臨床醫(yī)學流式細胞術(shù)研究

前言：想要寫出一篇引人入勝的文章？我們特意為您整理了臨床醫(yī)學流式細胞術(shù)研究范文，希望能給你帶來靈感和參考，敬請閱讀。

摘要：流式細胞術(shù)是能在分子水平上對細胞內(nèi)外因子進行快速定性和定量研究的一種細胞分析和檢測的手段，是當代最先進的細胞定量分析技術(shù)。是近代細胞生物學、分子生物學、分子免疫學和單克隆技術(shù)、激光技術(shù)、電子計算機技術(shù)等學科高度發(fā)展的結(jié)晶。其具有測量指標多、采集數(shù)量大、可高速分析上萬個細胞，而且可同時檢測一個樣本中的多個被測因子，可進行多參數(shù)測量等優(yōu)點。近年來流式細胞術(shù)的發(fā)展取得了顯著的成果，其應用領(lǐng)域和使用范圍也在不斷擴大。本文對流式細胞術(shù)的工作原理和流式細胞儀的結(jié)構(gòu)進行了簡單的概述，并對其在血液學、免疫學、腫瘤學、細菌學、中醫(yī)學等方面進行了綜述。

關(guān)鍵詞：流式細胞術(shù)；臨床醫(yī)學；應用

近年來，隨著單克隆抗體的應用及流式細胞術(shù)的快速發(fā)展，流式細胞術(shù)（FCM）已成為許多疾病診斷和分性的重要依據(jù)。流式細胞術(shù)是20世紀70年展起來的一項高新技術(shù)，它作為一門生物檢測技術(shù)集計算機技術(shù)、測量技術(shù)、激光技術(shù)、流體動力學、細胞化學、細胞免疫學于一體，是對快速直線運動狀態(tài)中的細胞、生物顆?；蛞后w中的大分子物質(zhì)進行多參數(shù)的、快速的定量分析和分選的一種技術(shù)［1］。1973年美國BD公司推出全國第一臺流式細胞儀，通過對流動液體中排列成單列細胞或顆粒進行逐個檢測得到該細胞或顆粒的光散射和熒光指標，分析它們的體積、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、抗原等物理及化學性質(zhì)，還能對所需要的細胞進行分選等。具有檢測速度快、測量指標多、采集數(shù)量大，對所需的細胞或生物顆粒進行分析或分選等特點［2］，其在生物學、臨床醫(yī)學、遺傳免疫學、腫瘤學等眾多研究領(lǐng)域得到廣泛應用。

1流式細胞儀的結(jié)構(gòu)及工作原理

1．1流式細胞儀的結(jié)構(gòu)

主要由五部分組成：（1）流動室及液流驅(qū)動系統(tǒng)；（2）激光光源及光束形成系統(tǒng)；（3）光學系統(tǒng)；（4）信號檢測與儲存、顯示、分析系統(tǒng)；（5）細胞分選系統(tǒng)。

1．2流式細胞儀的工作原理

將待測細胞染色后制成單細胞懸液，用一定壓力將待測樣品壓入流動室，不含細胞的硫酸緩沖液在高壓下從鞘液管噴出，鞘液管入口方向與待測樣品流成一定角度，這樣鞘液就能夠包繞樣品高速流動，組成一個圓形的流束，待測細胞在鞘液的包繞下單行排列，依次通過檢測區(qū)域。流式細胞儀通常以激光作為光源，經(jīng)過聚焦整形后的光束，垂直照射在樣品流上，被熒光染色的細胞在激光束的照射下，產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光，這兩種信號同時被前向光電二極管和90°方向的光電倍增管接收，光散射信號在前向小角度進行檢測，這種信號基本上反映了細胞體積的大??；熒光信號的接受方向與激光束垂直，經(jīng)過一系列雙色性反射鏡和帶通濾光片的分離，形成多個不同波長的熒光信號，這些熒光信號的強度代表了所測細胞膜表面抗原的強度或核內(nèi)物質(zhì)的濃度，經(jīng)光電倍增管接收后可轉(zhuǎn)換為電信號，再通過模／數(shù)轉(zhuǎn)換器將連續(xù)的電信號轉(zhuǎn)換為可被計算機識別的數(shù)字信號，計算機系統(tǒng)將這些數(shù)字信號收集、儲存，以一維直方圖或二維點陣圖及數(shù)據(jù)表或三維圖形顯示出來，可以用不同的標記物進行雙參數(shù)、三參數(shù)甚至多參數(shù)的分析［3，4］。

