細(xì)胞的生物學(xué)特性精選(九篇)

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第1篇：細(xì)胞的生物學(xué)特性范文

0.009）；單克隆p75NTR陽性細(xì)胞再培養(yǎng)2周后，p75NTR陽性細(xì)胞率分別降為14.5%（Tca-8113）和5.8%（Cal-27）；p75NTR陽性細(xì)胞體外增殖能力顯著增強(qiáng)，且具有明顯的侵襲遷移能力。結(jié)論 p75NTR陽性舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞的特性。

[關(guān)鍵詞] 舌鱗狀細(xì)胞癌； 腫瘤干細(xì)胞； p75神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體

[中圖分類號(hào)] R 739.86 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2014.01.005

Study of the biological characteristics of p75 neurotrophin receptor positive tongue squamous cell carcinoma cells Tong Dongdong1，2， Zhang Fenghe1，2， Yao Yao3， Zhang Zhaotao1，2， Wang Jinbing1，2， Li Qing1，2， Zhang Xinlian1，2. （1. Dept. of Oral and Maxillofacial Surgery， Stomatology Hospital of Shandong University， Jinan 250012， China； 2. Shandong Provincial Key Labo-ratory of Oral Biomedicine， Jinan 250012， China； 3. Dept. of Stomatology， Anhui No.2 Provincial People’s Hospital， Anhui 230022， China）

[Abstract] Objective To study the biological characteristics of p75 neurotrophin receptor positive （p75NTR+） tongue squa-mous cell carcinoma cells which were separated by flow cytometry cell sorting. Methods To determine the biological cha-racteristics of p75NTR+ cells which were separated from Tca-8113 and Cal-27 tongue squamous cell carcinoma cells by flow cytometry cell sorting， including study the capacity of cloning， 3-（4，5）-demethylthiazo（z-y1）-3，5-diphenytetrazoliumromide （MTT） assay， wound healing assay. p75NTR+ cells with non-sorted cells were as control group. Results In Tca-8ll3 and Cal-27 tongue squamous cell carcinoma cell lines， the percentage of p75NTR+ cells were 3.1% and 1.9%. Compared with p75NTR+ cells with non-sorted cells， p75NTR+ cells possess higher capacity of cloning （Tca-8113， P=0.024； Cal-27， P=0.009）. The per-centage of p75NTR+ cells of the progeny cells generated from monoclonal p75NTR+ cells decreased to 14.5% （Tca-8113） and 5.8% （Cal-27） after cultured two weeks. p75NTR+ cells possessed higher proliferation ability and higher metastasis ability than non-sorted cells. Conclusion p75NTR+ cells isolated from tongue squamous cell carcinoma have the characteristics of cancer stem cells.

[Key words] tongue squamous cell carcinoma； cancer stem cells； p75 neurotrophin receptor

腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells，CSCs）是腫瘤組織中具有自我更新、多向分化及較強(qiáng)增殖能力的少量干細(xì)胞樣癌細(xì)胞亞群，是腫瘤起源、生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)的根源所在。近年來，尋找靶向殺死腫瘤干細(xì)胞的抗癌策略已成為研究的熱點(diǎn)。其中，選擇何種細(xì)胞表面標(biāo)志物來證實(shí)舌癌中腫瘤干細(xì)胞的存在并完成對(duì)腫瘤干細(xì)胞的提取和鑒別是首要亟待解決的問題。研究發(fā)現(xiàn)p75神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體（p75 neu-rotrophin receptor，p75NTR）的表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)，并已證實(shí)其在全身多種腫瘤中可以作為一種腫瘤干細(xì)胞的表面標(biāo)志物[1]。本實(shí)驗(yàn)采用p75NTR對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Tca-8113及Cal-27進(jìn)行標(biāo)記、檢測(cè)、分選，并對(duì)分選后的p75NTR陽性細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)特性研究，探討p75NTR作為腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物和預(yù)測(cè)口腔鱗狀細(xì)胞癌愈后指標(biāo)的可能性，為深入研究舌鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)理和尋找新的治療靶點(diǎn)提供線索。

1 材料和方法

1.1 材料

Tca-8113、Cal-27細(xì)胞株來源于口腔舌鱗狀細(xì)胞癌，由上海交通大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院口腔頜面外科腫瘤生物實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。Tca-8113細(xì)胞株用含10%FBS（杭州四季青生物工程材料研究所）的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。Cal-27細(xì)胞株用含10%FBS（GIBCO公司，美國）的高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。PE標(biāo)記的鼠抗人p75NTR抗體及PE標(biāo)記的小鼠骨髓瘤蛋白IgG1，κ抗體均購自美國BD公司。

1.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)p75NTR陽性細(xì)胞的表達(dá)

將生長(zhǎng)狀況良好并處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Tca-8113細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，并且調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×106個(gè)·mL-1 。實(shí)驗(yàn)分為2組，實(shí)驗(yàn)組加入100 μL PE標(biāo)記小鼠抗人p75NTR抗體，對(duì)照組加入等量的PE標(biāo)記小鼠骨髓瘤蛋白IgG1，κ。放入冰里置于震蕩箱中蔽光孵育半小時(shí)，1 000 r·min-1離心5 min，吸棄上清后Buffer I l mL沖洗吹打（反復(fù)沖洗、離心2次），重懸于400 μL PBS中。將加入等量PE標(biāo)記小鼠骨髓瘤蛋白IgG1，κ的對(duì)照組先上機(jī)調(diào)節(jié)機(jī)器參數(shù)，然后取實(shí)驗(yàn)組上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞熒光值，分析p75NTR陽性細(xì)胞的百分含量，重復(fù)3次取平均值。同法處理Cal-27細(xì)胞。

