基因治療的基本策略精選(九篇)

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第1篇：基因治療的基本策略范文

【關(guān)鍵詞】超聲微泡；雙自殺基因慢病毒載體；基因治療

【中圖分類(lèi)號(hào)】R341 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1004-7484（2012）13-0013-02

目前，基因治療已成為一種全新的腫瘤治療模式，其中自殺基因治療是一種頗具臨床應(yīng)用潛力的治療策略， 但是由于治療的靶向性成為關(guān)系到治療安全性的瓶頸問(wèn)題。近年來(lái)研究表明[1-5]，超聲微泡造影劑有望成為一種新型的體內(nèi)靶向給藥的載體系統(tǒng)。本研究旨在構(gòu)建超聲微泡包裹的特異性雙自殺基因慢病毒載體，為臨床實(shí)時(shí)可視狀態(tài)進(jìn)行超聲定位控釋和載質(zhì)粒微泡基因治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 雙自殺基因慢病毒載體pLenti6-EGFP-KDRP-CD/TK的構(gòu)建與包裝

1.1.1目的基因的擴(kuò)增與TA克隆

提取正常人外周血gDNA，并通過(guò)PCR方法擴(kuò)增出KDRP、CD、TK基因；回收

PCR產(chǎn)物并分別將其鏈接到pMD18-T載體上，構(gòu)成重組T質(zhì)粒；抽提質(zhì)粒，并對(duì)各重組T質(zhì)粒的酶切鑒定及測(cè)序；

1.1.2 慢病毒載體構(gòu)建與包裝鑒定

將經(jīng)測(cè)序證實(shí)的T-KDRP、T-CD、T-TK三種質(zhì)粒上的KDRP、CD、TK元件通過(guò)特定的限制性內(nèi)切酶酶切后，依次連接到經(jīng)相應(yīng)酶酶切的pLenti6-EGFP載體上，經(jīng)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，24h后通過(guò)熒光顯微鏡即可見(jiàn)GFP熒光表達(dá)，72h后收集上清，0.45um濾器過(guò)濾，25000rpm離心90min，沉淀溶于Hanks溶液，-80℃貯存?zhèn)溆?。將梯度稀釋的病毒液，加?93T細(xì)胞中，72h后置于熒光顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)情況，計(jì)數(shù)發(fā)熒光細(xì)胞數(shù)目，根據(jù)病毒用量和稀釋度計(jì)算滴度。按公式計(jì)算病毒滴度：

病毒滴度=GFP細(xì)胞陽(yáng)性數(shù)×病毒上清稀釋倍數(shù)/0. 4m1（pfu/ml）。

1.2 載藥粒微泡的制備于鑒定

1.2.1載藥粒微泡的制備

聲諾維sonovue為磷脂包裹的六氟化硫（SF6），按使用說(shuō)明注入生理鹽水5 ml震蕩形成微泡混懸液。取50ul微泡懸液于1.5mlEP管內(nèi)，再滴加入100MOI病毒載量的病毒上清液，輕輕混勻后室溫孵育20 min。

1.2.2載藥粒微泡的鑒定方法。

采用Malvern激光測(cè)量?jī)x檢測(cè)載藥微泡的粒徑大小，光學(xué)顯微鏡觀察其外觀，采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）測(cè)定載藥微泡的包封率和載藥量。

（1）粒徑大小比較

載質(zhì)粒微泡為白色混懸液，PBS（Phosphate buffered saline 磷酸鹽緩沖生理鹽水）沖洗，靜置后分三層，上層、中間層為微泡，下層為PBS液。去除上層及下層液，取中層液，測(cè)定其粒徑大小，鏡下比較觀察載藥微泡與空白微泡外觀。

（2）包封率的測(cè)定

將制備好的含有慢病毒載體的微泡溶液中加入5%乙醇1 mL混勻，6℃，16000 rpm高速離心20min，去上層微泡，取下層液體，加5%乙醇0.5 mL稀釋沖洗，再加入適量乙醚，漩渦振搖，6000 rpm離心15 min，取乙醚層，50℃水浴揮干后，加0.5 mL甲醇溶解作為樣液，進(jìn)樣量10μL。采用RP-HPLC測(cè)定雙自殺基因慢病毒載體pLenti6-EGFP-KDRP-CD/TK的包封率，按下式計(jì)算包封率：

包封率（%）=[（投入藥量―游離藥量）/投入藥量]×100%

（3）載藥量的測(cè)定

以下式計(jì)算載藥量：

載藥量%=（Wt～Wi）/Wc×100%

其中Wt為脂質(zhì)微泡溶液中藥物總含量，Wi為游離藥物量，Wc為磷脂用量。

（4）穩(wěn)定性測(cè)定

4℃冰箱貯存，對(duì)短期內(nèi)的載藥微泡溶液的質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

取少量載藥微泡混懸液分別于1d、2d、5d、8d、10 d經(jīng)光學(xué)顯微鏡（×400）進(jìn)行觀察其形態(tài)變化。第10 d的取該樣品由Malvern粒徑測(cè)量?jī)x檢測(cè)粒徑。4℃冰箱貯存10 d后，RP-HPLC測(cè)定載藥微泡溶液的包封率。

2 結(jié)果

2.1 病毒滴度檢測(cè)結(jié)果：

經(jīng)熒光顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)情況，計(jì)數(shù)發(fā)熒光細(xì)胞數(shù)目，根據(jù)病毒用量和稀釋度，獲得病毒滴度為（3.5×1012pfu/L）的雙自殺基因慢病毒載體pLenti6-EGFP-KDRP-CD/TK。

2.2 載藥微泡質(zhì)量鑒定：

2.2.1包裹有pLenti6-EGFP-KDRP-CD/TK的聲諾維微泡與空白聲諾維微泡粒徑的對(duì)比觀察：

載質(zhì)粒微泡呈乳白色混懸液，用磷酸鹽緩沖生理鹽水（Phosphate buffered saline PBS）沖洗，靜置后分三層，上層、中間層為微泡，下層為PBS液。

鏡下比較觀察載質(zhì)粒微泡（圖A）與空白微泡（圖B）的形態(tài)，其形態(tài)相近，為近似的圓形微泡。其粒徑范圍92%在2～5μm之間，平均粒徑約2.90μm（圖A），粒徑大小均相似。

2.2.2 包封率和載藥量測(cè)定結(jié)果

采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）測(cè)定載藥微泡的包封率和載藥量，

得到結(jié)果：

包封率為90.6±3.1%。載藥量為29.2±0.9%。

2.2.3 穩(wěn)定性測(cè)定：

4℃冰箱貯存10 d后，可見(jiàn)仍為乳白色混懸液，光鏡下觀察，微泡粒徑大小未見(jiàn)明顯變化，微泡形態(tài)好，大小均勻，相互之間無(wú)明顯聚集現(xiàn)象，分層情況基本同前，樣品經(jīng)光鏡下觀察及Malvern測(cè)量?jī)x檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與制備初始相比，平均粒徑大小約3.08μm），未見(jiàn)明顯變化；RP-HPLC測(cè)得包封率：86.1±2.8%，沒(méi)有出現(xiàn)明顯藥物滲漏。

3 討論

基因治療已成為一種全新的腫瘤治療模式，其中自殺基因治療是近年來(lái)新興的腫瘤基因治療的研究熱點(diǎn)。自殺基因療法是利用基因工程技術(shù)將自殺基因轉(zhuǎn)入腫瘤細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，注入體內(nèi)的無(wú)毒或低毒的前藥在表達(dá)的特異性酶作用下轉(zhuǎn)化成毒性產(chǎn)物，該產(chǎn)物可作為DNA合成的核苷替代物摻入到DNA中，干擾細(xì)胞DNA的合成，從而引起腫瘤細(xì)胞的死亡[6]。

本研究所采用的克隆方法并不是將PCR產(chǎn)物直接與表達(dá)載體相連接，而是先將PCR產(chǎn)物TA克隆，構(gòu)建成重組T質(zhì)粒后再將目的基因與表達(dá)載體酶切連接，主要是考慮到：PCR產(chǎn)物直接進(jìn)表達(dá)載體成功率不高；而先進(jìn)T載體，再酶切連接表達(dá)載體，可減少堿基錯(cuò)配，提高成功率。目前己發(fā)現(xiàn)的自殺基因體系已有十多種，本實(shí)驗(yàn)選擇胞嚓陡脫氨基酶基因（CD）和單純疤疹病毒胸普激酶基因 （HsV-TK簡(jiǎn)稱TK）來(lái)構(gòu)建雙自殺基因質(zhì)粒，是因?yàn)檠芯勘砻鱗7]，二者作用機(jī)制具有很強(qiáng)的互補(bǔ)性，將其連接在一起，構(gòu)成融合基因，使兩個(gè)自殺基因體系協(xié)同作用，能顯著增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。同時(shí)選用腫瘤特異性啟動(dòng)子KDRP，突破對(duì)腫瘤細(xì)胞類(lèi)型的依賴性，擴(kuò)大腫瘤基因治療譜。運(yùn)用增強(qiáng)型GFP綠色熒光蛋白作為報(bào)告基因，可直觀的檢測(cè)目的基因的檢測(cè)和計(jì)算病毒滴度。而慢病毒載體最大的特點(diǎn)是可以感染分裂期及非分裂期細(xì)胞，容納外源性目的基因的片段大，可以在體內(nèi)長(zhǎng)期地表達(dá)，不易誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)，安全性較好，可在更多范圍的宿主細(xì)胞內(nèi)生成高滴度的病毒，己成為當(dāng)前基因治療中載體研究的熱點(diǎn)。

超聲微泡造影劑聲諾維可作為一種新型基因載體。在一定劑量超聲波的輻照下，利用微泡在超聲介導(dǎo)下的空化效應(yīng)介導(dǎo)目的基因的靶向釋放和導(dǎo)入。國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)空化效應(yīng)是超聲介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的主要機(jī)制，微泡造影劑作為外源性空化核被引入體內(nèi)后大大增加了單位體積內(nèi)空化核的數(shù)量，降低超聲波的空化閉值，增強(qiáng)空化效應(yīng)，從而提高基因轉(zhuǎn)染效率[3-4]，尤其在抗腫瘤治療、溶栓治療等方面具有潛在的重要應(yīng)用價(jià)值。經(jīng)靜脈注入載藥微泡后，用超聲輻照特定部位，含氣體的超聲造影劑在超聲波作用下會(huì)不斷地產(chǎn)生非對(duì)稱性收縮和膨脹，當(dāng)聲能達(dá)到一定強(qiáng)度時(shí)，微泡破裂藥物被釋放到超聲所輻照的局部組織中。在這一過(guò)程中，微泡作為空化核增強(qiáng)空化效應(yīng)，依靠能量輻射作用，使微泡破壞后釋放的藥物能夠進(jìn)入血管壁甚至組織間隙，從而發(fā)揮定位靶向治療作用[2]。

而載藥微泡的外觀、粒徑大小、包封率、載藥量等是衡量載藥脂質(zhì)微泡質(zhì)量的最重要指標(biāo)。我們制作的載雙自殺基因慢病毒載體微泡乳化良好，大小均勻，粒徑范圍92%在2-5μm，與空白微泡相似。微泡內(nèi)藥物的包封率為90.6±3.1%，載藥量為29.2±0.9%，均達(dá)到較理想的水平。此外穩(wěn)定性也是衡量載藥脂質(zhì)微泡特性的主要指標(biāo)之一，它能反映脂質(zhì)微泡溶液包封率隨時(shí)間變化的情況。脂質(zhì)微泡作為藥物載體穩(wěn)定性是指被包裹藥物在脂質(zhì)微泡中的滯留性。經(jīng)由本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，我們制作的載藥微泡同時(shí)也具有較高的穩(wěn)定性。

本研究聯(lián)合了雙自殺基因的殺傷效應(yīng)、KDR啟動(dòng)子的腫瘤特異性、慢病毒載體的高載性和超聲微泡靶向的可控釋性等多種技術(shù)優(yōu)點(diǎn)，制備出了較為理想的載有靶向基因藥物的微泡，期望為進(jìn)一步臨床實(shí)施可視狀態(tài)下的腫瘤的基因治療提供一種更加安全、高效的策略。

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作者簡(jiǎn)介：

郝軼，碩士，主治醫(yī)師，新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，830011。

基金項(xiàng)目：

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金（編號(hào)：2011211B19）Correspondence to：HAO Yi（郝軼）

第2篇：基因治療的基本策略范文

鈣離子循環(huán)在心肌細(xì)胞的興奮收縮耦聯(lián)中起著至關(guān)重要的作用。心肌細(xì)胞興奮去極化激活L-型鈣通道，少量Ca2+迅速內(nèi)流，胞內(nèi)鈣濃度增高，激活肌漿網(wǎng)上鈣釋放通道(ryanodinereceptor，RyR2)，導(dǎo)致肌漿網(wǎng)內(nèi)貯存的Ca2+釋放入胞漿，此過(guò)程即鈣觸發(fā)鈣釋放(calcium-inducedcalciumre-lease，CICR)。胞漿中游離鈣達(dá)到10－5mol/L時(shí)，肌鈣蛋白被激活，肌鈣蛋白的構(gòu)象改變，肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白接觸，引起心肌細(xì)胞收縮。肌漿網(wǎng)上的鈣泵(sarcoplasmicreticulumcalciumadenodinetriphosphatase，SERCA2)將胞漿內(nèi)游離Ca2+泵回肌漿網(wǎng)貯存，胞漿內(nèi)游離鈣降至10-7mol/L時(shí)，肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白分離，心肌舒張。心肌的收縮-舒張過(guò)程受到多種因素的調(diào)節(jié)。受磷蛋白(phospholamban，PLN)是存在于肌漿網(wǎng)縱行小管的膜蛋白，非磷酸化的PLN與SERCA2結(jié)合，通過(guò)蛋白-蛋白之間的相互作用抑制SERCA2與Ca2+的親和力，降低SERCA2的活性。環(huán)磷酸腺苷(cAMP)依賴性蛋白激酶A(PKA)和Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶(CaMBKⅡ)則使PLN磷酸化，磷酸化的PLN與SERCA2解離，消除其抑制作用，活化SERCA2?？Х纫?、ATP、Na+、K+及磷酸化等都可以刺激RyR2的開(kāi)放，而H+、釕紅和去磷酸化等則可以抑制RyR2的開(kāi)放。FKBP12.6可以穩(wěn)定RyR2關(guān)閉時(shí)的構(gòu)象狀態(tài)。S100A1作為一種鈣結(jié)合蛋白，對(duì)Ca2+有很強(qiáng)的結(jié)合力，可以調(diào)節(jié)RyR2和SERCA2的功能以及肌漿網(wǎng)鈣含量。β-腎上腺素受體的激活可以增強(qiáng)鈣循環(huán)，加快心肌收縮和舒張的節(jié)律。

2．心力衰竭的基因治療

心臟收縮-舒張過(guò)程中任何一個(gè)環(huán)節(jié)的功能障礙都可能導(dǎo)致心肌的收縮和/或舒張功能降低，從而誘發(fā)心力衰竭的產(chǎn)生。心力衰竭的基因治療靶點(diǎn)即針對(duì)此過(guò)程中的鈣循環(huán)相關(guān)蛋白和調(diào)控因子?；蛑委煱ㄈ齻€(gè)基本要素:基因載體、轉(zhuǎn)移方式和靶基因。

(1)基因載體靶基因需要通過(guò)特定的載體轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞中去，目前常用的基因載體主要分為非病毒載體和病毒載體兩大類(lèi)。非病毒載體可大致分為質(zhì)粒DNA、脂質(zhì)體DNA復(fù)合物和高分子DNA復(fù)合物。寡核苷酸類(lèi)及其類(lèi)似物，亦可單獨(dú)或以復(fù)合物的形式作為一種非病毒載體用于基因轉(zhuǎn)移。一種可降解的高分子聚合納米粒子，具有強(qiáng)大的核酸容量，避免了腺病毒轉(zhuǎn)染有關(guān)的安全問(wèn)題，適合作為基因載體，已得到了美國(guó)FDA的批準(zhǔn)［3］。病毒載體在臨床前研究中應(yīng)用更為廣泛，主要包括腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體(AAV)、反轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體，病毒載體的應(yīng)用大大提高了基因轉(zhuǎn)移的效率。重組人類(lèi)腺病毒載體是轉(zhuǎn)基因治療模型中最常用的載體，它的優(yōu)勢(shì)在于:擴(kuò)增相對(duì)容易，可以達(dá)到較高的病毒滴度發(fā)揮功能，對(duì)靶細(xì)胞存在尤其是對(duì)心血管系統(tǒng)廣泛親嗜性。無(wú)論在體內(nèi)還是體外環(huán)境下，絕大部分心肌細(xì)胞都可以被腺病毒有效轉(zhuǎn)染。然而，將腺病毒應(yīng)用于臨床仍面臨許多挑戰(zhàn)。腺病毒進(jìn)入機(jī)體后，可能會(huì)引起強(qiáng)烈的免疫和炎癥反應(yīng)，這將限制其后續(xù)的表達(dá)。病毒可能感染所有的器官(尤其是肝臟)，不能呈現(xiàn)理想的組織選擇性。相對(duì)于腺病毒，雖然AAV、反轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體有著較低的免疫原性，但是AAV難以達(dá)到高效價(jià)的病毒滴度，對(duì)靶基因的裝載能力有限以及人體本身存在中和抗體等。反轉(zhuǎn)錄病毒載體不能轉(zhuǎn)染類(lèi)似心肌細(xì)胞的不分裂細(xì)胞，慢病毒的生物安全性尚待評(píng)價(jià)。

