yǎng)液注射.常規(guī)關胸,抗感染治療,每日給予環(huán)孢素A10mg kg-1 飼養(yǎng).手術中未發(fā)生氣胸及惡性心律失常.
1.2.4 結果觀察 心肌細胞移植術前,動態(tài)觀察培養(yǎng)的心肌細胞,熒光顯微鏡觀察用DAPI標記好的心肌細胞.心肌細胞移植術后4wk,用過量麻醉劑處死動物,取移植區(qū)及周圍心肌組織,統(tǒng)計梗死區(qū)面積,制作標本,進行透射電鏡及冰凍切片熒光顯微鏡觀察.同時,對梗死區(qū)石蠟切片(治療組及對照組動物取樣2個/只,共取樣本36個),用第Ⅷ因子免疫組織化學染色梗死區(qū)血管,光學顯微鏡200倍視野下血管計數(shù),統(tǒng)計移植區(qū)血管密度.
統(tǒng)計學處理:數(shù)據(jù)采用SPLM軟件包,運行單因素分析,結果以x ±s表示.
2 結果
2.1 胚胎心肌細胞的特性 對用酶消化法獲得的胚胎心肌細胞進行培養(yǎng),4h后細胞貼壁,24h后可見細胞搏動.培養(yǎng)的心肌細胞成梭形或紡棰形,細胞核大,胞質豐富(Fig1).
2.2 胚胎心肌細胞移植后心肌再生 治療組心肌梗死區(qū)面積(0.49±0.13)cm2 明顯少于對照組(0.96±0.18)cm2 (P
2.3 血管再生 對缺血區(qū)石蠟切片用第Ⅷ因子行免疫組織化學染色,顯微鏡200倍視野下血管計數(shù),移植區(qū)血管密度(8.0±2.6),高于對照組(1.6±1.4),(P
圖1 -圖4 略
3 討論
正在探索的細胞移植術,為病損性心臟的細胞重構及衰竭心臟的功能恢復,提供了一種全新的治療策略,為缺血性心臟病的治療帶來了光明的前景.心肌細胞移植可以發(fā)揮三大功能:穩(wěn)定病損性心臟結構,防止組織重構;改善局部或整體心臟的收縮功能;可以充當分子載體,進行基因治療[4] .
本實驗中,將分離培養(yǎng)的兔胚胎心肌細胞移植到成年兔梗死心肌區(qū)域后,心肌梗死區(qū)面積明顯減少,冰凍切片熒光檢測顯示,心肌標本中有帶熒光的細胞核和肌纖維,說明移植的心肌細胞存活.同時,它們排列方向基本一致,顯微光鏡下與宿主心肌細胞肌纖維方向平行,這可能與心肌內(nèi)微環(huán)境及宿主心肌細胞收縮時對其產(chǎn)生的機械張力有關[5] .細胞間形成閏盤是移植的胚胎心肌細胞的結構基礎,表明胚胎心肌細胞移植后與宿主心肌細胞融合修復心肌損傷,直接參與了心肌收縮活動.在修復損傷的同時,胚胎心肌細胞還可促進周圍血管再生,這可能是由于胚胎心肌細胞在生長發(fā)育過程中分泌一些血管生成因子、細胞生長因子,如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、堿性纖微母細胞生長因子(bFGF)等[6,7] .實驗中我們采用了一種新的細胞標記方法,即利用DAPI標記的方法[8] ,相對于以前用H3標記、酶標記的方法,其具有以下特點:①DAPI對DNA有高 度親和力,是標記細胞核的熒光染色,具備標記高效性(100%).②細胞標記的表達不會因細胞分化狀況改變.③一旦被標記后,只由被標記的細胞保存,不會有傳遞.④對活細胞沒有毒性,不會改變細胞活性及細胞器的超微結構.
胚胎心肌細胞移植到成年兔梗死心肌區(qū)域后,其細胞膜上離子通道的變化,整塊心肌的反應性及全心功能的改善尚待進一步研究.另外,胚胎心肌細胞的異體移植,隨著時間的延長,受體內(nèi)終將發(fā)生難以避免的排異反應,進一步尋找自身來源的細胞(如骨髓基質細胞)進行細胞移植的研究正在實驗中.
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