1.3 p75NTR陽性細(xì)胞生物學(xué)特性檢測(cè)

1.3.1 以p75NTR為標(biāo)記分選陽性細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組 將生長(zhǎng)狀況良好并處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的較大數(shù)量的2種舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞（約1.0×108個(gè)·mL-1）如上法處理后上機(jī)進(jìn)行高速分選，獲得p75NTR陽性細(xì)胞，作為實(shí)驗(yàn)組。為了保證分選后富集的p75NTR陽性細(xì)胞的純度，分選時(shí)選取強(qiáng)陽性區(qū)域。重復(fù)上機(jī)一次，以避免標(biāo)記物丟失造成的陽性率偏低。并取適量分選后的細(xì)胞上機(jī)檢測(cè)p75NTR陽性細(xì)胞的純度。

1.3.2 對(duì)照組處理 將同等條件培養(yǎng)的2種舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，加入PE標(biāo)記小鼠抗人p75NTR抗體，放入冰里置于震蕩箱中蔽光孵育半小時(shí)，再放入離心機(jī)離心5 min（1 000 r·min-1），棄上清后Buffer I l mL沖洗吹打（反復(fù)沖洗、離心2次），作為對(duì)照組備用。

1.3.3 單克隆培養(yǎng) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的2組細(xì)胞于超凈臺(tái)中常規(guī)消化制成單細(xì)胞懸液后，用有限稀釋法接種于96孔板中。5%CO2、37 ℃飽和溫度環(huán)境培養(yǎng)觀察細(xì)胞貼壁情況，記錄僅有一個(gè)細(xì)胞的孔，并做標(biāo)記。2周后統(tǒng)計(jì)單克隆形成率。收集p75NTR陽性細(xì)胞形成的單克隆細(xì)胞，培養(yǎng)于培養(yǎng)瓶中，再培養(yǎng)2周后進(jìn)行p75NTR的流式細(xì)胞檢測(cè)。

1.3.4 四甲基偶氮唑鹽比色法[（3-（4，5）-demethylthiazo

（z-y1）-3，5-diphenytetrazoliumromide，MTT]實(shí)驗(yàn) 收集2組細(xì)胞，分別接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中（每孔約4×103個(gè)細(xì)胞）（周邊空不加），再各加入200 μL培養(yǎng)液（周邊空不加，B3孔只加入PBS作為對(duì)照）。培養(yǎng)24 h后，換液，B3孔換200 μL PBS。每孔加入20 μL MTT溶液，培養(yǎng)4 h后吸出上清液，加入150 μL二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），置于搖床上低速震蕩10 min。以B3孔為調(diào)零孔，上酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，以490 nm吸光度值量化活細(xì)胞數(shù)，每次檢測(cè)一豎列的6個(gè)平行孔，每組所得數(shù)據(jù)取平均值，連續(xù)檢測(cè)7 d。以生長(zhǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以光密度（op-tical density，OD）值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。

1.3.5 劃痕實(shí)驗(yàn) 將2組細(xì)胞以每孔1×105個(gè)的密度接種于六孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)到80%～90%時(shí)，無菌條件下更換為無血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，于超凈臺(tái)中用200 μL槍頭在每個(gè)孔的中間劃一條豎直的線，PBS沖洗3遍。每孔加入2 mL完全培養(yǎng)液，倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄。之后每天換液，拍照，連續(xù)8 d。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組間的比較采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)p75NTR陽性細(xì)胞的表達(dá)

舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株Tca-8113、Cal-27細(xì)胞中，p75NTR陽性細(xì)胞的比例分別為3.1%和1.9%。

2.2 流式細(xì)胞分選及純度檢測(cè)

分選后p75NTR陽性細(xì)胞的比例分別為98.1%（Tca-

8113）和97.4%（Cal-27）。這表明目的細(xì)胞陽性率比較高。

2.3 單克隆培養(yǎng)

2組單克隆形成能力的比較見表1。從表1可見，只有小部分細(xì)胞能持續(xù)分裂增殖。實(shí)驗(yàn)組的單克隆形成能力高于對(duì)照組（Tca-8113細(xì)胞，P=0.024；Cal-

27細(xì)胞，P=0.009）。這表明p75NTR陽性細(xì)胞具有自我更新和分化能力。單克隆細(xì)胞再培養(yǎng)2周后，Tca-

8113的p75NTR陽性細(xì)胞率降為14.5%，Cal-27的p75NTR陽性細(xì)胞率降為5.8%。

2.4 MTT實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞生長(zhǎng)曲線（圖1、2）表明：2組細(xì)胞第1天生長(zhǎng)情況無明顯差異，從第3天之后實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞較之對(duì)照組細(xì)胞體外增殖能力明顯增強(qiáng)，第5天及第7天時(shí)更加顯著（P

2.5 劃痕實(shí)驗(yàn)

劃痕后7 d，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組具有明顯的愈合能力（圖3、4）。Tca-8113實(shí)驗(yàn)組到第8天已經(jīng)基本被細(xì)胞長(zhǎng)滿，而對(duì)照組卻仍有空白區(qū)域（圖5），Cal-