(2)載體轉(zhuǎn)移途徑目的基因轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞，除了需要適宜的載體，還要有適合的轉(zhuǎn)移途徑。一些可增加血管通透性的化學(xué)物質(zhì)曾被用于促進(jìn)載體從血管腔轉(zhuǎn)移至心肌，如硝酸甘油、硝普鈉、5-羥色胺、緩激肽、組胺及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等，但是對(duì)于臨床心力衰竭患者，考慮到以上物質(zhì)有降低血壓的作用，需謹(jǐn)慎應(yīng)用。常用的轉(zhuǎn)移途徑包括:①順向注射法:一種為阻塞冠狀動(dòng)脈的順向注射法，即用球囊阻塞冠狀動(dòng)脈近端，使病毒載體不會(huì)逆流或被稀釋?zhuān)朔ù嬖诎踩[患，因?yàn)榧词苟虝r(shí)間的冠狀動(dòng)脈阻塞也可能不能耐受;另一種為非阻塞冠狀動(dòng)脈的延長(zhǎng)順向注射法，此法用于AAV的轉(zhuǎn)移最為有效，而且可作為心力衰竭患者不能耐受冠狀動(dòng)脈阻塞法的最佳選擇。盡管這種方法并不能感染所有心肌(約60%)，但它更符合冠狀動(dòng)脈的正常生理血流特點(diǎn)。重度心力衰竭患者接受攜帶SERCA2a的AAV1轉(zhuǎn)染的臨床研究，即采用了延長(zhǎng)順向注射法。另一種為循環(huán)灌注技術(shù)，通過(guò)經(jīng)皮的最小微創(chuàng)手術(shù)建立心肌的獨(dú)立灌注區(qū)域，使冠狀動(dòng)脈和冠狀竇之間形成一個(gè)閉合回路，此法在攜帶SERCA2a的腺病毒載體和AAV轉(zhuǎn)染綿羊心力衰竭模型中應(yīng)用，證實(shí)可顯著改善心肌收縮力［4］。②逆向注射法:經(jīng)冠狀靜脈逆向注射對(duì)于有冠狀動(dòng)脈疾病的患者來(lái)說(shuō)是一個(gè)非常好的選擇。然而，逆向注射法對(duì)不能耐受冠狀動(dòng)脈阻塞的患者也存在操作困難。③直接注射法:經(jīng)過(guò)外科手術(shù)或經(jīng)皮介入將載體直接注入到心肌組織，此法可避免許多血管內(nèi)途徑帶來(lái)的潛在弊端:肝臟和脾臟的首過(guò)消除作用、中和抗體的效應(yīng)、T細(xì)胞應(yīng)答以及血管內(nèi)皮屏障的不滲透性。直接注射法僅將病毒載體轉(zhuǎn)移至注射部位心肌。④心包腔途徑:經(jīng)由心包將載體轉(zhuǎn)移，載體會(huì)優(yōu)先在心包鄰近的心肌細(xì)胞中表達(dá)。如何最優(yōu)化心包轉(zhuǎn)移法的治療效應(yīng)主要取決于多少比例的靶組織需要被糾正。局灶性的基因轉(zhuǎn)移適于局部缺血的心肌組織，彌散性的基因轉(zhuǎn)移更適于糾正整體的心功能不全。⑤手術(shù)轉(zhuǎn)移:通常需對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行開(kāi)胸手術(shù)，繼而采用直接、順向或逆向注射。然而，臨床心力衰竭患者能否耐受此法尚待進(jìn)一步研究證實(shí)。

(3)靶基因理想的靶基因應(yīng)具備以下特性:在心力衰竭動(dòng)物模型證實(shí)能改善心功能，無(wú)致心律失常性，量效關(guān)系明確，即靶基因表達(dá)越多，心臟功能的改善越明顯［5］。如表1所示，迄今用于心力衰竭轉(zhuǎn)基因治療的靶基因包括［6-18］:鈣循環(huán)相關(guān)蛋白:①過(guò)表達(dá)SERCA2a:早在20余年前，Gwathmey等即發(fā)現(xiàn)，無(wú)論心力衰竭病因如何均存在明顯的鈣循環(huán)異常，且部分歸因于SERCA2a的活性下降。大量的心力衰竭動(dòng)物模型結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)SERCA2a基因可顯著增加心肌收縮功能，在容量負(fù)荷過(guò)重所致的心力衰竭豬模型，甚至可改善心室重構(gòu)［6-7］。另外，過(guò)表達(dá)SERCA2a可修復(fù)心肌能量供應(yīng)和利用的失衡，降低室性心律失常發(fā)生，增加冠狀動(dòng)脈血流［8，19］。②抑制PLN:抑制PLN的表達(dá)，可起到與過(guò)表達(dá)SERCA2a相似的效應(yīng)，進(jìn)一步改善心肌的收縮和舒張功能。在起搏誘導(dǎo)的羊心力衰竭模型，通過(guò)基因沉默抑制PLN的表達(dá)，2周后，即顯示PLN抑制組左心室舒張末徑顯著減小，射血分?jǐn)?shù)顯著增加［9］。利用RNA干擾技術(shù)，將攜帶抑制PLN表達(dá)的基因序列的AAV9，通過(guò)靜脈注射轉(zhuǎn)染心臟結(jié)果顯示:PLN蛋白表達(dá)下降了75%，SERCA2a的活性部分恢復(fù)，心力衰竭大鼠的血流動(dòng)力學(xué)特性顯著改善，收縮功能、舒張功能各項(xiàng)指標(biāo)均恢復(fù)正常，心室肥厚、心肌纖維化程度均明顯下降［10］。③S100A1:S100是一類(lèi)鈣結(jié)合蛋白，其中S100A1主要在心臟表達(dá)。S100A1參與了對(duì)細(xì)胞內(nèi)外Ca2+調(diào)控的多個(gè)環(huán)節(jié)，可增加肌漿網(wǎng)SERCA2a和RyR2的活性促進(jìn)心肌的收縮和舒張，調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的順應(yīng)性和對(duì)Ca2+的反應(yīng)性，調(diào)控Ca2+介導(dǎo)的線粒體的能量代謝［20-21］。在心肌梗死后心力衰竭豬模型，通過(guò)冠狀靜脈逆向轉(zhuǎn)移法，將AAV-S100A1注射至左心室非梗死區(qū)結(jié)果顯示:注射14周后，S100A1治療組修復(fù)了肌漿網(wǎng)的鈣循環(huán)障礙，抑制了進(jìn)行性的心功能下降，逆轉(zhuǎn)了左心室重構(gòu)，且不增加室性心律失常的誘發(fā)率，證實(shí)了S100A1轉(zhuǎn)基因治療的長(zhǎng)期有效性和安全性［11-12］。β腎上腺素受體(β-AR)系統(tǒng):心力衰竭患者的β-AR往往呈現(xiàn)為表達(dá)下調(diào)。將攜帶β2-AR的腺病毒經(jīng)冠狀動(dòng)脈轉(zhuǎn)染兔心肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染后第1周、3周時(shí)，反映心肌收縮力的指標(biāo)dP/dtmax明顯增加，且心肌細(xì)胞對(duì)β-AR激動(dòng)劑異丙腎上腺素的反應(yīng)性顯著增強(qiáng)［22］。過(guò)表達(dá)β2-AR的小鼠亦顯示心臟功能得到明顯改善。G蛋白偶聯(lián)受體激酶(GRK):β-ARs與G蛋白之間的相互作用是通過(guò)激酶對(duì)偶聯(lián)受體的磷酸化調(diào)節(jié)作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的。GRK2是心臟中表達(dá)最多的GRK，它在心力衰竭時(shí)表達(dá)增加，導(dǎo)致β-AR信號(hào)通路敏感性下降，功能障礙。在心肌梗死后心力衰竭小鼠模型，選擇性的抑制GRK2表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10天后，GRK2抑制組小鼠生存率增高，心室重構(gòu)延緩，心肌的收縮力增強(qiáng)［23］。β-ARKct多肽是GRK2介導(dǎo)的β-AR失敏的抑制劑。將攜帶β-ARKct的腺病毒感染心梗后心力衰竭兔，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后3周，心室功能明顯改善［16］。β-ARKct過(guò)表達(dá)的陽(yáng)性結(jié)果在豬的心力衰竭模型上亦得到驗(yàn)證［17］。腺苷酸環(huán)化酶(AC):心肌細(xì)胞接受兒茶酚胺刺激，經(jīng)由β-AR使細(xì)胞內(nèi)AC激活，生成cAMP，這是正常的生理反應(yīng)。分離過(guò)表達(dá)VI型AC的轉(zhuǎn)基因小鼠心肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)cAMP表達(dá)增高，心功能增強(qiáng)［24］。在起搏誘導(dǎo)的心力衰竭豬模型，轉(zhuǎn)染攜帶Ⅵ型AC基因的腺病毒，結(jié)果顯示可顯著改善心臟功能和逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)，且這種效應(yīng)與cAMP的生成增多具有明顯相關(guān)性［18］。

3．心力衰竭基因治療的臨床試驗(yàn)

靶基因在細(xì)胞模型、嚙齒類(lèi)動(dòng)物模型和大動(dòng)物模型上均得到驗(yàn)證，合適的載體和適宜的轉(zhuǎn)移途徑，這些是開(kāi)展臨床試驗(yàn)的前提。誠(chéng)然臨床試驗(yàn)開(kāi)始前還需要充分評(píng)價(jià)機(jī)體對(duì)病毒載體的免疫反應(yīng)、明確心功能指標(biāo)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)以及評(píng)價(jià)罹患心律失常的風(fēng)險(xiǎn)［25］。既往因病毒載體所導(dǎo)致的嚴(yán)重不良事件，如注射重組腺病毒后誘發(fā)的多器官衰竭、注射反轉(zhuǎn)錄病毒后出現(xiàn)的T細(xì)胞淋巴瘤等，限制了基因治療的發(fā)展。隨后新的研究進(jìn)展和新的病毒載體的迅速出現(xiàn)，突破了以上技術(shù)瓶頸，為轉(zhuǎn)基因治療領(lǐng)域帶來(lái)了新的曙光［26］。心力衰竭轉(zhuǎn)基因治療第一項(xiàng)臨床試驗(yàn)始于2007年，是在美國(guó)發(fā)起的多中心CUPID(calciumup-regulationbypercu-taneousadministrationofgenetherapyincardiacdisease)研究，旨在評(píng)價(jià)AAV1-SERCA2a基因治療對(duì)晚期心力衰竭患者的安全性及生物學(xué)療效。第一期試驗(yàn)共納入12例患者，通過(guò)冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射給藥，四組內(nèi)的每3例患者均依次增加給藥劑量。隨訪至第12個(gè)月時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果顯示安全性尚可，41.7%的患者顯示癥狀改善，33.3%顯示功能改善，16.7%顯示生物標(biāo)志物改善，50%有左心室功能和重構(gòu)改善［27］。在二期試驗(yàn)中，共39例晚期心力衰竭患者隨機(jī)接受AAV1-SERCA2a治療，分為低劑量組、中等劑量組、高劑量組和安慰劑組。在第6個(gè)月時(shí)，評(píng)價(jià)患者的癥狀(NYHA分級(jí)、明尼蘇達(dá)心力衰竭問(wèn)卷)、功能狀態(tài)(6分鐘步行實(shí)驗(yàn)、最大氧耗量)、NT-BNP水平、心臟超聲各項(xiàng)指標(biāo)等。組間和組內(nèi)患者比較，以上臨床指標(biāo)具有一致性的改善才被認(rèn)為是試驗(yàn)成功。高劑量AAV1-SERCA2a治療組達(dá)到了預(yù)設(shè)定的成功標(biāo)準(zhǔn)。與安慰劑相比，AAV1-SERCA2a治療的患者顯示NYHA分級(jí)、明尼蘇達(dá)心力衰竭評(píng)分、6分鐘步行實(shí)驗(yàn)、最大氧耗量、NT-BNP水平和左心室收縮末期容積得到改善或穩(wěn)定。所有接受AAV1-SERCA2a治療的患者心血管事件發(fā)生率均降低，不良反應(yīng)、疾病相關(guān)事件及心律失常均未見(jiàn)增加［28］。隨訪至3年，SERCA2a基因仍在表達(dá)，治療的臨床效果仍然存在［29］。入選250例，以SERCA2a為靶基因的CUPID2b期試驗(yàn)(NCT01643330)即將完成［30］。另兩項(xiàng)以SERCA2a為靶基因的試驗(yàn)也正在進(jìn)行當(dāng)中。第一項(xiàng)試驗(yàn)在英國(guó)實(shí)施，納入的是在AAV6-SERCA2a治療前接受左心室輔助裝置治療至少1個(gè)月的晚期心力衰竭患者。另一項(xiàng)二期臨床試驗(yàn)AGENT-HF(AAV6-CMV-Serca2aGENetherapytrialinheartfailure)在法國(guó)實(shí)施，是一項(xiàng)單中心、雙盲、隨機(jī)、安慰劑對(duì)照的平行研究，主要探討AAV6-CMV-SERCA2a治療對(duì)嚴(yán)重心力衰竭患者心臟重構(gòu)的影響。此外，尚有以AC6、SDF-1為靶基因的臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中。

第3篇：基因治療的基本策略范文

[關(guān)鍵詞]基因編輯技術(shù)； CRISPR/CAS9； ZFNs； TALENs

基因編輯技術(shù)是一項(xiàng)對(duì)基因組進(jìn)行精確定點(diǎn)修飾的技術(shù)，可對(duì)特定DN段進(jìn)行敲除、加入和替換等，從而在基因組水平上進(jìn)行精確的基因編輯。此過(guò)程模擬了基因的自然突變，修改并編輯了生物的基因組，使研究人員可以在極短時(shí)間內(nèi)模擬自然界漫長(zhǎng)時(shí)間的基因演變，甚至能夠完成自然進(jìn)化中無(wú)法完成的基因組改變。在科研領(lǐng)域，該技術(shù)可以快速構(gòu)建模式動(dòng)物，節(jié)約大量科研時(shí)間和經(jīng)費(fèi)；在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，該技術(shù)可以人為改造基因序列，使之符合人們的要求，研制如改良水稻等糧食作物；在醫(yī)療領(lǐng)域，該技術(shù)可以更加準(zhǔn)確、深入地了解疾病發(fā)病機(jī)制和探究基因功能，以及改造人的基因，達(dá)到基因治療的目的等。因此，基因編輯技術(shù)具有極其廣泛的發(fā)展前景和應(yīng)用價(jià)值。

鋅指核酸酶（zincfinger nucleases，ZFN）、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶 （transcription activatorlike effector nucleases，TALENs）和成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列CRISPR/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）是三大基因編輯技術(shù)。這3種技術(shù)皆是通過(guò)在特定的靶向序列處引入雙鏈斷裂缺口（doublestrand break，DSB），繼而通過(guò)NHEJ途徑（nonhomologous end joining，NHEJ）和HR（homologous recombination，HR）途徑這2種細(xì)胞內(nèi)DNA修復(fù)機(jī)制完成修復(fù)。NHEJ途徑（nonhomologous endjoining，NHEJ）使基因MDNA缺口處有堿基的插入或者缺失，造成移碼突變，導(dǎo)致基因的敲除；HR（homologous recombination，HR）途徑在提供外源DNA模板的條件下使基因組DNA得到精確的基因修復(fù)或靶向基因的添加[1]。由此可見(jiàn)，這3種基因編輯技術(shù)本質(zhì)上均是利用非同源末端鏈接途徑修復(fù)和同源重組修復(fù)，聯(lián)合特異性DNA靶向識(shí)別及核酸內(nèi)切酶完成的DNA序列改變。