2流式細胞儀的技術(shù)指標

包括：（1）分析速度：很高可以達到5000個／s左右，大型的流式細胞儀的分析速度可達10000個／s；（2）熒光檢測靈敏度：單個細胞上的熒光分子＜600個，或兩個細胞之間的熒光差＞5％就能區(qū)分；（3）前向角散射光檢測靈敏度：一般的可以檢測到的最小顆粒直徑在0．2～0．5μm；（4）分辨率（CV）：一般流式細胞儀能夠達到＜2．0％；（5）分選速度：一般流式細胞儀分選速度＞100個／s，分選細胞純度可達99％［5］。

3流式細胞術(shù)在臨床中的應用

3．1在血液學中的應用

流式細胞術(shù)通過對外周血細胞和骨髓細胞表面抗原和DNA的檢測分析對各種血液病如白血病、淋巴瘤等血液系統(tǒng)疾病的分型、診斷、治療及預后判斷均有重要作用。血細胞在白細胞系、紅細胞系、巨核細胞系、血小板及非造血細胞均有不同的分化抗原表達，分布在細胞質(zhì)、細胞膜中。血液腫瘤細胞的特征是喪失了正常細胞的系類專一性和分化階段的規(guī)律性，運用流式細胞術(shù)將具有系列特異性并涵蓋不同分化階段的單克隆體作為分子探針來檢測血液腫瘤細胞的內(nèi)外抗原，可以反映其本質(zhì)上與正常造血細胞的差異［6］。流式細胞術(shù)采用各種抗血細胞表面分化抗原的單克隆抗體，借助于各種熒光染料（異硫氰基熒光素FITC，藻紅蛋白PE等）測定一個細胞的多種參數(shù)，以正確判斷出該細胞的屬性。流式細胞術(shù)還可以應用在白血病免疫分型方面，目前國內(nèi)外均主張采用FCMCD45／SSC雙參數(shù)散點圖設計方法進行白血病免疫分析。采用此法可將骨髓細胞清晰地分成淋巴細胞、單核細胞、成熟粒細胞、幼稚細胞和有核紅細胞群，這樣可以排除正常細胞對免疫分型的干擾，從而提高免疫分析的準確性，而且測量細胞一般在1～5萬個細胞，快速特異、準確性好，并且能夠提供正常細胞在演變成惡性腫瘤過程細胞基因及抗原標志發(fā)生變化的信息。而這種細胞的變化是常規(guī)FAB法所不能分辨的。這種分型對于治療方案的正確選擇與預后有著重要的意義同時也提供了可靠的依據(jù)［7］。近年研究發(fā)現(xiàn)，在臨床血液病檢測和診斷中診斷準確率高達90％以上，與普通檢測法相比準確率提高達20％［8］。流式細胞術(shù)可以通過某些熒光染料與紅細胞中的RNA結(jié)合，定量地測定網(wǎng)織紅細胞中的RNA，得到網(wǎng)織紅細胞占成熟紅細胞的百分比，從而準確地反映骨髓造血功能。有作者報道FCM方法比目測法結(jié)果精確度更高［9］。此外FCM還可以測出網(wǎng)織紅細胞的成熟度，對紅細胞增值能力的判斷很有意義，為干細胞移植術(shù)后恢復的判斷、貧血的治療監(jiān)測、腫瘤患者放化療對骨髓的抑制狀況等提供依據(jù)。

3．2在腫瘤學中的應用

流式細胞術(shù)在腫瘤學中的應用主要是對腫瘤細胞DNA含量進行測定，包括癌前病變及早期癌變的檢出，輔助腫瘤的早期診斷和鑒別診斷。不僅如此，還可以根據(jù)化療過程中腫瘤DNA分布直方圖的變化評估療效，了解細胞動力學的變化。臨床醫(yī)生可根據(jù)各細胞周期各時相的分布情況，結(jié)合化療藥物對細胞動力學的干擾理論，設計最佳治療方案，再依照DNA直方圖直接地看到腫瘤細胞的殺傷變化，及時調(diào)整治療方案，選取有效藥物以使對腫瘤細胞達到最大的殺傷效果［10］。