27實(shí)驗(yàn)組到第5天已經(jīng)基本長(zhǎng)滿劃痕區(qū)域，完全長(zhǎng)滿需要7 d（圖6）。這說明實(shí)驗(yàn)組具有明顯的侵襲遷移能力。

圖 1 2組Tca-8113細(xì)胞生長(zhǎng)曲線（MTT實(shí)驗(yàn)）

Fig 1 Cells growth curve of Tca-8113 of two groups （MTT test）

圖 2 2組Cal-27細(xì)胞生長(zhǎng)曲線（MTT實(shí)驗(yàn)）

Fig 2 Cells growth curve of Cal-27 of two groups （MTT test）

圖 5 2組Tca-8113細(xì)胞不同時(shí)間的劃痕距離比較

Fig 5 The comparison of scratch distance in different times of Tca-

8113 of two groups

圖 6 2組Cal-27細(xì)胞不同時(shí)間的劃痕距離比較

Fig 6 The comparison of scratch distance in different times of Cal-

27 of two groups

3 討論

腫瘤干細(xì)胞是腫瘤起源、生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)的根源所在。近年來，通過對(duì)其生物學(xué)特性的研究，尋找靶向殺死腫瘤干細(xì)胞的抗癌策略成為研究的熱點(diǎn)。p75NTR是一種神經(jīng)營養(yǎng)因子的低親和力受體，可通過不同的信號(hào)傳導(dǎo)通路誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生增殖、分化、遷移、凋亡等生物學(xué)行為。近年來，研究發(fā)現(xiàn)p75NTR的表達(dá)與胃癌[2] 、視網(wǎng)膜成神經(jīng)細(xì)胞瘤[3]、前列腺癌[4]、胰腺癌[5]、黑色素瘤[6]等多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)，并已證實(shí)其在全身多種腫瘤中可作為一種腫瘤干細(xì)胞的表面標(biāo)志物[1]。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)p75NTR在舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Tca-8113及Cal-27中都有陽性表達(dá)，且其陽性率分別為3.1%和1.9%。這與以往報(bào)道中腫瘤干細(xì)胞數(shù)量相當(dāng)[7-8] 。

腫瘤細(xì)胞的克隆形成能力與其致瘤能力呈正相關(guān)[9]，并且只有腫瘤干細(xì)胞具有單克隆形成能力和強(qiáng)致瘤性[10-11]。本研究單克隆培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)細(xì)胞株的p75NTR陽性細(xì)胞的體外單克隆形成能力相對(duì)于未分選的細(xì)胞均顯著增強(qiáng)，符合其是具有自我更新能力的腫瘤干細(xì)胞的理論。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)單克隆4周后的p75NTR陽性細(xì)胞的p75NTR陽性率明顯下降，其分化產(chǎn)生了大量p75NTR陰性細(xì)胞，該結(jié)果說明p75NTR陽性細(xì)胞具有較強(qiáng)的克隆形成能力并具有一定的分化潛能。

本研究用MTT法對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株Tca-8113和Cal-27中的p75NTR陽性細(xì)胞及未分選細(xì)胞的體外增殖能力進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)p75NTR陽性細(xì)胞的生長(zhǎng)速度明顯快于未分選的細(xì)胞，這也表明p75NTR陽性細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力，符合其作為腫瘤干細(xì)胞的特性。侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最重要的生物學(xué)行為，是導(dǎo)致手術(shù)、放療、化療失敗和患者死亡的主要原因。劃痕實(shí)驗(yàn)證明p75NTR陽性細(xì)胞具有更強(qiáng)的遷移能力。由于2種細(xì)胞的生長(zhǎng)速度差別較大，所以在劃痕實(shí)驗(yàn)中沒有做同期的橫向比較。

綜上，筆者認(rèn)為p75NTR可作為舌鱗狀細(xì)胞癌干細(xì)胞的一種表面標(biāo)志物。由于本課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)p75NTR在正常舌組織中是陰性表達(dá)的[12]，那么針對(duì)p75NTR這個(gè)新的靶點(diǎn)對(duì)腫瘤進(jìn)行的治療就不會(huì)對(duì)正常舌干細(xì)胞構(gòu)成傷害。當(dāng)然，針對(duì)臨床應(yīng)用還需要更深入的研究，但是相信隨著研究的不斷進(jìn)展，其將有望為舌癌的臨床預(yù)防和診治開辟新的思路和策略。

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第2篇：細(xì)胞的生物學(xué)特性范文

【關(guān)鍵詞】骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)；細(xì)胞鑒定

【中圖分類號(hào)】R392.4【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】1044-5511（2011）11-0346-02

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-drived mes-enchymal stem cells,BMSCs是來源于骨髓的 MSCs，具有采集方便的優(yōu)點(diǎn)，是理想的組織工程種子細(xì)胞［1］具有多向分化和自我復(fù)制潛能,易于自體采集、無免疫排斥反應(yīng)、避免倫理學(xué)限制等優(yōu)點(diǎn),在細(xì)胞治療方面得到了廣泛的應(yīng)用。但是BMSCs在骨髓微環(huán)境中所占比例極少,使用何種簡(jiǎn)單操作方法快速獲取形態(tài)均一和純度較高的BMSCs便成為該研究領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)［2］。本實(shí)驗(yàn)采用全骨髓貼壁細(xì)胞培養(yǎng)法和密度梯度離心法相結(jié)合分離、純化BMSCs，通過體外培養(yǎng)擴(kuò)增，以及流式細(xì)胞術(shù)鑒定，建立穩(wěn)定的BMSCs培養(yǎng)擴(kuò)增方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：日本大耳白兔4只，4周齡，雌雄不限，體重250~300g，購于蘭州生物制品研究所。