11ZFNs每個(gè)鋅指核酸酶單體都是由鋅指蛋白（zinc finger protein，ZFP）與非特異核酸酶結(jié)合的人工合成酶。此酶的N端部分是能識(shí)別含有特定DNA序列的鋅指蛋白，C端部分則由非特異性切割結(jié)構(gòu)域Fok I以及連接DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和內(nèi)切酶的肽段組成[23]。ZFN的特異性取決于ZFP，因此篩選高質(zhì)量的ZFP是獲得高效、特異性的ZFN的前提[47]。ZFP通常由3～6個(gè)鋅指組成，每個(gè)鋅指識(shí)別基因組中連續(xù)的3個(gè)堿基。ZFP一旦與基因組中的特定序列結(jié)合，F(xiàn)ok I核酸內(nèi)切酶便會(huì)形成二聚體發(fā)揮內(nèi)切酶活性，產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂的缺口，繼而通過(guò)細(xì)胞內(nèi)修復(fù)機(jī)制對(duì)斷裂部位的基因進(jìn)行修飾[811]（圖1）。ZFN的基因打靶效率一般能夠達(dá)到30%，可以做到針對(duì)特定序列設(shè)計(jì)ZFN來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的修飾。然而ZFN識(shí)別結(jié)構(gòu)域存在的上下文依賴效應(yīng)大大降低了ZFN設(shè)計(jì)和篩選效率。目前尚不能針對(duì)任意一段序列均可設(shè)計(jì)出滿足要求的ZFN，也不能在每一個(gè)功能性染色體區(qū)段都能夠順利找到適合的ZFN作用位點(diǎn)。在ZFN的篩選和設(shè)計(jì)方面存在較大的技術(shù)困難之外，其制備價(jià)格也比較昂貴。此外，ZFN的脫靶切割也往往會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞毒性。綜上這些因素使得ZFN在基因治療領(lǐng)域的應(yīng)用有一定的局限性。

12TALENsTALEN是植物病原菌黃單胞桿菌Xanthomonas sp.產(chǎn)生的TALE蛋白的中央?yún)^(qū)域結(jié)構(gòu)域與FokⅠ核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域組合而成的一類(lèi)重組核酸酶。TALE蛋白的中央?yún)^(qū)域結(jié)構(gòu)域是該蛋白識(shí)別特異DNA序列的結(jié)構(gòu)域。它包含了155～195個(gè)蛋白單元模塊，每個(gè)模塊單元有34個(gè)氨基酸殘基，其中除第12和13位氨基酸可變外，其他氨基酸都是保守的。因此，這第12和13位氨基酸被稱作重復(fù)可變的雙氨基酸殘基（repeat variable diresidues，RVDs） 位點(diǎn)[12]，是靶向識(shí)別的關(guān)鍵。由于TALE存在多種變體，所以可以構(gòu)建出靶向基因組中預(yù)設(shè)DNA靶位點(diǎn)的多種TALEN。相比ZFN技術(shù)，TALEN使用了TALE蛋白的中央?yún)^(qū)域結(jié)構(gòu)域代替ZFP作為人工核酸酶的識(shí)別結(jié)構(gòu)域，更好地解決了DNA序列識(shí)別特異性低的問(wèn)題。TALE蛋白中央?yún)^(qū)域結(jié)構(gòu)域?qū)A基的識(shí)別只由2個(gè)氨基酸殘基決定：組氨酸天冬氨酸特異識(shí)別堿基C，即HD（His Asp）C；天冬酰胺異亮氨酸識(shí)別堿基A，即NI（Asn Ile）A；天冬酰胺甘氨酸識(shí)別堿基T，即NG （AsnGly）T；天冬酰胺天冬酰胺識(shí)別堿基G或A，即NN（AsnAsn）G或A；天冬酰胺賴氨酸識(shí)別堿基G，即NK（Asn Lys）G；天冬酰胺絲氨酸可以識(shí)別A，T，G，C 中的任一種NS （AsnSer）A，T，C，G [1314]（圖2）。這種與DNA堿基一一對(duì)應(yīng)的方式在設(shè)計(jì)上相對(duì)于ZFN要簡(jiǎn)單得多。然而，在實(shí)際構(gòu)建過(guò)程中，TALE分子的模塊組裝和篩選過(guò)程也比較繁雜，通常需要大量的測(cè)序工作。這使得該技術(shù)的使用成本較高，對(duì)于普通實(shí)驗(yàn)室的可操作性較低。此外，TALEN分子比ZFN大得多，因而在不能高效導(dǎo)入細(xì)胞方面也限制了它的應(yīng)用。

13CRISPR/Cas9CRISPR/Cas（clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences/CRISPRassociated protein）系統(tǒng)是在細(xì)菌和古細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的一種獲得性免疫系統(tǒng)[15]，由成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列CRISPR與Cas蛋白組成，能特異性識(shí)別外源病毒或質(zhì)粒的核酸物質(zhì)，并對(duì)其進(jìn)行剪切，起到防疫外源核酸入侵的作用[16]。其中CRISPR簇通過(guò)轉(zhuǎn)錄生成一段非碼RNA，即CRISPR前體

的靶標(biāo)可設(shè)計(jì)為針對(duì)一個(gè)基因，也為針對(duì)多個(gè)基因，都能達(dá)到有效的特異性位點(diǎn)編輯的效果。CRISPR/Cas9系統(tǒng)已被公認(rèn)為是繼“鋅指核酸內(nèi)切酶（ZFN）”、“類(lèi)轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALEN）”之后出現(xiàn)的第3代“基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)”。ZNFs和TALENs作用時(shí)均是采用蛋白質(zhì)對(duì)DNA序列的識(shí)別，而CRISPR/Cas9對(duì)靶序列的識(shí)別是RNA與DNA的堿基配對(duì)過(guò)程。該識(shí)別方式使得CRISPR/Cas9與前二者相比更為精準(zhǔn)，降低了脫靶切割的幾率，減低了細(xì)胞毒性。CRISPR/Cas9所有成分都可以通過(guò)導(dǎo)入質(zhì)粒進(jìn)行表達(dá)，因此也省去了耗時(shí)耗力的蛋白質(zhì)工程過(guò)程。同時(shí)，研究人員可以通過(guò)生物信息學(xué)分析，設(shè)計(jì)出針對(duì)絕大多數(shù)基因的特異性靶標(biāo)識(shí)別crRNA。因此，與前2代技術(shù)相比，CRISPR/Cas9成本低、制作簡(jiǎn)便、快捷高效、脫靶率低的優(yōu)點(diǎn)使其迅速風(fēng)靡于世界各地的實(shí)驗(yàn)室，成為科研、醫(yī)療等領(lǐng)域的有效工具，逐漸成為當(dāng)今分子生物學(xué)領(lǐng)域最炙手可熱的技術(shù)之一。然而CRISPR/Cas9 系統(tǒng)也存在著一些不完美之處：Cas9 蛋白對(duì)于目標(biāo)序列的識(shí)別除了依靠crRNA序列的匹配之外，目標(biāo)序列附近必須存在一些小的前間區(qū)序列鄰近基序（PAM），因此Cas9 蛋白對(duì)于設(shè)定序列的切割仍有局限性；另外和ZFNs及TALENs技術(shù)一樣，CRISPR/Cas9也面臨著如何控制雙鏈斷裂之后的非同源末端連接修復(fù)可能會(huì)隨機(jī)產(chǎn)生細(xì)胞毒性的問(wèn)題。

14 NgAgoCRISPR是以RNA為向?qū)ふ野邢蛐蛄校鳱gAgo則是以DNA來(lái)?yè)?dān)任向?qū)?。韓春雨等的工作顯示，NgAgo可結(jié)合24個(gè)堿基的gDNA，比CRISPR結(jié)合19個(gè)堿基的gRNA要長(zhǎng)5個(gè)堿基，因此理論上精確性要高1 024倍，脫靶率也較低。然而，不同于CRISPR/Cas9技術(shù)大量運(yùn)用已獲得了實(shí)踐驗(yàn)證，NgAgo的作用效果還有待于今后工作的檢驗(yàn)。

2基因編碼技術(shù)的應(yīng)用

21在基因治療中的應(yīng)用隨著DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)和以DNA重組技術(shù)為代表的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以及人類(lèi)對(duì)疾病認(rèn)識(shí)的不斷深入，越來(lái)越多的證據(jù)表明，許多疾病都與基因突變、缺失或表達(dá)異常有關(guān)，由此基因治療技術(shù)順勢(shì)而生?；蛑委熓侵笐?yīng)用基因工程技術(shù)將正?；蚧蛴兄委熥饔玫幕蛞牖颊呒?xì)胞內(nèi)，以糾正致病基因的缺陷而根治疾病。其最核心的策略是通過(guò)細(xì)胞內(nèi)基因修飾來(lái)治療疾病。近兩三年來(lái)，基因編碼技術(shù)作為該策略的新生力量開(kāi)始活躍在基因治療的舞臺(tái)上，在癌癥、遺傳性疾病和逆轉(zhuǎn)錄病毒相關(guān)的傳染病等疾病的治療方面取得許多堪稱跨時(shí)代的佳績(jī)。

癌癥治療方面：2015年11月英國(guó)倫敦大奧蒙德街醫(yī)院（Great Ormond Street Hospital）的醫(yī)生第一次依靠使用“分子剪刀”修改基因的療法，成功地治愈了一名患有“無(wú)法治愈的”白血病的1歲女孩“萊拉”（Layla）。其治療方案是利用TALEN蛋白對(duì)異體T細(xì)胞進(jìn)行基因編輯，去除內(nèi)源性TCR（提高腫瘤殺傷特異性）及CD52（避免藥物alemtuzumab的干擾），并命名為antiCD19 CART細(xì)胞，再將這些經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)的“人工培育的免疫細(xì)胞”輸入患者體內(nèi)去捕捉和殺傷腫瘤細(xì)胞。經(jīng)過(guò)1個(gè)月的治療，這名女孩目前擺脫了癌癥，身體狀況很不錯(cuò)，成為世界上首次用基因編輯治愈的白血病女孩[18]。此外，科學(xué)家們?cè)谶^(guò)去的幾十年中已經(jīng)確定了許多腫瘤治療中相關(guān)的基因，包括原癌基因、抑癌基因、基因組修飾類(lèi)、基因抗藥性基因。近2年，研究者們已經(jīng)開(kāi)始利用基因編碼技術(shù)對(duì)上述基因開(kāi)展了大規(guī)模的基因編輯修飾研究，預(yù)計(jì)今后幾年內(nèi)會(huì)出現(xiàn)多項(xiàng)癌癥治療方面的重大突破。

遺傳性疾病治療方面：2015年底《Nature》雜志發(fā)表的對(duì)2016年熱點(diǎn)研究領(lǐng)域的展望（The science to look out for in 2016）中提到美國(guó)加利福尼亞州里士滿Sangamo生物科學(xué)公司將計(jì)劃開(kāi)展利用ZFN糾正導(dǎo)致血友病基因缺陷的人體試驗(yàn)，并對(duì)其研究成果表示非常期待。另外該公司還與馬薩諸塞州劍橋市的Biogen公司合作開(kāi)始了另一項(xiàng)試驗(yàn)，嘗試通過(guò)該技術(shù)提高β地中海貧血患者體內(nèi)一種血液球蛋白的功能[19]。已有研究證實(shí)人β珠蛋白（HBB）基因的突變可能導(dǎo)致地中海貧血癥。我國(guó)中山大學(xué)黃軍就和他的團(tuán)隊(duì)利用CRISPRCas9基因編輯技術(shù)，修改了人類(lèi)胚胎HBB基因的DNA，為治療地中海貧血癥提供了可能。該研究中一共使用了86個(gè)胚胎，48 h后有71個(gè)胚胎存活，其中在54個(gè)接受了基因測(cè)試的胚胎中僅有28個(gè)胚胎的基因被成功修改，但其中只有一小部分包含替代的遺傳物質(zhì)。該研究是史上第一例利用基因編輯技術(shù)改造人類(lèi)胚胎細(xì)胞的案例。盡管該研究使用的胚胎均為無(wú)法發(fā)育成嬰兒、不能正常出生的胚胎，該成果的倫理問(wèn)題在西方仍引發(fā)巨大爭(zhēng)議，由此《Nature》的記者和編輯們最終將黃軍就選入了年度十大人物之列[20]。多種肌肉營(yíng)養(yǎng)障礙癥（duchenne muscular dystrophy，DMD）是表達(dá)dystrophin蛋白的基因發(fā)生移碼突變，導(dǎo)致不能形成有功能的抗肌萎縮蛋白dystrophin所引發(fā)的一種遺傳性疾病。2014年研究者已利用CRISPR技術(shù)成功修復(fù)了小鼠胚胎中的dystrophin基因缺陷。今年，西南醫(yī)學(xué)中心的Chengzu Long，杜克大學(xué)的Charles Gersbach，哈佛大學(xué)Amy Wagers 與MIT張鋒合作研究組這3個(gè)獨(dú)立的研究組又分別完成了小鼠成年體的基因修復(fù)。其中Chengzu Long研究組的研究方案為利用腺病毒將gRNA以及CRISPR/Cas9導(dǎo)入肌肉細(xì)胞，利用CRISPR/Cas9切除有缺陷的DN段，使小鼠能夠產(chǎn)生較短版本的有功能的dystrophin蛋白[21]。

逆轉(zhuǎn)錄病毒相關(guān)傳染病的治療方面：HIV病毒的基因會(huì)整合到病人的基因組上。利用抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物治療僅能抑制HIV病毒的復(fù)制但對(duì)整合在細(xì)胞中的病毒DNA不起作用，一旦停止服用藥物這些病毒余孽就會(huì)起死回生，開(kāi)始產(chǎn)生艾滋病原體。因此只有清除整合在宿主靶細(xì)胞上的HIV病毒基因才能實(shí)現(xiàn)根治艾滋病的夢(mèng)想。2013 年，朱煥章等設(shè)計(jì)并獲得了一對(duì)能特異靶向多數(shù)HIV亞型基因保守區(qū)LTR （long terminal repeat） 的ZFN，并證實(shí)該ZFN能特異性靶向HIV感染及潛伏細(xì)胞系上的HIV1前病毒LTR，且介導(dǎo)了HIV1整合基因的高效切除，畝獲得了顯著抗HIV感染的效果[22]。今年，Rafal等[23]利用CRISPR/Cas9技術(shù)使帶有HIV病毒的T細(xì)胞失去活性，同時(shí)病毒復(fù)制在受感染細(xì)胞中降低了90%。這一治療方案預(yù)計(jì)在兩三年后開(kāi)展臨床試驗(yàn)。

22在新方法學(xué)及動(dòng)物模型制備上的應(yīng)用當(dāng)前，各類(lèi)基因敲除（knockout）和基因嵌入/置換（knockin）基因工程動(dòng)物及細(xì)胞系已經(jīng)成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)識(shí)疾病發(fā)生發(fā)展規(guī)律、研究疾病預(yù)防和治療的重要實(shí)驗(yàn)工具和手段。傳統(tǒng)的基因工程動(dòng)物制備工藝――基因打靶技術(shù)是基于胚胎干細(xì)胞的一種同源重組技術(shù)。利用該技術(shù)制備基因修飾動(dòng)物周期較長(zhǎng)且存在生殖系統(tǒng)傳遞失敗的風(fēng)險(xiǎn)。新型的基因編碼技術(shù)系統(tǒng)可在小鼠受精卵中直接進(jìn)行基因組編輯，因而快速、高效、低成本、無(wú)物種限制地一步生成基因工程動(dòng)物。復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的研究人員通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行凝血因子Ⅸ（Factor Ⅸ，F(xiàn)Ⅸ）基因敲除，快速、高效地構(gòu)建血友病乙模型小鼠，以期為血友病乙的研究提供更加便捷的途徑[24]。Park 等[25]使用TALEN 技術(shù)將誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞中含有F8 基因的140 kb染色體片段倒置，建立了小鼠血友病A模型，并且再次通過(guò)TALEN基因編輯工具將其之前倒置的染色體片段再重新恢復(fù)到正常。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TALEN基因編輯工具既可以建立疾病模型，又可以介導(dǎo)疾病的再次糾正。軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院的研究人員利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的同源重組，將有絲分裂降解結(jié)構(gòu)域MD（Mitosisspecial degradation domain，MD）插入到進(jìn)基因組表達(dá)框上游，以期周期性持續(xù)降解細(xì)胞內(nèi)CTCF（CCCTC binding factor，CTCF）蛋白，從而獲得CTCF蛋白特異性降解細(xì)胞系，為后續(xù)研究CTCF功能奠定基礎(chǔ)[26]。