3．3在免疫學中的應用

利用抗原抗體特異性反應的原理將流式細胞儀與單克隆抗體結(jié)合，對細胞表面和細胞內(nèi)抗原、癌基因蛋白及膜受體進行定量檢測，廣泛應用于臨床，對人體細胞免疫功能的評估具有重要的意義。流式細胞術(shù)可進行T、B和NK淋巴細胞水平的分析，還可以進行淋巴細胞亞群的分析，區(qū)分不同的淋巴細胞亞群，計算其相互間的比例，進而了解淋巴細胞的分化功能。更重要的是，通過研究大多數(shù)疾病的特異性淋巴細胞亞群，對一些疾病如免疫性疾病、感染性疾病、腫瘤等的診斷、治療、免疫功能的重建具有重要的指導意義。例如CD4是輔助性淋巴細胞，它是遲發(fā)性超敏反應的啟動者，是促使B淋巴細胞產(chǎn)生抗體的輔助性細胞，也是抑制性T細胞的誘導細胞，而CD8是抑制性T細胞，是細胞毒性T細胞介導反應的效應細胞，是抑制B細胞產(chǎn)生抗體的抑制性細胞［11］。在許多免疫性疾病中，淋巴細胞亞群的增多與減少對疾病的發(fā)展具有重要的作用。如在先天性發(fā)育不良綜合征中FCM分析顯示外周血CD3TCD4＋和CD8＋T細胞均減少，在殘余T細胞中T細胞受體（TCR）αβ分子表達減少，γδ分子表達正常，CD4＋／CD8＋T細胞比例升高，隨著受累者年齡的增加CD8＋細胞數(shù)增多，而有些患者T細胞數(shù)量增加，最終可達正常［12］。流式細胞術(shù)還可以進行HLA群體分析，在強直性脊柱炎患者中用流式細胞術(shù)檢測HLA－B27抗原陽性率高達92．6％，而且可以排除交叉反應，提高檢測的靈敏度和準確性［13］。

3．4在中醫(yī)藥研究方面的應用

流式細胞術(shù)可用于單味中藥有效成分的作用效果測定分析。如研究復方苦參方劑對大腸癌LoVo細胞體外增值凋亡的影響中，分析DNA含量及細胞周期，結(jié)果顯示Lo－Vo細胞可檢測亞G1峰，凋亡率于對照組相對比例增高，細胞周期分析發(fā)現(xiàn)S期阻滯現(xiàn)象，表明復方苦參方劑具有一定的抑制腫瘤細胞增殖和誘導凋亡的作用［14］。在慢性阻塞性肺疾病的肺氣虛證、肺陰虛證患者中CD4＋、CD4＋／CD8＋均降低，CD8＋升高，說明肺氣虛證與肺陰虛證患者均存在細胞免疫功能低下［15］。

3．5在細菌學中的應用

流式細胞術(shù)具有快速、靈敏、精確并能進行多參數(shù)分析的特點，可廣泛應用于細菌的診斷和藥敏實驗，是研究細菌異質(zhì)性、細菌抗生素后效應、多種病原菌混合感染等的有效方法。常用的為流式細胞術(shù)藥敏試驗：檢測不同細菌時，根據(jù)藥物對細菌的作用機理選擇合適的熒光染料，通過細菌總體平均熒光強度束反映抗生素對細菌的抗菌活性，3h左右即可得出檢測結(jié)果，尤其適用于急需藥敏報告的重癥感染病菌的檢測。

3．6在血小板疾病診斷中的作用

血小板是止血機制中一個重要因素，其表面含有多種糖蛋白及各種受體，這些受體與相應的配體相結(jié)合后，血小板被激活，并發(fā)生形態(tài)變化，血小板聚集和顆粒釋放等一系列反應。利用流式細胞術(shù)檢測血小板標志物在許多血小板相關(guān)疾病的診斷上具有重要的臨床價值［16］。如GPⅠb／Ⅸ復合物先天缺陷導致巨大血小板綜合征；GPⅡb／Ⅲa復合物先天缺陷導致血小板無力癥［17］。在免疫性血小板減少性紫癜的患者中，F(xiàn)CM可以測定患者血液中的PAIgG、PAIgM、PAIgA，熒光陽性百分率的診斷效率為45．8％，平均熒光強度的診斷效率為72．5％，兩項指標聯(lián)合的診斷效率為74．2％［18］；因此FCM檢測血小板抗體可用于免疫性血小板減少性紫癜的診斷及治療監(jiān)測。用FCM內(nèi)參定位法定量分析血小板微粒在血栓性疾病和血栓前狀態(tài)的發(fā)生發(fā)展中的作用，有利于血栓性疾病的診斷和治療。

3．7在精子相關(guān)疾病檢測中的應用

精子質(zhì)量檢測是診斷男性不育癥的重要手段，由于檢測精子數(shù)低及主觀因素的影響，常規(guī)的精液檢查只能反映精子的形態(tài)特征和有限的功能，不能為生育能力提供準確評估的依據(jù)，用FCM檢查精液可把定性的描述變成定量的研究，提高了實驗結(jié)果的準確性，可對精液進行高通量、多參數(shù)分析，得到不同時期的細胞數(shù)據(jù)及精子形態(tài)指標，對臨床診斷精子發(fā)生障礙的性質(zhì)、原因和程度提高了客觀依據(jù)，可對少、弱精子和無精子癥的判斷、治療及療效的觀察作出正確的評價，為客觀評價男性生育能力提供了有力的依據(jù)。用FCM檢測生精細胞凋亡情況是迅速、準確、客觀、可靠地評估精子功能和男性生育力的新方法［19］。