1.2 主要試劑及儀器：二氧化碳培養(yǎng)箱(BB16UV型,德國Heraeus公司)、超凈工作臺(tái)(VS-1300L型,蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限責(zé)任公司)、倒置相差顯微鏡、超聲波清洗儀、純凈水系統(tǒng)、酸度計(jì)、臺(tái)式高速離心機(jī)(北京科偉永鑫實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備廠)、低糖培養(yǎng)基(GBICO公司)、胎牛血清（杭州四季青）、谷氨酰胺、青鏈霉素、胰酶、流式細(xì)胞抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）。

1.3 兔BMSCs的采集： 取4周齡日本大耳白兔一只，雌雄不限，20ml空針空氣栓子經(jīng)耳緣靜脈注入，待兔死亡后，將其全部浸泡于75%酒精溶液內(nèi)8~10分鐘，在無菌環(huán)境下切開前后肢皮膚，切下兔前后兩肢，剃去覆蓋于肱骨、脛骨及股骨上的肌肉組織，注意保留骨的完整性，用組織剪分離股骨、脛骨及肱骨，將其置于無菌培養(yǎng)皿中，縱向依次剪開各長(zhǎng)骨兩端，5ml注射器沿剪開的骨端注入L-DMEM沖洗3次，收集沖洗液約10ml，用篩網(wǎng)過濾沖洗液，加入完全低糖培養(yǎng)基重懸組織沖洗液，吸管反復(fù)吹打混勻，1000 r/ min ，4 ℃，離心 5 min ，棄去上清。再次加入適量完全低糖培養(yǎng)基，吹打混勻，分別加入一次性培養(yǎng)皿中，放入37℃，體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（圖1）。

1.4 兔 BMSCs 培養(yǎng)：1.4.1 原代 BMSCs 培養(yǎng) 向分離得到的細(xì)胞組織懸液加入 10ml 含 20 %胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的 L-DMEM 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至中號(hào)塑料培養(yǎng)皿內(nèi)。將培養(yǎng)皿置于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為 5 %的 CO2孵箱中培養(yǎng)。培養(yǎng) 72 h后使用含 20 %FBS 的 L-DMEM 完全培養(yǎng)基換液。原代培養(yǎng) 5-7 天后，細(xì)胞融合可達(dá) 80 %以上。將原代培養(yǎng)的 BMSCs 在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞集落的形成和細(xì)胞形態(tài)（圖2）。

1.4.2 傳代 BMSCs 培養(yǎng) 待原代細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底后，用EDTA胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，F(xiàn)BS 終止消化后將細(xì)胞懸液以 1:3 比例接種于新培養(yǎng)瓶中，加入含 10 %FBS 的 L-DMEM完全培養(yǎng)基 5ml 培養(yǎng)，每隔 2 天換液，約 3-4 天后細(xì)胞可鋪滿瓶底。將傳代培養(yǎng)的 BMSCs 在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。以此方法，向后傳至三代（圖3、4）。

1.5 兔 BMSCs的鑒定

對(duì)干細(xì)胞的鑒定主要是建立在對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)記物的識(shí)別基礎(chǔ)上，采用流式細(xì)胞儀特有的細(xì)胞分析技術(shù)，可在短時(shí)間內(nèi)精確分析出細(xì)胞表型以及其所占有的比例，使用間接標(biāo)記法標(biāo)記 CD44、CD34。取第3 代 BMSCs 以 2.0×105/mL 重懸，PBS 洗滌細(xì)胞 3次，向細(xì)胞懸液中加入鼠抗兔CD44、CD34 （稀釋 1:100） 為一抗，4 ℃保存 30 min，加入羊抗鼠含 FITC、PE 的二抗，4 ℃避光保存 30min。PBS 洗滌細(xì)胞 3 次后放入流式細(xì)胞儀中檢測(cè)。記錄數(shù)據(jù)（圖5、6）。

2 討論

BMSCs具有貼壁性、具有強(qiáng)大的增殖能力和多向分化潛能、具有免疫調(diào)節(jié)功能、具有來源方便，易于分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增和純化，多次傳代擴(kuò)增后仍具有干細(xì)胞特性，不存在免疫排斥的特性。

2.1更好地增加BMSCs的貼壁性： 在BMSCs培養(yǎng)中，細(xì)胞貼壁培養(yǎng)與傳代成功與否是本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。其中存在很多問題，比如在細(xì)胞貼壁方面，用一次性塑料培養(yǎng)皿效果要優(yōu)于可重復(fù)使用的玻璃培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿。塑料培養(yǎng)皿內(nèi)壁有一層鼠尾膠原，它可以更好地促使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁。