此外，隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，基因編輯技術(shù)已經(jīng)變?yōu)榭蒲腥藛T的新寵，越來(lái)越多的科學(xué)家運(yùn)用其與其他技術(shù)相結(jié)合進(jìn)行各種學(xué)術(shù)研究。第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院和重慶大學(xué)的研究人員通過(guò)CRISPR/Cas9介導(dǎo)的同源重組修復(fù)方法，用GFP標(biāo)記HCC細(xì)胞中的內(nèi)源多功能性因子Nanog，證明雄激素/雄激素受體軸可以通過(guò)直接結(jié)合其啟動(dòng)子，增加Nanog的表達(dá)，并促進(jìn)HCC細(xì)胞的干性和腫瘤發(fā)生[27]，從而初步闡明了肝癌發(fā)生的性別差異的機(jī)制。CRISPR/Cas9技術(shù)的成熟使得利用多重sgRNA載體高效、高通量編輯細(xì)胞內(nèi)基因成為可能，為新型功能遺傳篩選創(chuàng)造了條件。IAA2（indole acetic acid 2）是擬南芥Aux/IAA生長(zhǎng)素響應(yīng)基因大家族中的一員。由于沒(méi)有該基因的失去功能型突變體，其功能和作用機(jī)制的研究受到了阻礙。研究人員在GoldenGate克隆技術(shù)的基礎(chǔ)上，將每3個(gè)sgRNA串聯(lián)到同一個(gè)入門(mén)載體中，再將入門(mén)載體與含Cas9表達(dá)框的目標(biāo)載體LR反應(yīng)，獲得最終的表達(dá)載體。結(jié)果表明，設(shè)計(jì)的6個(gè)sgRNA有4個(gè)發(fā)揮了作用，產(chǎn)生了堿基插入突變和大片段缺失突變等多種可遺傳的突變，所得到的突變體為后續(xù)的IAA2功能研究提供了良好的材料[28]。

23其他應(yīng)用前景目前，世界各地的實(shí)驗(yàn)室已將基因編輯技術(shù)應(yīng)用于生物學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。

預(yù)防瘧疾：利用CRISPR/Cas9對(duì)蚊子的基因進(jìn)行改造，使其攜帶一種抗瘧疾的基因，從而對(duì)瘧原蟲(chóng)產(chǎn)生抑制，進(jìn)而遏制瘧疾的傳播[29]。另一種改造為導(dǎo)入不孕基因，使瘧蚊滅絕[30]。

器官移植：利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，對(duì)豬胰島素基因進(jìn)行了無(wú)痕定點(diǎn)修飾，使豬胰島素基因編碼生產(chǎn)人胰島素，成功建立了完全分泌人胰島素的基因編輯豬。這為糖尿病人提供更為理想的臨床異種胰島移植供體。另外，有研究改造了豬肺基因以利于用于人體肺移植，以及去除了豬器官上的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（PERV）以防止移植器官帶來(lái)的病毒感染[31]。

生物制藥：北京蛋白質(zhì)組研究中心張普民教授及其研究團(tuán)隊(duì)利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)豬受精卵的基因組進(jìn)行了基因編輯，在豬白蛋白的基因區(qū)域插入了人白蛋白的編碼DNA，使豬只產(chǎn)生人白蛋白而不產(chǎn)生豬白蛋白[32]。

農(nóng)業(yè)育種改良：利用CRISPR/Cas9技術(shù)幾年內(nèi)可實(shí)現(xiàn)至少50～100年才能完成的育種改良工作。圣保羅Recombinetics公司利用該技術(shù)培育出不會(huì)長(zhǎng)角的牛，從而使牛無(wú)須經(jīng)歷被切去牛角的痛苦過(guò)程。目前該公司正致力于培育永遠(yuǎn)不需要被的豬。

滅絕物種復(fù)活：加州大學(xué)圣克魯斯分校Ben Novak將滅絕的候鴿的博物館標(biāo)本DNA與現(xiàn)存鴿子進(jìn)行序列比對(duì)，并嘗試對(duì)現(xiàn)存鴿子進(jìn)行基因改造，使這些鴿子變得更接近滅絕的候鴿。

3基因編碼技術(shù)的爭(zhēng)議與思考

基因編輯技術(shù)可謂當(dāng)今生命科學(xué)界炙手可熱的前沿科技。顧名思義，該技術(shù)能夠?qū)ψ罨镜倪z傳單位――基因直接進(jìn)行設(shè)計(jì)和修改，其意義和價(jià)值可想而知。這使得各大公司迅速加入到基因編輯的產(chǎn)業(yè)之中。2015年8月，比爾及梅林達(dá)?蓋茨基金會(huì)和谷歌風(fēng)投基金投資Editas醫(yī)藥公司1.2億美元；2015年10月杜邦與Caribou生物科學(xué)公司達(dá)成了合作協(xié)議，使用CrisprCas9技術(shù)來(lái)改進(jìn)農(nóng)作物（http：//wwwnaturecom/news/genomeediting7factsaboutarevolutionarytechnology118869）。中國(guó)基因編輯技術(shù)產(chǎn)業(yè)已走在世界的前列：在CRISPR技術(shù)數(shù)上中國(guó)僅次于美國(guó)，位居世界第2；目前50多家中國(guó)研究機(jī)構(gòu)已提交了基因編輯專(zhuān)利；勁嘉股份與黃軍就團(tuán)隊(duì)合作開(kāi)展CRISPR技術(shù)治療地中海貧血在臨床應(yīng)用方面的研究。中泰證券的分析師認(rèn)為未來(lái)5年僅地中海貧血基因治療的國(guó)內(nèi)潛在市場(chǎng)空間超過(guò)500億元。與此同時(shí)，隨著基因編碼技術(shù)的不斷發(fā)展，CRISPR/Cas9系統(tǒng)相對(duì)前兩代技術(shù)效率提升了10倍以上，操作容易程度提升了100～1 000倍，構(gòu)建周期縮短至原來(lái)的1/12，成本由5 000美元降低至30美元，脫靶率依據(jù)最新技術(shù)已降低至目前檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)不到的水平。脫靶率、效率、便攜性及成本的極大改善，使得該技術(shù)更平民化，技術(shù)門(mén)檻越來(lái)越低。它已成為許多車(chē)庫(kù)生物學(xué)家/草根生物學(xué)家以及生物黑客的新寵。都柏林生物黑客和企業(yè)家Andreas Stürmer說(shuō)，CRISPR是有史以來(lái)最了不起的工具，可以在自己的家里玩（http：//wwwnaturecom/news/biohackersgearupforgenomeediting118236）。

但任何事物都有其雙面性，基因編輯技術(shù)產(chǎn)業(yè)雖然能夠造福于人類(lèi)，然而上面所述的巨大的經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)動(dòng)以及越來(lái)越低的技術(shù)門(mén)檻，再加上人類(lèi)對(duì)自身健康改良的迫切心態(tài)極可能導(dǎo)致對(duì)該技術(shù)的濫用，進(jìn)而對(duì)人類(lèi)和地球環(huán)境形成威脅，甚至造成意想不到的生態(tài)災(zāi)難。在美國(guó)國(guó)家情報(bào)總監(jiān)詹姆斯?克拉珀的威脅評(píng)估報(bào)告中，“基因編輯”已經(jīng)被列入“大規(guī)模毀滅性武器和武器的擴(kuò)散”威脅名單，與核武器并列（https：//wwwtechnologyreviewcom/s/600774/topusintelligenceofficialcallsgeneeditingawmdthreat/）。因此，關(guān)于該技術(shù)運(yùn)用的爭(zhēng)議從其誕生之日就已出現(xiàn)，并呈愈演愈烈之勢(shì)?，F(xiàn)有爭(zhēng)議最集中之處為關(guān)于人類(lèi)胚胎改造的倫理學(xué)爭(zhēng)議。史上第一、二例基因編輯技術(shù)改造人類(lèi)胚胎細(xì)胞的研究皆出現(xiàn)在中國(guó)。2015年4月，中山大學(xué)黃軍就和他的團(tuán)隊(duì)利用CRISPRCas9基因編輯技術(shù)，為治療地中海貧血癥修改了人類(lèi)胚胎基因組[33]。2016年4月29日廣州醫(yī)科大學(xué)范勇團(tuán)隊(duì)，宣布他們用基因編輯技術(shù)制造出一個(gè)能對(duì)艾滋病毒免疫的人類(lèi)胚胎[34]。盡管這2例基因編輯研究都使用的是人類(lèi)三核受精卵（不能正常發(fā)育的受精卵），但在國(guó)際上仍引起了廣泛的關(guān)注和全球科學(xué)家激烈的討論。討論的焦點(diǎn)不在于文章的學(xué)術(shù)價(jià)值，而在于改造人類(lèi)胚胎細(xì)胞的倫理問(wèn)題。由于基因編譯技術(shù)引發(fā)的倫理問(wèn)題迫在眉睫，2015年12月1日，由美國(guó)國(guó)家科學(xué)院、美國(guó)國(guó)家醫(yī)學(xué)院、中國(guó)科W院和英國(guó)皇家學(xué)會(huì)聯(lián)合組織召集的人類(lèi)基因組編輯國(guó)際峰會(huì)在華盛頓召開(kāi)。會(huì)議重點(diǎn)了解各方對(duì)基因編輯技術(shù)的倫理問(wèn)題的態(tài)度和想法。美國(guó)再生醫(yī)學(xué)聯(lián)盟主席蘭菲爾（Edward Lanphier）等在《Nature》雜志上發(fā)表評(píng)論文章稱，希望研究人員暫時(shí)不要對(duì)人類(lèi)生殖細(xì)胞進(jìn)行基因編輯，否則可能對(duì)后代產(chǎn)生無(wú)法預(yù)測(cè)的后果[35]。然而，人類(lèi)胚胎改造的研究終究為大勢(shì)所趨。2016年2月1日，英國(guó)政府批準(zhǔn)了倫敦弗朗西斯?克里克研究所 Kathy Niakan研究員對(duì)人類(lèi)胚胎進(jìn)行編輯的請(qǐng)求。這項(xiàng)研究成為世界首例獲國(guó)家監(jiān)管機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的人類(lèi)胚胎編輯研究。

綜上所述，日漸成熟的基因編輯技術(shù)已經(jīng)成為了強(qiáng)力的生物、醫(yī)學(xué)工具，在癌癥、遺傳性疾病和逆轉(zhuǎn)錄病毒相關(guān)的傳染病等疾病的治療方面帶了巨大的突破，可以快速構(gòu)建實(shí)驗(yàn)新方法和動(dòng)物模型，推動(dòng)科研的發(fā)展，并在器官移植、生物制藥、農(nóng)業(yè)育種改良、滅絕物種復(fù)活和中藥現(xiàn)代化等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。其價(jià)值甚至引起了普通民眾的廣泛關(guān)注。人類(lèi)暢想將來(lái)它不僅可去除遺傳缺陷、治療疾病，還可導(dǎo)入長(zhǎng)壽、健康、強(qiáng)力的基因，甚至制造完美人類(lèi)。當(dāng)然，任何事物都是一把雙刃劍，在樂(lè)觀暢想基因編輯技術(shù)可使人類(lèi)變得更加完美的同時(shí)，也不要忘記濫用技術(shù)可能帶來(lái)的潛在風(fēng)險(xiǎn)和生態(tài)災(zāi)難。建立針對(duì)基因編輯技術(shù)安全有效的檢測(cè)手段，制定合理健全的法律道德制度，才能使這項(xiàng)技術(shù)更好地應(yīng)用和造福人類(lèi)。

4基因編輯在中藥發(fā)展中的潛在前景

如何讓傳統(tǒng)中藥跟上生命科學(xué)現(xiàn)代化的步伐，使傳統(tǒng)中醫(yī)藥走出國(guó)門(mén)，讓世界接受中草藥，是當(dāng)今中醫(yī)藥工作者面臨的難題。長(zhǎng)期以來(lái)，由于中醫(yī)藥與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)之間缺乏有效溝通的橋梁，有逐漸被邊緣化的趨勢(shì)。中藥基因組計(jì)劃將現(xiàn)代生命科學(xué)的最新技術(shù)和研究成果應(yīng)用于中藥研究，有望徹底改變中藥研究手段和方法的落后局面，架起傳統(tǒng)中醫(yī)藥學(xué)與現(xiàn)代生命科學(xué)之間溝通的橋梁。中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所陳士林團(tuán)隊(duì)在著名植物學(xué)雜志《Molecular Plant》發(fā)表丹參全基因組[36]，標(biāo)志著作為常用中藥丹參的遺傳密碼被破譯，為揭示丹參主要藥理活性成分丹參酮和丹參酚酸生物合成及其調(diào)控的分子機(jī)制，促進(jìn)丹參優(yōu)良品種選育提供了重要的遺傳背景基礎(chǔ)。該工作構(gòu)建了世界上首個(gè)藥用植物基因組框架圖，標(biāo)志著我國(guó)中藥研究進(jìn)入了基因組學(xué)時(shí)代。目前已有多個(gè)中草藥如印度大麻、赤靈芝、牛耳草、鐵皮石斛等完成了基因組測(cè)序。中草藥基因組研究的飛速發(fā)展為基因編輯技術(shù)在中草藥研究中的應(yīng)用帶來(lái)了極佳的時(shí)機(jī)和廣闊的前景。今后研究者們可以以丹參研究為模板，借鑒國(guó)外的植物基因組研究計(jì)劃的經(jīng)驗(yàn)，對(duì)中草藥在結(jié)構(gòu)基因組學(xué)、功能基因組學(xué)和生物信息學(xué)等方向展開(kāi)研究。在此基礎(chǔ)上，利用基因編輯技術(shù)開(kāi)展中藥藥效成分、藥材的生長(zhǎng)及抗性相關(guān)基因的研究和改造工作，結(jié)合先進(jìn)的育種方法，篩選出既保持“道地血統(tǒng)”，又優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗病的中藥材優(yōu)良品種。該工作既有利于實(shí)現(xiàn)中藥標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，使中藥質(zhì)量可控，又有利于解決當(dāng)前中藥材資源面臨的“斷糧”困境。

中藥藥材是現(xiàn)代藥物研發(fā)最大的遺傳信息資源之一。我國(guó)在該方面具有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)?！侗静菥V目》中記載了1 892種藥用植物，1995年出版的《中華本草》收集了8 000多種藥用植物，而且其中不乏很多名貴，稀缺的藥材如人參，蟲(chóng)草等。另有統(tǒng)計(jì)表明，我國(guó)中草藥已有12 000多種。基因編輯技術(shù)的成熟也為開(kāi)發(fā)這個(gè)藥物基因資源帶來(lái)了良機(jī)?；蚓庉嫾夹g(shù)在中藥資源的引入和應(yīng)用，將會(huì)為解決這一問(wèn)題帶來(lái)新的前景。通過(guò)基因編輯技術(shù)可以快速獲得藥材靶基因的突變或是導(dǎo)入異源基因，從而快速鑒定出該基因產(chǎn)物與藥理活性成分的相關(guān)性和重要性，發(fā)掘出新的或更高效的藥物相關(guān)基因，并可更清晰地闡明藥理活性成分生物合成及其調(diào)控的分子機(jī)制。

盡管將基因編碼技術(shù)引入中藥研究能為傳統(tǒng)中草藥帶來(lái)新發(fā)展和突破，但與當(dāng)今各個(gè)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用基因編碼技術(shù)相比，其在中藥研究中的應(yīng)用還處于起步階段，還有許多基礎(chǔ)工作有待完善。比如這一技術(shù)的應(yīng)用必須以完善的中藥基因資源為基礎(chǔ)，如果沒(méi)有對(duì)中藥特別是具有豐富藥理藥效學(xué)和臨床應(yīng)用價(jià)值的名貴中藥的基因資源的研究與開(kāi)發(fā)，基因技術(shù)體系的應(yīng)用必然大打折扣。此外，也不能盲目的為了中藥的基因而基因，浪費(fèi)大量的人力物力資源，應(yīng)有的放矢的將目標(biāo)集中在既具有重要臨床應(yīng)用價(jià)值的名貴或?yàn)l臨滅絕的中藥基因資源的研究與應(yīng)用上，為中藥現(xiàn)代化搭建良好的基礎(chǔ)技術(shù)平臺(tái)，讓現(xiàn)代基因技術(shù)更好的為傳統(tǒng)中藥的發(fā)展服務(wù)。