3．8在器官移植中的作用

可用流式細胞術(shù)判斷供者與受者之間的配型是否合適。檢測受者血清中抗供者的抗HLA抗體，如果受者血清中存在針對供者的循環(huán)抗體，就會同供者的淋巴細胞結(jié)合，在加入熒光素的二抗來顯示這種結(jié)合，就可在移植前后發(fā)現(xiàn)高風險抗體，以判斷供者與受者之間是否合適。移植后的免疫表型監(jiān)測也很重要，移植后的CD4／CD8比值低下的患者排斥反應發(fā)生較多，受者血清中產(chǎn)生抗供體細胞抗體預后較差，應及時監(jiān)測以便進行抗排斥的預防和治療［4］。綜上所述，流式細胞術(shù)是一種在醫(yī)學基礎、臨床及科學研究中具有廣泛應用前景的細胞分析技術(shù)。它具有分辨率高、分辨細胞數(shù)量大、參數(shù)多、準確性高、速度快等優(yōu)點。隨著流式細胞分析技術(shù)與方法的迅速發(fā)展，流式細胞術(shù)在臨床的應用范圍也不斷拓展，并將成為推動臨床醫(yī)學發(fā)展的重要手段。

參考文獻

［1］吳曉娜，蔣紅兵．流式細胞術(shù)的工作原理及其臨床應用〔J〕．臨床工程，2011，26（3）：91．

［2］李超，韓金路，王玉剛，等．流式細胞儀的工作原理及應用〔J〕．中國實用醫(yī)藥2009，4（20）：235－236．

［3］王書奎，周振英．實用流式細胞術(shù)彩色圖譜〔M〕．上海：第二軍醫(yī)大學出版社，2004：1－58．

［4］李華，常瑩．流式細胞儀的工作原理及臨床應用〔J〕．中國醫(yī)療器械信息2011，17（5）：37－38．

［5］張瑞華，王進，蘭文軍．流式細胞術(shù)及其在生物醫(yī)學領(lǐng)域中的應用〔J〕．山東輕工業(yè)學院學報，2011，25（3）：21－22．

［6］IchinohasamaR，DecoteauJF，myersJ，etal．Threecolorflowcytometryinthediagnosisofmalignantlymphomabasedonthecomparativecellmorphologyoflymphomacellsandreac－tivelymphocytes〔J〕．Leukemia，1997，11（11）：1891－1903．

［7］邢娟娟，黃濤，彭燕．流式細胞術(shù)白血病免疫分型的臨床應用〔J〕．實用臨床醫(yī)學，2005，6（7）：64．

［8］王文平，楊進波．流式細胞儀在白血病臨床研究中的應用〔J〕．臨床檢驗，2006，3（26）：152－153．

［9］劉小林，周彥，孫林．流式細胞儀檢測網(wǎng)織紅細胞百分比性能評價〔J〕．蚌埠醫(yī)學院學報，2010，35（8）：828－830．

［10］董荔紅．流式細胞儀檢測直方圖在常見故障維護中的應用〔J〕．中國醫(yī)療設備，2009，24（10）：106－107．

［11］李珺，郝洪軍，高楓，等．流式細胞術(shù)檢測腦脊液T淋巴細胞亞群的臨床應用前景〔J〕．中國神經(jīng)免疫學和神經(jīng)病學雜志，2011，18（2）：129．

［12］陳冉，白麗．流式細胞術(shù)在原發(fā)性免疫缺陷病診斷中的應用中國臨床醫(yī)學，2011，18（3）：410．

［13］金明威，陳哲，陳穎．流式細胞術(shù)檢測HLA－B27及其臨床意義〔J〕．中國優(yōu)生與遺傳雜志，2011，19（5）：35．

［14］徐月，秦劍，等．復方苦參方劑對大腸癌LoVo細胞體外增殖凋亡的影響〔J〕．第四軍醫(yī)大學學報，2009，30（15）：1391．

［15］李澤庚，張四春，等．慢性阻塞性肺疾病肺氣虛證與肺陰虛證患者細胞免疫功能的比較〔J〕．北京中醫(yī)藥，2009，28（1）：16．

［16］劉婷婷．流式細胞儀在中西醫(yī)領(lǐng)域的應用〔J〕．西部醫(yī)學，2011，23（6）：1148－1149．

［17］王志杰．流式細胞術(shù)在血小板疾病中的應用〔J〕．血栓與止血學2004，10（1）：39－41．

［18］吳艾霖，吳麗娟，劉毓剛，等．流式細胞術(shù)檢測血小板相關(guān)免疫球蛋白的臨床應用〔J〕．國際檢驗醫(yī)學雜志，2011，32（20）：2304－2306．

［19］王芳，羅婧，王麗婷，等．流式細胞儀檢測正常男性精子細胞凋亡〔J〕．第三軍醫(yī)大學學報，2009，31（2）：184－185．

作者：李素芝 單位：天津市安寧醫(yī)院