2.2 培養(yǎng)基最佳的酸堿度： 培養(yǎng)基中加碳酸氫鈉的目的，是為了在二氧化碳培養(yǎng)箱中平衡培養(yǎng)基中的PH值。對(duì)于GBICO的DMEM培養(yǎng)基，3.7g是對(duì)應(yīng)二氧化碳培養(yǎng)箱的二氧化碳濃度設(shè)定在10%，而5%的則對(duì)應(yīng)的是2g碳酸氫鈉。暴露在空氣中的培養(yǎng)液，因?yàn)榇髿庵卸趸嫉臐舛群艿?，液體中的二氧化碳會(huì)氣體分壓高于大氣，因此會(huì)逐漸溢出，濃度逐漸降低，液體的PH值也逐漸升高，如果DMEM在空氣中存放時(shí)間過長(zhǎng)，它將有可能變成紫紅色。一般新配置的顏色正常，在多次開蓋，培養(yǎng)液接觸空氣的時(shí)間較長(zhǎng)后，顏色會(huì)逐漸變成紫紅色，筆者的做法是，配制培養(yǎng)液時(shí)加hepes，用小容量的分裝瓶分裝，及盡量減少培養(yǎng)液與空氣的接觸時(shí)間。配培養(yǎng)基時(shí)，將酸堿度調(diào)至6.9-7.0，過濾后酸堿度會(huì)適當(dāng)增高。

2.3 傳代的注意事項(xiàng)

2.3.1 EDTA-胰酶最佳消化時(shí)間：具筆者在試驗(yàn)中的觀察，在BMSCs傳代過程中，根據(jù)培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中貼壁細(xì)胞的覆蓋率確定，當(dāng)BMSCs貼壁達(dá)到80%-90%就可以傳代了，用玻璃尖吸管滴入EDTA-胰酶4-7滴，在倒置相差顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞70%由原來的紡錘狀、梭形變化為橢圓形時(shí)為最佳時(shí)間，一般為1至2分鐘。

2.3.2 加入EDTA-胰酶后的吹打時(shí)間與次數(shù) ：加入EDTA-胰酶后，靜置1分鐘，在鏡下觀察細(xì)胞變橢圓或圓形，并有輕度漂浮時(shí)，用尖吸管輕輕吹打3-6次即可。

2.3.3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞特異性標(biāo)志物： 雖然目前尚未發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞特異性標(biāo)志物，Pittenger等認(rèn)為CD29、CD44、CD105、CD166、SH2、SH3為間充質(zhì)干細(xì)胞的重要標(biāo)志物［3］。

綜上所述，對(duì) BMSCs 的形態(tài)學(xué)觀察和表型分子鑒定實(shí)驗(yàn)均證實(shí)培養(yǎng)傳代的 BMSCs 的生物學(xué)特性并未發(fā)生明顯改變，說明本實(shí)驗(yàn)的分離培養(yǎng)擴(kuò)增方法安全有效。本實(shí)驗(yàn)成功的建立了一系列分離、體外培養(yǎng)和擴(kuò)增兔 BMSCs 的實(shí)驗(yàn)方法，為進(jìn)一步組織工程研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

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［2］骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及生物學(xué)特性 陳建梅姚榮偉 李勇 張馥敏 江蘇醫(yī)藥2010年10月第36卷第19期2306-2308

第3篇：細(xì)胞的生物學(xué)特性范文

關(guān)鍵詞：5-aza-dc；延邊奶山羊；細(xì)胞活率；細(xì)胞形態(tài)；細(xì)胞凋亡

中圖分類號(hào)：S827 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）12-2862-04

Effect of 5-aza-dc on the Biological Characteristics of Yanbian Dairy Goat Ear Fibroblast Cell

CAI Li-juan，YIN Duo，ZHUANG Li-li，F(xiàn)NAG Nan-zhu，LI Zhong-shu

（Animal Genetic and Breeding Reproduction Laboratory， Agricultural College， Yanbian University， Yanji 133002，Jilin，China）

Abstract： To research the effects of DNA methylation inhibitor 5-aza-dc on biological characteristics of Yanbian dairy goat ear fibroblast cell， MTT method was used to determine the optimal action concentration and time of 5-aza-dc on Yanbian dairy goat ear fibroblast cells. PI and Hochest33342 double staining， agarose gel electrophoresis were used to detect apoptosis of the cells； and karyotype analysis to measure the effect of 5-aza-dc on the chromosomes. The results showed low concentration（≤0.010 μmol/L） of 5-aza-dC treatment for 72 h had little effect on the cells. With the increasing of concentration， cell morphology， viability， apoptosis and chromosomes were all significantly affected. The best processing time of 5-aza-dc was 72 h， low concentration of 5-aza-dc did not lead to apoptosis and karyotype change.

Key words： 5-aza-dc； Yanbian dairy goat； cell morphology； cell viability； cell apoptosis

體細(xì)胞核移植是哺乳動(dòng)物胚胎工程的主要組成部分，也一直是研究的熱點(diǎn)。然而核移植研究中仍然存在著許多問題，如核移植效率低、胚胎發(fā)育異常、流產(chǎn)、畸形等。大量研究表明，體細(xì)胞核移植所用的供體細(xì)胞（成纖維細(xì)胞、顆粒細(xì)胞等）都是高度分化的細(xì)胞，具有較高的甲基化水平，在與受體細(xì)胞融合時(shí)需要經(jīng)過去甲基化才能維持胚胎正常發(fā)育，如果重構(gòu)胚基因組DNA的甲基化模式存在異常，可引起特定基因轉(zhuǎn)錄模式發(fā)生改變，從而導(dǎo)致重構(gòu)胚發(fā)育異常。因此，有必要尋找一種降低DNA甲基化水平，進(jìn)而改善核移植效率的方法。5-氮-2′-脫氧胞嘧啶核苷（5-aza-dc）是一種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，為正常胞嘧啶核苷的類似物。在細(xì)胞內(nèi)這種核苷類似物可以轉(zhuǎn)化為脫氧核苷三磷酸，并在DNA復(fù)制的過程中替代正常的胞嘧啶核苷酸參與到延伸的DNA鏈中，一旦進(jìn)入DNA雙鏈后，它們所含有的修飾堿基——5-氮胞嘧啶可以與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶共價(jià)結(jié)合，使酶的活性降低，最終使處理細(xì)胞基因組DNA發(fā)生去甲基化；有研究表明DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-dc處理牛供體細(xì)胞，能有效降低其甲基化水平[1，2]。舒金輝[3]利用5-aza-dc（0.005～0.09 μmol/L）處理水牛成纖維細(xì)胞，顯著降低了供體細(xì)胞的甲基化水平并提高了隨后核移植的效率。延邊奶山羊耳成纖維細(xì)胞作為延邊奶山羊體細(xì)胞克隆的核供體有重要的研究意義。因此，本研究旨在探討5-aza-dc對(duì)延邊奶山羊體細(xì)胞克隆供體細(xì)胞的影響，為提高延邊奶山羊體細(xì)胞克隆效率提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