[致x]李連達(dá)院士對(duì)本文的選題、框架設(shè)計(jì)等給予了諸多寶貴意見(jiàn)。

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第4篇：基因治療的基本策略范文

生物化學(xué)是基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)課程中重要的基礎(chǔ)課,但由于其知識(shí)的抽象性、寬泛性,一度成為讓學(xué)生頭疼的科目之一,“生化、生化,生而難化”也成為了大家對(duì)生物化學(xué)的印象。然而,隨著生物化學(xué)在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中越來(lái)越普遍的應(yīng)用,其重要性也受到愈來(lái)愈多的關(guān)注。因此,必須要對(duì)傳統(tǒng)的生物化學(xué)授課方法進(jìn)行全面改革,達(dá)到全面培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新能力和綜合素質(zhì)的目標(biāo)。

1 生物化學(xué)與臨床學(xué)科之間的聯(lián)系

生物化學(xué)式研究生物體內(nèi)化學(xué)分子與化學(xué)反應(yīng)的科學(xué),它聯(lián)系著生物科學(xué)的許多分支,尤其是分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等,一度被公認(rèn)為生命科學(xué)的基礎(chǔ)和前沿學(xué)科。生物化學(xué)作為一門(mén)重要的基礎(chǔ)課程,與臨床有著緊密的聯(lián)系。無(wú)論是從分子水平探討疾病的病因、闡明疾病發(fā)生發(fā)展的機(jī)制,還是對(duì)疾病做出診斷、尋求防治等,都能運(yùn)用到生物化學(xué)的理論與技術(shù)。

2 目前專(zhuān)科生物化學(xué)教學(xué)中存在的問(wèn)題

2.1 生物化學(xué)教學(xué)不受重視。

以山東滕州棗莊科技職業(yè)學(xué)院為例,筆者發(fā)現(xiàn),生物化學(xué)被定義為考察課,課時(shí)相對(duì)較少。就開(kāi)課時(shí)間來(lái)看,在三年制的教學(xué)計(jì)劃中,生物化學(xué)于第一年下學(xué)期開(kāi)課,與生理學(xué)、病理學(xué)、病理學(xué)、病原生物與免疫學(xué)、局部解剖等學(xué)科基礎(chǔ)課以及計(jì)算機(jī)、英語(yǔ)等公共基礎(chǔ)課同期開(kāi)設(shè)。加之計(jì)算機(jī)與英語(yǔ)統(tǒng)考,生物化學(xué)的課時(shí)被很無(wú)奈的削減(約54-60學(xué)時(shí),其中還包括實(shí)驗(yàn)課10-16學(xué)時(shí))。由于課程的減少,教程的內(nèi)容難以完成,其效果可想而知,更不用談如何與臨床相聯(lián)系了。

2.2 教材更新速度較慢。

就目前山東滕州棗莊科技職業(yè)學(xué)院所采用的生物化學(xué)教材來(lái)看,其版本遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于本科教材,書(shū)中缺少很多相關(guān)內(nèi)容,如基因育基因組、朊病毒、癌基因與抑癌基因、腫瘤標(biāo)志物、基因診斷與基因治療等等。教材的落后,導(dǎo)致學(xué)生所接觸的知識(shí)遠(yuǎn)遠(yuǎn)更不上實(shí)際,直接影響其與臨床學(xué)科的結(jié)合,影響其在臨床學(xué)科上的應(yīng)用。

2.3 師資隊(duì)伍存在缺陷。

就山東滕州棗莊科技職業(yè)學(xué)院教授生物化學(xué)的教師隊(duì)伍來(lái)看,部分教師第一學(xué)歷并非出自醫(yī)學(xué)院校,而是來(lái)自綜合、師范等大學(xué)。這導(dǎo)致了教師隊(duì)伍中臨床醫(yī)學(xué)知識(shí)的缺乏,直接影響教師對(duì)教程中與臨床學(xué)科相關(guān)知識(shí)的講授,致使課程講授的不夠深入與透徹,更別談引入更多臨床應(yīng)用的實(shí)例。因此,將生物化學(xué)的教學(xué)與臨床學(xué)科結(jié)合顯得步履維艱。

2.4 教學(xué)方法滯后。

由于生物化學(xué)理論比較抽象,代謝反應(yīng)錯(cuò)綜復(fù)雜且相互聯(lián)系,大多數(shù)同學(xué)在學(xué)習(xí)該課程的過(guò)程中采取死記硬背的方式來(lái)應(yīng)付期末考試,并不能理解生物化學(xué)的意義。而在后面幾個(gè)學(xué)期學(xué)習(xí)診斷學(xué)、內(nèi)科學(xué)等學(xué)科時(shí)也沒(méi)有結(jié)合生物化學(xué)的理論知識(shí)來(lái)理解各種疾病與其癥狀及各項(xiàng)診斷指標(biāo)的聯(lián)系,進(jìn)入臨床實(shí)習(xí)后對(duì)生物化學(xué)的記憶更加所剩無(wú)幾,以至于只知道機(jī)械的看化驗(yàn)單而不明白各檢驗(yàn)指標(biāo)的真正涵義。

3 改革策略

3.1 適當(dāng)調(diào)整課程設(shè)置

學(xué)院應(yīng)當(dāng)重視起生物化學(xué)的教學(xué)地位,建立統(tǒng)一的大綱來(lái)對(duì)教學(xué)過(guò)程進(jìn)行參照與約束,適當(dāng)增大生物化學(xué)課程時(shí)間,調(diào)整其授課比例,對(duì)于學(xué)好、用好教材、完成生物化學(xué)教學(xué)目標(biāo)起到保證性的作用。

3.2 快速更新教材

專(zhuān)科生物化學(xué)教材版本少,更新慢。由于培養(yǎng)方向的不同,在章節(jié)方面,專(zhuān)科教材應(yīng)與本科有所區(qū)別,在保留傳統(tǒng)章節(jié)的基礎(chǔ)上,創(chuàng)立新的章節(jié)、補(bǔ)充新內(nèi)容。在教學(xué)內(nèi)容方面就是要增加新的知識(shí)點(diǎn),如基因、基因組和人類(lèi)基因組計(jì)劃,癌基因與抑癌基因、腫瘤標(biāo)志物、基因診斷與基因治療等,以加強(qiáng)與臨床學(xué)科應(yīng)用的聯(lián)系。

3.3 探索新的教學(xué)方法

在教學(xué)中將生物化學(xué)理論知識(shí)與臨床疾病相關(guān)知識(shí)相結(jié)合,達(dá)到融會(huì)貫通的效果。在講授生物化學(xué)知識(shí)時(shí)應(yīng)密切聯(lián)系臨床,如在講解正常的糖代謝的同時(shí)要引導(dǎo)學(xué)生分析可能會(huì)出現(xiàn)的疾病狀態(tài)下的血糖變化,并針對(duì)各種不同病因提出可應(yīng)用的生化指標(biāo)及檢測(cè)的意義。通過(guò)這種與臨床病例相結(jié)合的教學(xué)方式,使學(xué)生牢牢掌握生物化學(xué)的核心內(nèi)容,并是枯燥的理論趣味化、實(shí)際化,使生物化學(xué)的基礎(chǔ)教學(xué)與臨床應(yīng)用達(dá)到完美統(tǒng)一。

3.4 增強(qiáng)師資隊(duì)伍建設(shè)

生物化學(xué)教師平時(shí)備課時(shí)要注重病例的收集和疾病相關(guān)生化知識(shí)的積累,多與臨床醫(yī)師進(jìn)行交流,不斷完善和更新自身知識(shí)結(jié)構(gòu),實(shí)現(xiàn)生化基礎(chǔ)與臨床知識(shí)的統(tǒng)一。另外,要充分利用來(lái)自醫(yī)學(xué)院校生物化學(xué)教師臨床知識(shí)豐富的特點(diǎn),采取集體備課、研討教材、互通有無(wú)等方式達(dá)到優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)。

4 小結(jié)

第5篇：基因治療的基本策略范文

【關(guān)鍵詞】醫(yī)學(xué)分子生物學(xué);教;課程設(shè)置

【中圖分類(lèi)號(hào)】G424 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B 【文章編號(hào)】1006-1959(2009)10-0245-02

分子生物學(xué)是研究生物大分子的結(jié)構(gòu)、功能及基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)與調(diào)控的科學(xué),從分子水平探討生命現(xiàn)象的本質(zhì)。醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)是研究人體在正常和疾病狀態(tài)下生命活動(dòng)及其規(guī)律,從分子水平開(kāi)展人類(lèi)疾病的預(yù)防、診斷和治療研究的一門(mén)科學(xué)。分子生物學(xué)已成為生命科學(xué)領(lǐng)域的重要基礎(chǔ)學(xué)科和前沿學(xué)科,廣泛滲透到醫(yī)學(xué)各學(xué)科領(lǐng)域,推動(dòng)了醫(yī)學(xué)各學(xué)科的發(fā)展,使醫(yī)學(xué)科學(xué)從宏觀到微觀,從整體、細(xì)胞水平逐步進(jìn)入了分子水平。醫(yī)學(xué)各專(zhuān)業(yè)的學(xué)生,有必要很好地學(xué)習(xí)有關(guān)分子生物學(xué)基礎(chǔ)理論,掌握必要的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù),了解當(dāng)今分子生物學(xué)的研究進(jìn)展。加強(qiáng)醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)的教學(xué),對(duì)培養(yǎng)具有廣博知識(shí)的復(fù)合型醫(yī)學(xué)高級(jí)人才具有及其重要的意義。近幾年來(lái),我們對(duì)醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)的教學(xué)進(jìn)行了一些探索,取得較好的效果,積累了一些經(jīng)驗(yàn),特總結(jié)如下。

1 優(yōu)化課程設(shè)置

醫(yī)學(xué)教育的特點(diǎn)決定了醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)不同于綜合性大學(xué)、農(nóng)林、師范院校的課程,醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)偏重于與臨床的結(jié)合,但又不能忽略基礎(chǔ)知識(shí)的強(qiáng)化。正確處理分子生物學(xué)基礎(chǔ)和臨床應(yīng)用的教學(xué)是解決醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)教學(xué)的關(guān)鍵[1]。為了和生物化學(xué)教學(xué)內(nèi)容銜接,本課程不再講授基因信息傳遞,僅講授基因組的結(jié)構(gòu)與功能,補(bǔ)充介紹網(wǎng)絡(luò)生物信息資源。著重介紹分子生物學(xué)的基本技術(shù)和新技術(shù),如PCR和各種衍生的PCR技術(shù)、DNA序列測(cè)定、分子雜交、基因工程、基因芯片等,并兼顧介紹一些新的技術(shù)如RNAi等。聯(lián)系臨床介紹癌基因與抑癌基因、基因診斷與基因治療等。教師結(jié)合自身的科研經(jīng)歷展開(kāi)授課,使課堂教學(xué)生動(dòng),給學(xué)生留下的印象深刻,讓學(xué)生學(xué)有所獲、學(xué)有所樂(lè)。

分子生物學(xué)是一門(mén)技術(shù)性很強(qiáng)的學(xué)科,如果只學(xué)習(xí)理論知識(shí)而不做實(shí)驗(yàn),往往如空中樓閣,不知所云[2]?在堅(jiān)持醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)理論教學(xué)的同時(shí),通過(guò)開(kāi)設(shè)相關(guān)實(shí)驗(yàn)將理論教學(xué)與實(shí)踐操作有機(jī)結(jié)合,有助于加深對(duì)醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)理論的理解,增強(qiáng)學(xué)生的動(dòng)手能力,使學(xué)生在教學(xué)過(guò)程中體會(huì)到所學(xué)知識(shí)的應(yīng)用價(jià)值,提高學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣。我們?cè)诒ＷC總課時(shí)36學(xué)時(shí)不變的情況下,調(diào)整了教學(xué)時(shí)數(shù)的分配,壓縮理論課時(shí),增加實(shí)驗(yàn)課時(shí)。將理論課由28學(xué)時(shí)減少到18學(xué)時(shí),實(shí)驗(yàn)課由8h增加到18學(xué)時(shí)。將教師的科研成果應(yīng)用于實(shí)踐教學(xué)中,利用獲得的重組DNA克隆作為實(shí)驗(yàn)材料,連續(xù)開(kāi)設(shè)了質(zhì)粒DNA的提取、感受態(tài)細(xì)胞的制備、質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化和篩選、核酸的體外擴(kuò)增、DNA的瓊脂糖凝膠電泳共六個(gè)實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)中著重介紹每個(gè)技術(shù)的原理和應(yīng)用,利用實(shí)驗(yàn)步驟中間隔的等待時(shí)間講解一些背景知識(shí)和需要補(bǔ)充的理論知識(shí),使實(shí)驗(yàn)課內(nèi)容充實(shí)而飽滿。實(shí)驗(yàn)完成后進(jìn)行總結(jié),分析成功的經(jīng)驗(yàn)和存在的問(wèn)題,找到實(shí)驗(yàn)失敗的可能原因,有利于學(xué)生學(xué)習(xí)知識(shí)和積累經(jīng)驗(yàn),為今后的臨床及科研工作奠定基礎(chǔ)。

2 開(kāi)展雙語(yǔ)教學(xué)

雙語(yǔ)教學(xué)是我國(guó)高等教育與國(guó)際接軌,迎接新世紀(jì)挑戰(zhàn)和教育改革發(fā)展的必然趨勢(shì),也是當(dāng)前教學(xué)改革的重點(diǎn)和熱點(diǎn)[3]。分子生物學(xué)進(jìn)展極為迅速,其中大多數(shù)信息儲(chǔ)存在英文資料和文獻(xiàn)中,如果采用英文資料和課件進(jìn)行講授,學(xué)生可更準(zhǔn)確的把握其含義,并且可及時(shí)獲得分子生物學(xué)的最新進(jìn)展,有助于高素質(zhì)復(fù)合型高素質(zhì)人才的培養(yǎng)。我們?cè)趨⒖枷嚓P(guān)專(zhuān)業(yè)教材的基礎(chǔ)上,選定了DNA序列測(cè)定、核酸分子雜交、PCR三章內(nèi)容進(jìn)行了雙語(yǔ)教學(xué),制作了中文和英文兩個(gè)課件,教師采用英文課件授課,學(xué)生利用中英文兩個(gè)課件進(jìn)行復(fù)習(xí),使學(xué)生既掌握了基本技術(shù),又強(qiáng)化了自身的英文水平,教師的整體教學(xué)水平也得到了提高。

3 完善考核體系

考試是督促學(xué)生學(xué)習(xí)的一個(gè)重要手段,考試目的是檢測(cè)教育教學(xué)的效果。醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)是一門(mén)專(zhuān)業(yè)限選課,由于課時(shí)少,內(nèi)容多,進(jìn)展快,學(xué)生學(xué)習(xí)存在一定困難,有些學(xué)生并未引起足夠的重視。如果只注重閉卷考試,會(huì)導(dǎo)致學(xué)生死記教材,不注重查閱文獻(xiàn)和了解新進(jìn)展,達(dá)不到創(chuàng)新性教育的目的。如果完全放棄閉卷考試,有些學(xué)生會(huì)放松對(duì)基本理論的學(xué)習(xí),也達(dá)不到掌握基本知識(shí)和基本技能的效果[4]。為此,我們結(jié)合課程的教學(xué)特點(diǎn),制訂了閉卷考試、實(shí)踐考核與撰寫(xiě)綜述相結(jié)合的醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)考核方案,規(guī)定閉卷考試成績(jī)總成績(jī)的70% ,文獻(xiàn)綜述占10% ,實(shí)驗(yàn)成績(jī)占15%,平時(shí)成績(jī)占5%,將培養(yǎng)學(xué)生動(dòng)手能力和思維能力全面地體現(xiàn)在考核成績(jī)中。并且在第一次開(kāi)課就提出課程的考核方式和考核要求,讓學(xué)生在學(xué)習(xí)上引起足夠的重視。為防止學(xué)生直接下載或復(fù)印別人的同類(lèi)文章,教師限定寫(xiě)作內(nèi)容,稿件一律用手寫(xiě),并附5篇以上文獻(xiàn)(含英文文獻(xiàn)2篇以上),抄襲稿件計(jì)零分。這種綜合考核方式使學(xué)生既能掌握醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)的知識(shí)體系,又能準(zhǔn)確把握醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)的脈絡(luò)和發(fā)展動(dòng)態(tài),熟悉互聯(lián)網(wǎng)資源的查詢和利用,提高了學(xué)生的文獻(xiàn)查閱能力和英語(yǔ)水平,從而改變學(xué)生“讀死書(shū)、死讀書(shū)”的現(xiàn)狀。