1.1.1 試劑 DMEM、EDTA、DMSO、5-aza-dc（DMSO預(yù)融，超純水配制成0.25 mg/mL的濃縮液備用）、PI、Hochest33342、MTT、Giemsa染液、胰蛋白酶及其他基礎(chǔ)藥類均購自SIGMA中國有限公司，胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，DNA提取試劑盒購自寶生物（大連）有限公司。

1.1.2 材料 延邊奶山羊耳部組織塊。剪取奶山羊（母）耳部血管較少處組織，大約1.5×2.0 cm2。用PBS沖洗1次，75%酒精浸泡30 s，再用PBS沖洗3次，最后將組織塊剪碎。經(jīng)過3～5次PBS及胰蛋白酶洗滌后，均勻接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，5 h后加含15% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液[4]。每3～5 d換液1次。當(dāng)原代細(xì)胞匯合至80%時(shí)，消化傳代，3代以后的成纖維細(xì)胞可用于試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 5-aza-dc處理延邊奶山羊耳成纖維細(xì)胞 取3代以上的延邊奶山羊耳成纖維細(xì)胞，消化傳代，調(diào)整細(xì)胞密度為105個(gè)/mL，接種于24孔或96孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，改用添加5-aza-dc的10%DMEM培養(yǎng)液分別培養(yǎng)。5-aza-dc的濃度設(shè)定為0、0.005、0.010、0.030、0.050、0.100 μmol/L。

1.2.2 5-aza-dc對(duì)細(xì)胞活率的影響 不同濃度（0、0.005、0.010、0.030、0.050、0.100 μmol/L）的5-aza-dc各處理成纖維細(xì)胞24、48、72、96 h后，96孔板每孔添加5 mg/mL MTT 10 μL，作用4 h 后，吸出培養(yǎng)液，每孔添加150 μL DMSO，振蕩10 min，酶聯(lián)反應(yīng)儀測(cè)492 nm處的OD值。

1.2.3 5-aza-dc對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響 不同濃度（0、0.005、0.010、0.030、0.050、0.100 μmol/L）的5-aza-dc處理成纖維細(xì)胞72 h后，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.4 5-aza-dc對(duì)細(xì)胞染色體的影響 不同濃度（同上）的5-aza-dc處理成纖維細(xì)胞72 h后，換液，每孔添加50 μL秋水仙素，2.5～3.0 h后，消化懸浮細(xì)胞，1 000 r/min 離心10 min，37 ℃預(yù)溫的0.075 mol/L KCl低滲處理30 min后，用新鮮固定液（甲醛∶冰醋酸=18∶7，V/V）固定細(xì)胞2次，最后用0.5～1.0 mL固定液懸浮細(xì)胞，滴片，Giemsa染色，干燥后于油鏡觀察[5]。每組處理選取一定數(shù)量的清晰分裂相，記錄變異的染色體數(shù)目。

1.2.5 5-aza-dc對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

1）Hochest33342/PI雙染法熒光顯色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。不同濃度（同上）的5-aza-dc處理成纖維細(xì)胞72 h后，消化懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為106個(gè)/mL，加入5 μg/mL的Hochest33342熒光染色，37 ℃避光孵育10 min，離心去上清，用培養(yǎng)液懸浮，加入5 μg/mL的PI染色液，4 ℃冰箱孵育15 min，熒光顯微鏡下觀察[6]。

2）瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。不同濃度（同上）的5-aza-dc處理成纖維細(xì)胞72 h后，消化收集細(xì)胞于1.5 mL離心管中，5 000 r/min離心5 min，500 μL PBS懸浮細(xì)胞后，按DNA提取試劑盒步驟提取DNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)使用SPSS17.0進(jìn)行分析，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）的方法處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 5-aza-dc對(duì)細(xì)胞活率的影響

由表1可知，不同濃度的5-aza-dc分別培養(yǎng)延邊奶山羊耳成纖維細(xì)胞24、48、72、96 h后的細(xì)胞活率，比較可知72 h組效果較好，且與48 h、96 h組差異不顯著，因此后續(xù)試驗(yàn)中細(xì)胞均處理72 h。

2.2 5-aza-dc對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響

由圖1可知，未經(jīng)5-aza-dc處理的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，接觸緊密，細(xì)胞大小均一，生長(zhǎng)速度較快。而經(jīng)過5-aza-dc處理后的細(xì)胞隨著5-aza-dc濃度的升高，細(xì)胞變得細(xì)長(zhǎng)，生長(zhǎng)緩慢，細(xì)胞間隙增大，形態(tài)不規(guī)則，甚至有的地方細(xì)胞大片脫壁死亡。

2.3 5-aza-dc對(duì)細(xì)胞染色體的影響

采用常規(guī)核型分析方法，分析不同濃度的5-aza-dc處理的延邊奶山羊耳成纖維細(xì)胞，每個(gè)處理組選取50個(gè)分散較好的清晰分裂相，統(tǒng)計(jì)畸變?nèi)旧w概率。由圖2可知，當(dāng)濃度≤0.010 μmol/L時(shí)，染色體畸變率對(duì)照組與其他兩組差異不顯著；當(dāng)濃度≥0.030 μmol/L時(shí)染色體畸變率顯著增加，出現(xiàn)多倍體（圖3）。當(dāng)濃度達(dá)到0.1 μmol/L時(shí)，染色體畸變率達(dá)到12%。

2.4 5-aza-dc對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

2.4.1 Hochest33342/PI雙染法熒光顯色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 Hochest33342/PI雙染色后，在熒光顯微鏡下可見凋亡細(xì)胞呈強(qiáng)藍(lán)色、弱紅色熒光，壞死細(xì)胞呈強(qiáng)紅色，而正常的細(xì)胞則呈弱藍(lán)色熒光。當(dāng)濃度為0、0.005、0.010 μmol/L時(shí)，凋亡細(xì)胞較少；濃度≥0.030 μmol/L時(shí)出現(xiàn)較多凋亡細(xì)胞；濃度為0.100 μmol/L時(shí)，細(xì)胞凋亡增加，死細(xì)胞數(shù)目也增多。如圖4所示。

2.4.2 瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 由圖5可知，當(dāng)濃度≤0.010 μmol/L時(shí)，細(xì)胞無拖帶現(xiàn)象，說明無凋亡細(xì)胞；濃度≥0.030 μmol/L時(shí)開始出現(xiàn)拖帶現(xiàn)象，說明出現(xiàn)凋亡細(xì)胞；濃度為0.050、0.100 μmol/L時(shí)，細(xì)胞大量凋亡，拖帶現(xiàn)象明顯。

3 討論

3.1 5-aza-dc對(duì)細(xì)胞活率、細(xì)胞形態(tài)的影響

5-aza-dc是一種典型的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，為胞嘧啶核苷的類似物。Kumar等[7]利用0、0.5、1.0、2.0、3.0 μmol/L的5-aza-dc處理第五代豬胎兒成纖維細(xì)胞（PFF），發(fā)現(xiàn)不同濃度的5-aza-dc均抑制PFF的生長(zhǎng)，較高濃度的5-aza-dc處理會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的形態(tài)和染色體的倍性發(fā)生改變。Enright等[8]對(duì)供體成纖維細(xì)胞進(jìn)行5-aza-dc處理后發(fā)現(xiàn)高劑量5-aza-dc（0.08～0.31 μmol/L）可以降低細(xì)胞甲基化水平，其研究也發(fā)現(xiàn)5-aza-dc處理72 h為最佳處理時(shí)間。鑒于5-aza-dc對(duì)細(xì)胞的毒性作用，本試驗(yàn)采用較低濃度的5-aza-dc（0～0.100 μmol/L）處理延邊奶山羊耳成纖維細(xì)胞。結(jié)果表明，經(jīng)5-aza-dc處理后的細(xì)胞生長(zhǎng)速度、形態(tài)等與對(duì)照組相比無明顯差異，說明延邊奶山羊耳成纖維細(xì)胞對(duì)5-aza-dc具有較強(qiáng)的耐受性。但是隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)改變、死亡數(shù)增多，逐漸出現(xiàn)脫壁等現(xiàn)象，這可能是與5-aza-dc對(duì)細(xì)胞的毒性有關(guān)。這與Kumar等[7]的試驗(yàn)結(jié)果一致。

3.2 5-aza-dc對(duì)細(xì)胞染色體的影響

有研究證明，供體細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境以及藥物等處理會(huì)導(dǎo)致其染色體異常，進(jìn)而引起隨后NT胚胎染色體異常，說明在核移植前首先檢查供體細(xì)胞的染色體還是必要的[9]。本試驗(yàn)使用常規(guī)染色體核型分析方法，即經(jīng)低滲、固定、Giemsa染色等步驟后，滴片制備染色體標(biāo)本。結(jié)果表明，高濃度的5-aza-dc對(duì)細(xì)胞染色體有致畸作用，濃度越高染色體出現(xiàn)異常的幾率越大；而低濃度（≤0.010 μmol/L）對(duì)染色體影響不大。通過瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證高濃度的5-aza-dc對(duì)染色體的影響，可見明顯的拖帶現(xiàn)象，分析原因可能是染色體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，如斷裂等。