經(jīng)過(guò)幾年的教學(xué)探索,我們積累了一些教學(xué)經(jīng)驗(yàn),初步建立了一套適于醫(yī)學(xué)生的醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)教學(xué)體系,收到了較好的教學(xué)效果。當(dāng)然,現(xiàn)有的教學(xué)中仍存在一些不足,需要進(jìn)一步開(kāi)展教學(xué)改革。我們將充分利用多媒體教學(xué)資源,擴(kuò)大雙語(yǔ)教學(xué)內(nèi)容,不斷豐富和更新教學(xué)體系,創(chuàng)新教學(xué)手段,增加分子生物學(xué)軟件使用的培訓(xùn),適當(dāng)介紹國(guó)內(nèi)外最新理論和技術(shù),緊跟分子生物學(xué)不斷發(fā)展的步伐,以提高學(xué)生綜合素質(zhì)為目的,逐步提高教學(xué)質(zhì)量。

參考文獻(xiàn)

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[3] 許曉源.醫(yī)學(xué)院校英漢雙語(yǔ)教學(xué)的探討[M].遼寧行政學(xué)院學(xué)報(bào),2009,11(1): 80-81

第6篇：基因治療的基本策略范文

1各種干細(xì)胞移植在心血管領(lǐng)域的研究

1.1胚胎干細(xì)胞(Embryonic Stem Cells，ESCs)1994年Soonpaa等[1]首次將小鼠的胚胎干細(xì)胞移植給成熟的心臟，發(fā)現(xiàn)移植的細(xì)胞不但能增生和存活，還與宿主之間形成了超微結(jié)構(gòu)連接。但人胚胎細(xì)胞移植卻面臨著諸如胚胎細(xì)胞來(lái)源、道德倫理等問(wèn)題。另外，胚胎干細(xì)胞的轉(zhuǎn)化條件尚不明了，在體外進(jìn)行定向誘導(dǎo)還具有相當(dāng)?shù)碾S意性。

1.2自體干細(xì)胞因無(wú)免疫排斥及倫理道德等優(yōu)點(diǎn)，而具有更為廣闊的應(yīng)用前景。

1.2.1自體骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞是成體骨骼肌中未分化的成肌細(xì)胞，參與骨骼肌損傷后形態(tài)和功能的恢復(fù)。Jain[2]研究證實(shí)移植組的心室重建得到緩解，心功能明顯改善。該細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)是形成的骨骼肌纖維在損傷區(qū)存活時(shí)間長(zhǎng)，存活能力強(qiáng)。但這種細(xì)胞數(shù)量極少，不易獲得。另外，移植區(qū)與宿主心肌間的收縮常不一致，易引起心律失常。

1.2.2自體心臟干細(xì)胞近來(lái)有觀點(diǎn)認(rèn)為在心臟中存在具有組織特異性的干細(xì)胞，稱為心臟干細(xì)胞。Sakai等[3]在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證實(shí)自體心房肌細(xì)胞移植能改善受損心臟的功能。理論上說(shuō)，該細(xì)胞的移植要優(yōu)于其他干細(xì)胞。但對(duì)于擴(kuò)張型心肌病這種全心病變來(lái)說(shuō)，只能考慮其他細(xì)胞的移植。

1.3成體干細(xì)胞(Adult stem cells，ASCs)上世紀(jì)90年代末以來(lái)，在Nature、Science、Cell均有報(bào)道ASC可分化為其他系列的細(xì)胞，即ASC具有“可塑性”或“橫向分化”潛能。2002年，Nature刊發(fā)了Verfaillie[4]教授小組的研究證實(shí)在成體的許多組織中余存著一種稀有數(shù)量的胚胎原始干細(xì)胞，其表達(dá)ESC的遺傳。所謂的ASC "可塑性"很可能是這些細(xì)胞所為，這提示ASC與ESC可能存在相似性和同源性。

1.3.1成人干細(xì)胞主要分為造血干細(xì)胞(Hematopoietic Stem Cells，HSCs)和間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchyrnal Stem Cells，MSCs)。此外，內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial Progenitor Cells， EPCs)等也屬于成體干細(xì)胞。

1.3.2造血干細(xì)胞2001年Orlic[5]等人在Nature上著文，稱造血干細(xì)胞直接注射心梗區(qū)可轉(zhuǎn)化為心肌細(xì)胞[5]，結(jié)果引起了廣泛關(guān)注和研究。然而，2004年4月第428期Nature上同時(shí)發(fā)表了兩篇沒(méi)有重復(fù)出Orlic等人研究結(jié)果的論文報(bào)道。

1.3.3骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞Wakitani等[6]首先證實(shí)MSCs可分化為骨骼肌細(xì)胞。繼而人們想到將骨骼肌細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞。1999年，Makino等人[7]首次報(bào)道在體外利用5-氮雜胞苷(5-aza)誘導(dǎo)MSCs分化為心肌細(xì)胞。Wang等[8]用同基因成年大鼠作為供體及受體模擬自體移植，并用DAPI染色標(biāo)記。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，移植后各時(shí)相點(diǎn)均可見(jiàn)到DAPI陽(yáng)性的存活細(xì)胞。然而，由于移植細(xì)胞在宿主身上的生存力差，長(zhǎng)期效果不理想，也限制了其應(yīng)用。鑒于此，Mangi等人[9]將小鼠MSCs進(jìn)行基因改造，以病毒為載體，在該細(xì)胞中加入1個(gè)單肽Aktl，后者能阻斷細(xì)胞凋亡信號(hào)。將這些改造的干細(xì)胞注射到小鼠心臟的梗死部位后，Aktl被激活，并使干細(xì)胞長(zhǎng)期存活。該研究還發(fā)現(xiàn)，移植的效果呈劑量依賴性。

1.3.4血管內(nèi)皮祖細(xì)胞1997年Takayuki等[10]在Science上報(bào)道EPCs分離成功，并可用于體內(nèi)血管新生(Angiogenesis)。當(dāng)時(shí)提出的EPCs被認(rèn)為是假定的。近來(lái)隨著干細(xì)胞研究的深入，EPCs的存在已基本確認(rèn)。Maeda等[11]將EPCs接種于移植的血管，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞主要集中在血管外膜與內(nèi)膜表面，內(nèi)膜表面的移植祖細(xì)胞能很好地附著，在血管腔面發(fā)育形成內(nèi)皮細(xì)胞。該研究證實(shí)，EPCs具有促進(jìn)血管新生的作用。

2臨床研究

干細(xì)胞移植為心血管疾病的治療開(kāi)辟了一條新的途徑，已由動(dòng)物實(shí)驗(yàn)逐步應(yīng)用于小樣本臨床治療。2001年9月Strauer[12]等在世界上進(jìn)行了首例自體骨髓干細(xì)胞移植治療急性心梗的實(shí)驗(yàn)，他們將該干細(xì)胞在PTCA中經(jīng)導(dǎo)管植入到梗死相關(guān)動(dòng)脈，10周后，通過(guò)SPECT、超聲心動(dòng)圖和核素心室造影顯示心肌梗死范圍減少，EF升高，舒張末壓降低。2003年，Perin等[13]報(bào)道借助NOGA系統(tǒng)經(jīng)心內(nèi)膜對(duì)14例因嚴(yán)重心肌缺血致心衰患者進(jìn)行自體骨髓干細(xì)胞移植，術(shù)后2個(gè)月，核素顯像顯示移植組患者的左室功能有明顯改善；術(shù)后4個(gè)月，EF從20%上升到了29%，心臟收縮末期容積亦有顯著下降。

3展望

目前，細(xì)胞移植的研究?jī)H限于單種細(xì)胞的移植，將2種或2種以上細(xì)胞聯(lián)合移植，以及和基因工程結(jié)合的研究還比較少。在心臟缺血時(shí)，不但有血供障礙，還有心肌損傷。我們?cè)贛SCs的基礎(chǔ)上聯(lián)合EPCs移植，一方面，植入的MSCs替代壞死心肌，改善心功能；另一方面，EPCs通過(guò)再血管化改善心肌血供。另外，還可以對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行基因修飾，然后再進(jìn)行細(xì)胞移植。將基因治療和干細(xì)胞治療結(jié)合起來(lái)能夠大大提高控制細(xì)胞行為的能力。值得注意的是干細(xì)胞動(dòng)員療法與干細(xì)胞移植相比具有無(wú)創(chuàng)傷、方法簡(jiǎn)便、易開(kāi)展的特點(diǎn)，臨床應(yīng)用更具優(yōu)勢(shì)，近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)粒細(xì)胞集落刺激因子具有心臟保護(hù)作用，能動(dòng)員自體骨髓源干細(xì)胞遷移到心肌梗死部位，修復(fù)受損心臟。因此,利用細(xì)胞因子動(dòng)員干細(xì)胞修復(fù)受損的心肌也有可能是干細(xì)胞治療的新策略。

參考文獻(xiàn)

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7Makino S, Fukuda K, Miyoshi S. Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells in vivo. J Clin Invest, 1999, 103(5): 697-705.

8Wang JS, Shum-Tim D, Galipeau J. Marrow stromal cells for cellular cardiomyoplasty.feasibility and potential clinical advantages. J Thorac Cardiovasc Surg, 2000, 120(5): 999-1005.

9Mangi AA, Noiseux N, Kong D. Mesenchymal stem cells modified with Akt prevent remodeling and restore performance of infarcted hearts. Nat Med,2003 ,9(9): 1195-2001.

10Asahara T, Murohara T, Sullivan A. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis .Science, 1997, 275(5320): 964-967.

11Maeda M, Fukui A, Nakamura T. Progenitor endothelial cells on vascular grafts.An ultrastructural study. J Biomed Mater Res, 2000, 51(1): 55-60.

第7篇：基因治療的基本策略范文

1作用溫和緩慢

中藥作用強(qiáng)度總體上是溫和緩慢的，中藥多矢量作用合力的微量累計(jì)是中藥治病的優(yōu)勢(shì)，也是其副作用較輕較少的原因。由于一首復(fù)方中各有效物質(zhì)的濃度相對(duì)于單一的化學(xué)藥物來(lái)說(shuō)較低，進(jìn)入人體后就更低了。而中藥這種多種微量單體對(duì)眾多環(huán)節(jié)的微調(diào)，使機(jī)體歸復(fù)于平衡是中藥治病的重要基礎(chǔ)。但新藥藥效標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)對(duì)此是否定的，至少是不完整的。由于中藥的這些特點(diǎn)，我們唯一可做的就是盡可能采用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)，得出令人信服的科研結(jié)果，進(jìn)而有權(quán)重新制定或完善新藥評(píng)價(jià)體系。

2現(xiàn)代生物技術(shù)與中藥作用機(jī)制的發(fā)現(xiàn)

隨著生命科學(xué)的發(fā)展，尤其是分子生物學(xué)在各學(xué)科的滲入，中醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)研究深入到了分子、基因、蛋白質(zhì)組水平。現(xiàn)代藥理研究表明，中藥作用原理與其生物活性成分調(diào)控基因表達(dá)有關(guān)[5]。研究發(fā)現(xiàn)：對(duì)即刻早期基因（IEGs）的表達(dá)產(chǎn)物是細(xì)胞核內(nèi)的第三信使，在細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮重要的生理作用，共有c-fos、c-jun、c-myc、c-egr4個(gè)家族。c-jun基因表達(dá)基因轉(zhuǎn)錄生成mRNA，核糖體以mRNA為模板翻譯成c-jun蛋白，c-jun蛋白與同時(shí)表達(dá)的c-fos蛋白通過(guò)亮氨酸拉鏈區(qū)結(jié)合構(gòu)成異構(gòu)二聚體AP-1。AP-1通過(guò)與靶基因promoter區(qū)TGAC/GTCA序列結(jié)合，刺激靶基因表達(dá)[6]。任永欣等在國(guó)內(nèi)首次復(fù)制了硝酸甘油型試驗(yàn)性偏頭痛動(dòng)物模型，并用免疫組化方法觀察IEGs，c-fos，c-jun的表達(dá)，結(jié)果顯示：硝酸甘油型試驗(yàn)性偏頭痛大鼠腦干、下丘腦c-fos、c-jun基因表達(dá)明顯增強(qiáng)，復(fù)方中藥頭風(fēng)飲能顯著抑制偏頭痛大鼠腦干、下丘腦c-fos、c-jun基因的增強(qiáng)表達(dá)，與對(duì)照組比較差異有顯著性[7]。還有對(duì)神經(jīng)肽相關(guān)基因表達(dá)的影響，對(duì)凋亡相關(guān)基因的影響等等。人類(lèi)基因組計(jì)劃（HGP）為某一疾病多基因表達(dá)調(diào)控的研究帶來(lái)了機(jī)會(huì)，通過(guò)HGP篩選和分離出每種疾病相關(guān)的致病基因，再以其作為藥物作用靶標(biāo)研究中藥作用的分子機(jī)制，這可能是未來(lái)中藥藥理研究發(fā)展的趨勢(shì)之一。另外，基因芯片技術(shù)以其檢測(cè)迅速、分辨率高、檢出基因多而成為研究的先進(jìn)方法之一。生物芯片主要包括基因芯片和多肽芯片。生物芯片技術(shù)是指將大量（每平方厘米點(diǎn)陣密度高于400）探針?lè)肿樱―NA、RNA、多肽等）固定于支持物（膜、玻片、硅片等）上后與標(biāo)記的樣品分子雜交，通過(guò)檢測(cè)每個(gè)探針?lè)肿拥碾s交信號(hào)強(qiáng)度，對(duì)樣品分子進(jìn)行定性、定量和結(jié)構(gòu)分析，其原理是利用生物大分子具有特異性互相識(shí)別能力，具快速、準(zhǔn)確、自動(dòng)化的優(yōu)點(diǎn)。利用基因芯片及mRNA差異顯示技術(shù)從分子水平探討中藥對(duì)疾病多基因治療作用機(jī)理，應(yīng)成為今后研究的主要方向之一。

3蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在新醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用

所謂蛋白質(zhì)組是指一個(gè)細(xì)胞或一個(gè)組織基因組作表達(dá)的全部蛋白質(zhì)，它具有整體性、動(dòng)態(tài)性、系統(tǒng)性的特點(diǎn)。一方面，強(qiáng)調(diào)蛋白質(zhì)組是對(duì)應(yīng)于一個(gè)基因組的全部蛋白質(zhì)所構(gòu)成的整體；另一方面，明確提出蛋白質(zhì)組還是一個(gè)在時(shí)間和空間上都動(dòng)態(tài)變化的整體。蛋白質(zhì)組的研究流程大體上分為分離、鑒定、分析3個(gè)步驟[8]。即先從組織或細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)，進(jìn)行雙向電泳實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的分離，含多種蛋白質(zhì)的樣品展開(kāi)成為有近千個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的繁星圖；然后進(jìn)行蛋白質(zhì)樣品的顯色，對(duì)不同疾病、不同證候的蛋白質(zhì)與對(duì)照樣品進(jìn)行比較，尋找具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義和豐度差異的蛋白點(diǎn)；切下待分析的蛋白點(diǎn)，使用胰蛋白酶消化；接著對(duì)消化后得到的多肽片斷進(jìn)行生物質(zhì)譜分析測(cè)定，得到肽指紋圖譜；最后，通過(guò)在數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定及功能分析，利用生物信息學(xué)的方法進(jìn)行比較研究。蛋白質(zhì)組學(xué)是從整體的角度，分析細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)變化著的蛋白質(zhì)組成成分、表達(dá)水平和修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間相互作用和聯(lián)系，揭示蛋白質(zhì)功能與細(xì)胞生命活動(dòng)規(guī)律的科學(xué)。其不僅研究蛋白質(zhì)的構(gòu)象，更重要的是進(jìn)一步闡明不同蛋白質(zhì)、不同構(gòu)象功能的表現(xiàn)。它不是單純對(duì)蛋白質(zhì)的個(gè)體進(jìn)行研究，而是對(duì)人體的整個(gè)蛋白質(zhì)，即在蛋白質(zhì)組的基礎(chǔ)上進(jìn)行研究。蛋白質(zhì)是機(jī)體生物功能最終的執(zhí)行分子，單個(gè)蛋白質(zhì)的研究方式亦無(wú)法滿足后基因時(shí)代的要求。這是因?yàn)椋荷F(xiàn)象的發(fā)生往往是多因素的，必然涉及多個(gè)蛋白質(zhì)；多個(gè)蛋白質(zhì)的參與是交織成網(wǎng)絡(luò)或平行發(fā)生，或呈級(jí)聯(lián)因果；執(zhí)行生理功能時(shí)的蛋白質(zhì)表現(xiàn)是多樣的、動(dòng)態(tài)的。因此要對(duì)生命的復(fù)雜活動(dòng)有全面和深入的認(rèn)識(shí)，必然要在整體、動(dòng)態(tài)、網(wǎng)絡(luò)的水平上對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行研究。

4蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)與中醫(yī)藥發(fā)展

中醫(yī)藥研究一直在謀求現(xiàn)代化發(fā)展，謀求為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)有所闡釋而走向世界。但在此之前對(duì)單個(gè)分子的研究，很難反映中醫(yī)學(xué)的“整體觀念”和中藥作用“整體調(diào)節(jié)”的最基本特征。蛋白質(zhì)組學(xué)研究時(shí)代的到來(lái)，為中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展帶來(lái)了新的契機(jī)。蛋白質(zhì)組學(xué)的“整體、動(dòng)態(tài)、網(wǎng)絡(luò)”的特點(diǎn)，與中醫(yī)理論“整體觀念”、“辨證施治”和中藥作用“整體調(diào)節(jié)”，“多層次、多靶點(diǎn)”調(diào)節(jié)等思想不謀而合。利用功能蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和策略，分析中醫(yī)證候及經(jīng)中藥處理過(guò)的組織、細(xì)胞或體液表達(dá)的蛋白質(zhì)組，并比較處理前后蛋白質(zhì)表達(dá)差異、蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)及相互作用的變化，系統(tǒng)地對(duì)證候本質(zhì)及中藥的多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)調(diào)整作用機(jī)理進(jìn)行研究，最終揭示證候的物質(zhì)基礎(chǔ)及中藥作用和配伍規(guī)律。目前中醫(yī)藥蛋白質(zhì)組學(xué)研究主要集中在中藥藥理研究，單味中藥或復(fù)方的藥效和藥理研究是中藥作用研究的核心。利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究治療前后的蛋白質(zhì)譜變化，在整體水平上評(píng)價(jià)中藥藥效，揭示中藥作用的靶點(diǎn)、作用環(huán)節(jié)和作用過(guò)程，力求闡明中藥多靶點(diǎn)、多層次作用的分子機(jī)理。文獻(xiàn)檢索結(jié)果顯示，目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究主要涉及少量中藥復(fù)方和少量中藥單體的研究。如苗蘭等研究血府逐瘀湯對(duì)氣滯血瘀證模型大鼠血清蛋白質(zhì)組表達(dá)的影響，經(jīng)雙向電泳分離血清總蛋白，并行圖像分析比較，發(fā)現(xiàn)血府逐瘀湯可影響7個(gè)蛋白點(diǎn)差異表達(dá)，分析可能與其作用機(jī)理相關(guān)[9]。申定珠等采用雙向凝膠電泳分離健胃愈瘍顆粒處理組和未處理組大鼠胃組織的總蛋白，結(jié)合圖像分析、質(zhì)譜鑒定和數(shù)據(jù)庫(kù)搜查，發(fā)現(xiàn)處理組有12個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)變化，且大多數(shù)蛋白質(zhì)與潰瘍復(fù)發(fā)的形成、生長(zhǎng)、凋亡及免疫相關(guān)[10]。運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)的思路和方法研究中醫(yī)藥理論，雖然已取得了一定的進(jìn)展，但就實(shí)驗(yàn)研究方面來(lái)看，依然存在明顯的不足。具體表現(xiàn)在：（1）相當(dāng)部分研究?jī)H停留在蛋白質(zhì)成分分離和差異蛋白點(diǎn)顯示，未進(jìn)一步采用質(zhì)譜等鑒定分析，未對(duì)差異靶點(diǎn)之間進(jìn)行生物學(xué)分析，或未對(duì)差異靶點(diǎn)的確切意義進(jìn)行研究，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果的應(yīng)用價(jià)值受到影響。（2）研究結(jié)果大多為平行發(fā)生或晚期事件，幾乎所有試驗(yàn)報(bào)道均未證實(shí)蛋白質(zhì)差異表達(dá)是必要的早期事件。（3）大多數(shù)研究缺乏必要的對(duì)照組。（4）對(duì)表達(dá)豐度較低的重要蛋白質(zhì)組的研究不足，對(duì)亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組的研究未見(jiàn)報(bào)道。針對(duì)上述問(wèn)題，我國(guó)藥學(xué)工作者應(yīng)關(guān)注生物醫(yī)學(xué)研究進(jìn)展，了解更多的生物技術(shù)；利用各種生物學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)差異蛋白質(zhì)進(jìn)行信息學(xué)分析，初步預(yù)測(cè)差異蛋白質(zhì)之間的相互聯(lián)系及可能參與的信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)；在研究中加設(shè)對(duì)照組，盡可能排除藥物或方法造成的干擾；對(duì)重要的差異蛋白質(zhì)作進(jìn)一步深入的研究，適時(shí)引入基因過(guò)表達(dá)或RNA干擾，或反義核酸技術(shù)，以明確差異蛋白質(zhì)在中藥調(diào)節(jié)中的必要作用；以蛋白質(zhì)組學(xué)篩選研究為基礎(chǔ)，利用系統(tǒng)生物學(xué)的思路和技術(shù)，對(duì)具有確切作用的重要靶蛋白進(jìn)行更深入的中藥相關(guān)研究；對(duì)于蛋白質(zhì)檢測(cè)，可根據(jù)需要靈活采用不同分辨率的染色技術(shù)；由于中藥作用多靶點(diǎn)、多層次的特點(diǎn)，在中醫(yī)藥蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，極可能篩選出某些未能確知生物學(xué)功能的差異蛋白質(zhì)，再根據(jù)研究結(jié)果提示，進(jìn)行生物學(xué)作用鑒定，有可能成為中醫(yī)藥學(xué)對(duì)生命科學(xué)研究的重要貢獻(xiàn)。所以中醫(yī)藥蛋白質(zhì)組學(xué)研究不僅在于發(fā)現(xiàn)種種現(xiàn)象，更應(yīng)努力揭示現(xiàn)象的本質(zhì)，重視持續(xù)的深入研究，由點(diǎn)到面，由面及點(diǎn)，交叉整合蛋白質(zhì)組學(xué)、分子生物學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)，推動(dòng)中醫(yī)藥研究的現(xiàn)代化。

5結(jié)論與展望

第8篇：基因治療的基本策略范文

關(guān)鍵詞 干細(xì)胞治療 安全性 有效性 合法

干細(xì)胞是一類(lèi)具有不同分化潛能，并在非分化狀態(tài)下自我更新的細(xì)胞。用于治療的干細(xì)胞主要包括成體干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞以及誘導(dǎo)的多能性干細(xì)胞。技術(shù)人員可以應(yīng)用人自體或異體來(lái)源的干細(xì)胞經(jīng)體外分離、純化、培養(yǎng)、擴(kuò)增、修飾、誘導(dǎo)分化、凍存及凍存后的復(fù)蘇等過(guò)程后回輸（或植入）人體，用于疾病預(yù)防和治療。干細(xì)胞預(yù)防和治療疾病的預(yù)期有望優(yōu)于現(xiàn)有的手段，尤其對(duì)于尚無(wú)有效干預(yù)措施的疾病，以及威脅生命和嚴(yán)重影響生存質(zhì)量的重大疾病。正是由于這個(gè)重大發(fā)現(xiàn)，在全世界掀起了一股干細(xì)胞研究熱潮，并迅速同時(shí)形成了新興的干細(xì)胞產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)。但是有一些干細(xì)胞企業(yè)為追求暴利而漠視科學(xué)發(fā)展的客觀規(guī)律以及社會(huì)倫理與法律問(wèn)題。干細(xì)胞這項(xiàng)新技術(shù)是一柄雙刃劍，需要法律對(duì)其進(jìn)行規(guī)制，才能切實(shí)保護(hù)患者的合法權(quán)益，真正造福人類(lèi)。

1干細(xì)胞治療進(jìn)展

干細(xì)胞能夠分化為不同類(lèi)型的細(xì)胞，成為了人類(lèi)的一種“修復(fù)元件”。可以通過(guò)注射干細(xì)胞制劑治療疾病，比方說(shuō)修復(fù)受損的神經(jīng)系統(tǒng)，恢復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)的功能，治愈因神經(jīng)細(xì)胞受損導(dǎo)致的癱瘓。干細(xì)胞也可分化成新的胰腺細(xì)胞分泌胰島素治療糖尿病。從理論上講，干細(xì)胞有望治愈用傳統(tǒng)方法無(wú)法治愈的疾病，如糖尿病、老年癡呆癥、心臟衰竭、紅斑狼瘡、黃斑變性、類(lèi)風(fēng)濕、惡性腫瘤等疾病。因此干細(xì)胞似乎成了萬(wàn)能細(xì)胞，受到醫(yī)療界高度重視。2009年1月23日，美國(guó)Geron公司胚胎干細(xì)胞用于脊髓損傷被FDA批準(zhǔn)用于臨床試驗(yàn)。（這是美國(guó)首次對(duì)胚胎干細(xì)胞臨床研究發(fā)放通行證）。2010年3月，美國(guó)Advanced Cell Technology公司宣布用于治療少年型黃斑變性的胚胎干細(xì)胞療法“MA09-hRPE”被FDA批準(zhǔn)臨床試驗(yàn)，獲得了FDA授予孤兒藥地位（FDA批準(zhǔn)的第二項(xiàng)干細(xì)胞療法）。2011年1月3日，美國(guó)Advanced Cell Technology公司宣布用于治療老年黃斑變性的胚胎干細(xì)胞療法被FDA批準(zhǔn)臨床試驗(yàn)。2010年6月，Osiris Therapeutics公司的Prochymal 在三種疾病（克羅恩病、預(yù)防骨關(guān)節(jié)炎、心肌損傷）治療中完成三期臨床試驗(yàn)。2010年11月，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院批復(fù)有11種干細(xì)胞進(jìn)入FDA審批程序，并稱近期還有30種干細(xì)胞陸續(xù)進(jìn)入FDA審批。中國(guó)在這方面比較落后，目前還從沒(méi)有批準(zhǔn)過(guò)胚胎干細(xì)胞制劑治療技術(shù)的臨床試驗(yàn)。

干細(xì)胞治療技術(shù)的美好愿景刺激了干細(xì)胞產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。我國(guó)雖然尚未批準(zhǔn)胚胎干細(xì)胞技術(shù)的臨床試驗(yàn)，但是從事干細(xì)胞技術(shù)研究開(kāi)發(fā)的科研機(jī)構(gòu)或者企業(yè)也為數(shù)不少，遍布全國(guó)各地。有北京經(jīng)開(kāi)區(qū)的漢氏聯(lián)合干細(xì)胞研究院、上海浦東新區(qū)的上海科醫(yī)聯(lián)創(chuàng)生物科技有限公司、上海市長(zhǎng)寧區(qū)的臻景醫(yī)療公司、廣州市生物島的軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院華南干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究中心、深圳市高新科技產(chǎn)業(yè)園的深圳市北科生物科技有限公司、中國(guó)濱海新區(qū)華夏干細(xì)胞聯(lián)盟、濱海新區(qū)科技園的昂賽細(xì)胞基因工程公司、無(wú)錫的奧斯達(dá)干細(xì)胞有限公司、湖南長(zhǎng)沙市麓谷高新區(qū)人類(lèi)干細(xì)胞國(guó)家工程研究中心等。并且也有上市公司，如滬深兩市中唯一家以干細(xì)胞產(chǎn)業(yè)為主營(yíng)業(yè)務(wù)的上市公司中源協(xié)和干細(xì)胞生物工程股份公司（股票代碼：600645）等。這些企業(yè)形成了一個(gè)新興的干細(xì)胞行業(yè)。

2干細(xì)胞治療的安全性、有效性

干細(xì)胞制劑無(wú)論是作為藥品還是醫(yī)療技術(shù)在應(yīng)用于人體臨床治療之前，都必須證明它的安全性、有效性。而這個(gè)驗(yàn)證過(guò)程漫長(zhǎng)而復(fù)雜，首先是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、其次是第三方檢測(cè)、然后再是臨床試驗(yàn)。只有證明安全性與有效性后才能應(yīng)用于臨床治療。

英國(guó)《每日郵報(bào)》報(bào)道了一個(gè)典型案例，前奧運(yùn)選手馬克斯?特魯克斯患帕金森癥而接受了干細(xì)胞療法。醫(yī)生從胎兒那里提取干細(xì)胞，通過(guò)體外培養(yǎng)，擴(kuò)增、純化等技術(shù)制成干細(xì)胞制劑注入患者大腦中。但是當(dāng)這名病人去世后，病理學(xué)家們發(fā)現(xiàn)，這名病人的軟骨、皮膚和骨頭都堆積在大腦內(nèi)。也就是說(shuō)注入的干細(xì)胞并沒(méi)有按照醫(yī)生的意圖分化成神經(jīng)細(xì)胞，而是分化成了軟骨、骨頭與皮膚。當(dāng)然，隨著技術(shù)的發(fā)展，像上述案例中干細(xì)胞不定向分化的情況已經(jīng)非常少了。但是很多學(xué)者還是總結(jié)出干細(xì)胞治療的隱患或者存疑的地方。

2.1免疫排異反應(yīng)

我們身體的免疫系統(tǒng)天天在擊退微生物、病毒、有毒物質(zhì)的入侵。我們的免疫系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)這些異物（包括移植手術(shù)），便會(huì)發(fā)動(dòng)一系列有害的攻擊行為。這就是我們常說(shuō)的免疫排斥反應(yīng)。如果干細(xì)胞來(lái)自于異體，那就有可能引起免疫排斥反應(yīng)。當(dāng)然科學(xué)家可以通過(guò)對(duì)干細(xì)胞加工的方法，使它能夠應(yīng)對(duì)免疫系統(tǒng)，但這需要臨床驗(yàn)證。

2.2非定向分化

上述英國(guó)《每日郵報(bào)》報(bào)道的前奧運(yùn)選手馬克斯?特魯克斯案例，就是一個(gè)干細(xì)胞非定向分化的案例。當(dāng)醫(yī)生期望注入的干細(xì)胞能夠分化成為健康的神經(jīng)細(xì)胞，修復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)，但是它卻分化成了骨頭與皮膚。如何準(zhǔn)確地誘導(dǎo)干細(xì)胞分化成為制定的細(xì)胞，這還需要進(jìn)一步研究。

2.3細(xì)胞生長(zhǎng)失控與致瘤性

正常的細(xì)胞生長(zhǎng)是受控的，能夠精確自我復(fù)制、恰當(dāng)時(shí)候停止再生、專(zhuān)門(mén)分工、各司其職、受損自我凋亡。但是異體注入的干細(xì)胞制劑卻不一定遵循這套嚴(yán)格的程序，不一定定向分化、不一定停止再生。當(dāng)注入的細(xì)胞生長(zhǎng)失控，就有可能生成腫瘤，比如iPS細(xì)胞致瘤性高達(dá)20%。

2.4作用機(jī)理不太清楚

注入的干細(xì)胞制劑如何分化、如何分工、如何修復(fù)系統(tǒng)功能，以及異體干細(xì)胞存活多久，如何在體內(nèi)發(fā)揮作用。對(duì)于這些問(wèn)題還不是完全清楚。

從這些問(wèn)題可以看出，干細(xì)胞治療目前存在安全性問(wèn)題。

另外在治療腫瘤方面，根據(jù)國(guó)內(nèi)所報(bào)道的案例，療效不明顯。2014年3月15日與3月16日在中央電視臺(tái)“焦點(diǎn)訪談” 連續(xù)兩天報(bào)道浙江無(wú)錫“非法干細(xì)胞治療事件”：

2011年，58歲的昆明市民張某被查出身患結(jié)腸癌晚期，一個(gè)偶然的機(jī)會(huì)，他們聽(tīng)說(shuō)，無(wú)錫某干細(xì)胞公司擁有一種非常有效的治療方法，說(shuō)人體干細(xì)胞很有用，能治好。并且其董事長(zhǎng)跟他們說(shuō)：“一般的癌癥根本沒(méi)有問(wèn)題。你這個(gè)病很有希望的，如果不來(lái)我們這里的就沒(méi)救了?！币粋€(gè)劑量12萬(wàn)元，一個(gè)療程36萬(wàn)元。張某的女兒湊足了36萬(wàn)元，匯到該公司的賬戶上。第二天該公司把張某夫婦帶到了無(wú)錫市濱湖區(qū)的一家社區(qū)醫(yī)院為張某進(jìn)行胚胎干細(xì)胞治療。2012年3月30日，公司人員告訴他們，治療結(jié)束，效果很好，可以回家休養(yǎng)。而當(dāng)一家人回到昆明，張某的病情遠(yuǎn)沒(méi)有像該公司所承諾的那樣，向好的方向發(fā)展，能再活十年，而是急轉(zhuǎn)直下，短短三個(gè)月便不幸去世。

干細(xì)胞治療技術(shù)還處于初級(jí)階段，還有許多難題有待克服。國(guó)家應(yīng)該大力支持干細(xì)胞研究，以盡快解決技術(shù)難題，攻克科技難關(guān)。但是當(dāng)技術(shù)還不成熟，在安全性、有效性沒(méi)有確證的時(shí)候，為了贏利而匆促應(yīng)用于臨床，這就嚴(yán)重侵犯了患者的利益。

3干細(xì)胞治療的管理

2010年10月7日Nature雜志發(fā)文“Stem-cell laws in China fall short”，從立法層面指出中國(guó)規(guī)制干細(xì)胞技術(shù)的相關(guān)法律欠缺，現(xiàn)有法律缺乏可操作性。認(rèn)為準(zhǔn)確清晰、詳細(xì)的配套規(guī)則是必須的。

2012年4月11日Nature雜志繼續(xù)發(fā)文“China’s stem-cell rules go unheeded”從執(zhí)法層面指出中國(guó)干細(xì)胞規(guī)制收效甚微。未按要求申報(bào)批準(zhǔn)、未經(jīng)臨床試驗(yàn)驗(yàn)證的干細(xì)胞治療方法廣泛應(yīng)用于臨床治療，并且禁而不止。

目前中國(guó)干細(xì)胞市場(chǎng)被公認(rèn)存在以下弊?。?/p>

3.1未經(jīng)臨床試驗(yàn)驗(yàn)證、未按要求申報(bào)批準(zhǔn)而擅自應(yīng)用于臨床

2009年3月2日衛(wèi)生部組織制定了《醫(yī)療技術(shù)臨床應(yīng)用管理辦法》，并于5月1日施行。干細(xì)胞治療技術(shù)被列入第3類(lèi)醫(yī)療技術(shù)，由衛(wèi)生部負(fù)責(zé)技術(shù)審定和臨床應(yīng)用管理。2013年，我國(guó)出臺(tái)了《干細(xì)胞臨床試驗(yàn)研究管理辦法（試行）》，第四條規(guī)定：“干細(xì)胞臨床試驗(yàn)研究必須在干細(xì)胞臨床研究基地進(jìn)行，干細(xì)胞臨床試驗(yàn)研究基地由衛(wèi)生部與國(guó)家藥品食品監(jiān)督管理局組織進(jìn)行遴選和確定?！币簿褪钦f(shuō)所有干細(xì)胞制劑只要應(yīng)用于臨床治療，就必須經(jīng)過(guò)臨床試驗(yàn)驗(yàn)證。可事實(shí)上中國(guó)許多醫(yī)院都在開(kāi)展干細(xì)胞治療技術(shù)，卻未經(jīng)臨床試驗(yàn)。

3.2虛假宣傳擴(kuò)大療效

如同2014年3月15日?qǐng)?bào)道的無(wú)錫某干細(xì)胞公司聲稱她們的技術(shù)治療一般的惡性腫瘤根本沒(méi)有問(wèn)題，最壞也能帶著癌癥生存10年。干細(xì)胞技術(shù)治療惡性腫瘤，如果未經(jīng)臨床試驗(yàn)驗(yàn)證，意味著其安全性、有效性尚未確定。很多企業(yè)不顧這些基本事實(shí)，為追求高額利潤(rùn)，任意擴(kuò)大其療效以吸引患者。

3.3無(wú)收費(fèi)依據(jù)與收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)擅收高價(jià)

干細(xì)胞臨床試驗(yàn)研究管理辦法（試行）第七條規(guī)定：開(kāi)展干細(xì)胞臨床試驗(yàn)研究，不得向受試者收取費(fèi)用，不得市場(chǎng)化運(yùn)作，不得干細(xì)胞治療廣告。這說(shuō)明干細(xì)胞技術(shù)的臨床試驗(yàn)不能收取費(fèi)用。另外中國(guó)還沒(méi)有批準(zhǔn)干細(xì)胞的臨床試驗(yàn)，所以未經(jīng)臨床試驗(yàn)的干細(xì)胞技術(shù)沒(méi)有資格應(yīng)用于臨床治療，更談不上收取費(fèi)用了。即使干細(xì)胞治療技術(shù)獲得了臨床批文，準(zhǔn)許應(yīng)用于臨床，也不能擅自收取高價(jià)，而是必須作為三類(lèi)醫(yī)療技術(shù)通過(guò)另外的程序申請(qǐng)物價(jià)批文。

3.4干細(xì)胞供體未經(jīng)檢測(cè)

我國(guó)《人體細(xì)胞治療研究和制劑質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則》強(qiáng)調(diào)無(wú)論細(xì)胞來(lái)源如何，都必須提供細(xì)胞的組織來(lái)源及細(xì)胞類(lèi)別的確證資料，其中包括形態(tài)生化或表面標(biāo)志等。

若體細(xì)胞來(lái)源于同種異體，需說(shuō)明供體的年齡、性別，供體必須符合國(guó)家對(duì)獻(xiàn)血員的要求，并提供測(cè)試的方法及符合條件的依據(jù)。供體必須經(jīng)過(guò)檢驗(yàn)證明HBV抗原、抗HCV、抗HIV-1/2、梅毒抗體、細(xì)菌、霉菌均為陰性，必要時(shí)需說(shuō)明供體的既往病史、家族史等臨床資料。對(duì)于那些需通過(guò)激活體內(nèi)免疫功能發(fā)揮作用或需體細(xì)胞在體內(nèi)長(zhǎng)期存活的體細(xì)胞治療項(xiàng)目，除ABO血型外，還必須對(duì)供體做HLA-I類(lèi)和II類(lèi)分型檢查，并證明與受體（病人）相匹配，同時(shí)提供檢測(cè)方法和依據(jù)。若體細(xì)胞來(lái)源于動(dòng)物，必須提供動(dòng)物的來(lái)源，遺傳背景，健康證明（如重要病原體，包括人畜共患疾病的病原體），飼養(yǎng)條件，應(yīng)用此類(lèi)體細(xì)胞的必要性和安全性。

可是許多開(kāi)展干細(xì)胞治療的醫(yī)院與企業(yè)為節(jié)約成本，利益最大化，忽略或簡(jiǎn)化了對(duì)細(xì)胞與供體的檢測(cè)。

3.5干細(xì)胞來(lái)源的倫理問(wèn)題

事實(shí)上目前許多醫(yī)院或者企業(yè)的干細(xì)胞來(lái)源是流產(chǎn)的嬰兒或者剩余胚胎。通過(guò)私下與婦產(chǎn)科達(dá)成某項(xiàng)協(xié)議而獲得胚胎干細(xì)胞。這種獲得方式即使作為科研也必須通過(guò)倫理審查。如果流產(chǎn)胎兒是成為企業(yè)營(yíng)利的“原材料”，幾乎不可能會(huì)通過(guò)倫理審查。

第9篇：基因治療的基本策略范文

【關(guān)鍵詞】 急性梗死

關(guān)鍵詞: 心肌/細(xì)胞學(xué);急性梗死;新生血管化，病理性;移植

摘 要:目的 觀察移植的胚胎心肌細(xì)胞在成年兔急性梗死心肌組織內(nèi)的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程和其與宿主心肌組織的相互作用，以及對(duì)周?chē)募⊙\(yùn)的影響. 方法 將培養(yǎng)的兔胚胎心肌細(xì)胞，經(jīng)DAPI標(biāo)記后，直接注入成年兔的急性梗死心肌組織內(nèi)（通過(guò)結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支建立急性心肌梗死模型），同時(shí)設(shè)立對(duì)照組.4wk后處死動(dòng)物，進(jìn)行組織學(xué)和電鏡觀察. 結(jié)果 4wk后的心肌組織切片中，移植心肌細(xì)胞與宿主心肌細(xì)胞之間形成閏盤(pán)，其排列方向與宿主心肌肌纖維方向平行，同時(shí)，與對(duì)照組相比，心肌梗死區(qū)面積減少及移植區(qū)血管密度增高（P

Keywords:myocardium/cytology;myocardial infarction;neovascularization，pathologic;transplantation

Abstract:AIM To investigate the interaction between im-planted fetal cardiomyocytes and host cardiomyocytes and the angiogenesis effects of implanted fetal cardiomyocytes on the host cardiomyocytes and the development of fetal cardiomy-ocytes implanted into adult acute infarction myocardium.METHODS After labelled with DAPI，cultured rabbit fetal cardiomyocytes were implanted into the actue myocardial in-farction site of adult rabbits via direct injection.The myocar-dial infarction model was established by ligating the left ante-rior decending artery.Specimens were harvested4weeks af-ter the cell implantation.The results were observed by histo-logic methods and electronic microscopy examination.RESULTS Intercalated disks were observed between the graft-ed and the host cardiomyocytes，with the implanted car-diomyocytes parallel to the host myocardium in an aligning di-rection.The area of myocardial infaction decreased and the vascular density of implantationsites increased compared with those of the control groups（P

0 引言

將體外培養(yǎng)的兔胚胎心肌細(xì)胞直接移植到成年兔急性梗死區(qū)的心肌內(nèi)，分別觀察研究其在受體心肌組織內(nèi)的生長(zhǎng)發(fā)育和與宿主心肌細(xì)胞的相互作用情況，以及對(duì)周?chē)募⊙\(yùn)的影響，驗(yàn)證細(xì)胞移植治療缺血性心臟病的作用，為臨床上應(yīng)用細(xì)胞移植治療缺血性心臟病提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 材料 成年健康兔18只，雌雄不限，體質(zhì)量2.0～2.5kg，購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心.小牛血清（Hyclone），DMEM高糖培養(yǎng)基（Hyclone），胰蛋白酶（Gibco），Hanks平衡鹽液（Gibco），4’，6-二脒基-2-苯茚二酮（Sigma），第Ⅷ因子抗體（Sigma）.

1.2 方法

1.2.1 胚胎心肌細(xì)胞的分離和培養(yǎng)［1-3］ 取胚胎兔浸入950mL L-1 乙醇30s，取出心臟，分離心室，用培養(yǎng)液洗滌2次，將心室肌肉剪碎，加入0.25g L-1 胰蛋白酶消化30min，反復(fù)吹打，室溫下540g離心5min，收集消化的細(xì)胞，用含100mL L-1 小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置37℃含50mL L-1 CO2 孵箱中培養(yǎng)2h，然后將培養(yǎng)瓶翻置，將未貼壁的心肌細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，2d換液1次.

1.2.2 胚胎心肌細(xì)胞標(biāo)記 心肌細(xì)胞培養(yǎng)第4日，用0.2g L-1 4’，6-二脒基-2-苯茚二酮（DAPI）熒光標(biāo)記細(xì)胞4h以上，用Hanks平衡鹽液漂洗6次以去除未結(jié)合的DAPI.0.25g L-1 胰蛋白酶消化后，離心收集細(xì)胞，加入DMEM培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液（細(xì)胞密度為104 μL-1 ），以備用于細(xì)胞移植.

1.2.3 兔急性心肌梗死模型的建立及細(xì)胞移植 將健康兔隨機(jī)分成胚胎心肌細(xì)胞移植治療組及對(duì)照組.用戊巴比妥鈉30mg kg-1 iv，氯胺酮10mg kg-1 im麻醉.左前外側(cè)切口，切斷第3，4肋骨進(jìn)胸，顯露左冠狀動(dòng)脈前降支，距離其根部大約1.0～1.5cm，用4-0普理林線直接縫扎，見(jiàn)其遠(yuǎn)端供血區(qū)心肌組織顏色發(fā)暗，急性心肌梗死模型即告成立.1h后，用微量注射器向梗死區(qū)心肌組織內(nèi)注射移植用心肌細(xì)胞懸液，3點(diǎn)注射，每處50μL，對(duì)照組以相同量的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液注射.常規(guī)關(guān)胸，抗感染治療，每日給予環(huán)孢素A10mg kg-1 飼養(yǎng).手術(shù)中未發(fā)生氣胸及惡性心律失常.

1.2.4 結(jié)果觀察 心肌細(xì)胞移植術(shù)前，動(dòng)態(tài)觀察培養(yǎng)的心肌細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察用DAPI標(biāo)記好的心肌細(xì)胞.心肌細(xì)胞移植術(shù)后4wk，用過(guò)量麻醉劑處死動(dòng)物，取移植區(qū)及周?chē)募〗M織，統(tǒng)計(jì)梗死區(qū)面積，制作標(biāo)本，進(jìn)行透射電鏡及冰凍切片熒光顯微鏡觀察.同時(shí)，對(duì)梗死區(qū)石蠟切片（治療組及對(duì)照組動(dòng)物取樣2個(gè)/只，共取樣本36個(gè)），用第Ⅷ因子免疫組織化學(xué)染色梗死區(qū)血管，光學(xué)顯微鏡200倍視野下血管計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)移植區(qū)血管密度.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:數(shù)據(jù)采用SPLM軟件包，運(yùn)行單因素分析，結(jié)果以x ±s表示.

2 結(jié)果

2.1 胚胎心肌細(xì)胞的特性 對(duì)用酶消化法獲得的胚胎心肌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，4h后細(xì)胞貼壁，24h后可見(jiàn)細(xì)胞搏動(dòng).培養(yǎng)的心肌細(xì)胞成梭形或紡棰形，細(xì)胞核大，胞質(zhì)豐富（Fig1）.

2.2 胚胎心肌細(xì)胞移植后心肌再生 治療組心肌梗死區(qū)面積（0.49±0.13）cm2 明顯少于對(duì)照組（0.96±0.18）cm2 （P

2.3 血管再生 對(duì)缺血區(qū)石蠟切片用第Ⅷ因子行免疫組織化學(xué)染色，顯微鏡200倍視野下血管計(jì)數(shù)，移植區(qū)血管密度（8.0±2.6），高于對(duì)照組（1.6±1.4），（P

圖1 －圖4 略

3 討論

正在探索的細(xì)胞移植術(shù)，為病損性心臟的細(xì)胞重構(gòu)及衰竭心臟的功能恢復(fù)，提供了一種全新的治療策略，為缺血性心臟病的治療帶來(lái)了光明的前景.心肌細(xì)胞移植可以發(fā)揮三大功能:穩(wěn)定病損性心臟結(jié)構(gòu)，防止組織重構(gòu);改善局部或整體心臟的收縮功能;可以充當(dāng)分子載體，進(jìn)行基因治療［4］ .

本實(shí)驗(yàn)中，將分離培養(yǎng)的兔胚胎心肌細(xì)胞移植到成年兔梗死心肌區(qū)域后，心肌梗死區(qū)面積明顯減少，冰凍切片熒光檢測(cè)顯示，心肌標(biāo)本中有帶熒光的細(xì)胞核和肌纖維，說(shuō)明移植的心肌細(xì)胞存活.同時(shí)，它們排列方向基本一致，顯微光鏡下與宿主心肌細(xì)胞肌纖維方向平行，這可能與心肌內(nèi)微環(huán)境及宿主心肌細(xì)胞收縮時(shí)對(duì)其產(chǎn)生的機(jī)械張力有關(guān)［5］ .細(xì)胞間形成閏盤(pán)是移植的胚胎心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，表明胚胎心肌細(xì)胞移植后與宿主心肌細(xì)胞融合修復(fù)心肌損傷，直接參與了心肌收縮活動(dòng).在修復(fù)損傷的同時(shí)，胚胎心肌細(xì)胞還可促進(jìn)周?chē)茉偕?，這可能是由于胚胎心肌細(xì)胞在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中分泌一些血管生成因子、細(xì)胞生長(zhǎng)因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF）、堿性纖微母細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）等［6，7］ .實(shí)驗(yàn)中我們采用了一種新的細(xì)胞標(biāo)記方法，即利用DAPI標(biāo)記的方法［8］ ，相對(duì)于以前用H3標(biāo)記、酶標(biāo)記的方法，其具有以下特點(diǎn):①DAPI對(duì)DNA有高 度親和力，是標(biāo)記細(xì)胞核的熒光染色，具備標(biāo)記高效性（100%）.②細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)不會(huì)因細(xì)胞分化狀況改變.③一旦被標(biāo)記后，只由被標(biāo)記的細(xì)胞保存，不會(huì)有傳遞.④對(duì)活細(xì)胞沒(méi)有毒性，不會(huì)改變細(xì)胞活性及細(xì)胞器的超微結(jié)構(gòu).

胚胎心肌細(xì)胞移植到成年兔梗死心肌區(qū)域后，其細(xì)胞膜上離子通道的變化，整塊心肌的反應(yīng)性及全心功能的改善尚待進(jìn)一步研究.另外，胚胎心肌細(xì)胞的異體移植，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，受體內(nèi)終將發(fā)生難以避免的排異反應(yīng)，進(jìn)一步尋找自身來(lái)源的細(xì)胞（如骨髓基質(zhì)細(xì)胞）進(jìn)行細(xì)胞移植的研究正在實(shí)驗(yàn)中.

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