3.3 5-aza-dc對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

PI、Hochest33342均可與細(xì)胞核DNA（或RNA）結(jié)合。但是PI不能通過正常的細(xì)胞膜，Hochest33342則為膜通透性的熒光染料，故細(xì)胞在處于壞死或晚期凋亡時(shí)細(xì)胞膜被破壞，這時(shí)可為PI著紅色。本研究用5-aza-dc處理延邊奶山羊耳成纖維細(xì)胞72 h后，觀察不同的濃度對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，采用Hochest33342和PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，在熒光顯微鏡下可見凋亡細(xì)胞呈強(qiáng)藍(lán)色、弱紅色熒光，壞死細(xì)胞呈強(qiáng)紅色，而正常的細(xì)胞則呈弱藍(lán)色熒光。正常細(xì)胞和中早期凋亡細(xì)胞均可被Hochest33342著色，但是正常細(xì)胞核的Hochest33342著色的形態(tài)呈圓形，淡藍(lán)色，內(nèi)有較深的藍(lán)色顆粒；而凋亡細(xì)胞的核由于濃集而呈亮藍(lán)色，或核呈分葉，碎片狀。細(xì)胞凋亡最明顯的生化特征是Ca2+、Mg2+依賴的內(nèi)源性核酸酶的激活，細(xì)胞核染色體從核小體間斷裂成180～200 bp的寡核苷酸片段。針對(duì)這些片段應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)。凋亡細(xì)胞呈明顯的梯狀條帶。本研究通過瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果可見，0～0.010 μmol/L幾組都沒有出現(xiàn)明顯的拖帶現(xiàn)象，而從0.030 μmol/L組就開始有拖帶現(xiàn)象，0.050 μmol/L 和0.100 μmol/L濃度組與對(duì)照組相比細(xì)胞發(fā)生凋亡的比例顯著增加。此結(jié)果進(jìn)一步證明高濃度的5-aza-dc可以導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

5-aza-dc處理延邊奶山羊成纖維細(xì)胞適宜時(shí)間為72 h，隨著5-aza-dc處理濃度的升高，細(xì)胞形態(tài)有所改變，接觸不緊密。當(dāng)濃度升高到0.100 μmol/L時(shí)大片細(xì)胞脫壁死亡；當(dāng)濃度≥0.030 μmol/L時(shí)，染色體畸變率顯著增加，0.005 μmol/L和0.010 μmol/L組對(duì)染色體核型的影響與對(duì)照組相比差異不顯著；瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)經(jīng)5-aza-dc處理的細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果表明高濃度的5-aza-dc可以導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，低濃度的5-aza-dc對(duì)細(xì)胞凋亡的影響較小。以上說明高濃度的5-aza-dc對(duì)細(xì)胞有一定毒性作用，但是低濃度對(duì)細(xì)胞影響較小，可以應(yīng)用低濃度的5-aza-dc作為DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑處理供體成纖維細(xì)胞，嘗試建立一種既不影響成纖維細(xì)胞生物學(xué)特性，又可以降低供體細(xì)胞核的甲基化狀態(tài)的方法，從而提供一種提高體細(xì)胞核移植效率的方法。

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第4篇：細(xì)胞的生物學(xué)特性范文

【關(guān)鍵詞】中醫(yī)；生物學(xué)；生物技術(shù)；研究

【中圖分類號(hào)】Q81 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1008-6455（2010）11-0248-02

Study of TCM bioengineeing

Ouyang Xuejian

【Abstract】From angle of TCM bioengineering probe into TCM basic theory and way of study, to basis of TCM and clinical research mean much.

【Key words】traditional chinese medicine (TCM); biology; biotechnology; study

隨著TCM的不斷創(chuàng)新，用現(xiàn)代中醫(yī)生物學(xué)的研究手段，完善TCM的基礎(chǔ)理論是必經(jīng)之路。

1生命之書

1960年首次被破譯遺傳密碼，分子生物學(xué)家對(duì)復(fù)雜的細(xì)胞分子進(jìn)行了分類。人類基因從遠(yuǎn)古到現(xiàn)代以密碼的形式表達(dá)出來，展現(xiàn)在科學(xué)家面前。常有一種誤解基因代表每個(gè)特性，這種誤解并沒有因基因測(cè)序而被消除，并被加強(qiáng)了這是因?yàn)閱位虿”挥懻揫1]，事實(shí)上許多遺傳性疾病是由多個(gè)基因以某種未知方式相互作用的結(jié)果。人類基因組的解譯，象征著思想變革的始點(diǎn)走向未來。

2生物學(xué)革命

細(xì)胞生物學(xué)革命并不是基因組的解譯，而是基因行為方式和序列間相互作用的發(fā)現(xiàn)，但必須通過實(shí)驗(yàn)才能得到體現(xiàn), 即閱讀細(xì)胞故事要?dú)w功于生物學(xué)-DNA芯片[2]。它能同時(shí)觀測(cè)許多基因行為的是基因組測(cè)序。即一個(gè)細(xì)胞隨時(shí)有數(shù)千個(gè)基因開啟，它不僅開啟一個(gè)或兩個(gè)基因來完成任務(wù)，并在任務(wù)完成后再將它們關(guān)閉，但其理論的構(gòu)建并不是輕易獲得的。分子和細(xì)胞生物學(xué)[8]，簡(jiǎn)潔一流的理論很少見，蛋白質(zhì)A開啟了蛋白質(zhì)B，然后激活蛋白質(zhì)C，如果大家能理解將對(duì)研究很有幫助。生物學(xué)家并引入了物理學(xué)概念，尋找簡(jiǎn)潔一流理論，但是并不表明研究的系統(tǒng)是簡(jiǎn)潔的。物理學(xué)家設(shè)計(jì)的理論用于解釋大量分子行為，如氧的彌散在介質(zhì)的作用下，個(gè)體特性會(huì)淹沒在團(tuán)體行為的模式下?；蚝偷鞍踪|(zhì)更具挑戰(zhàn)性，因?yàn)樗鼈儾灰苿?dòng)，不隨機(jī)相互作用，但能選擇性的參與某一功能性活動(dòng)?；瘜W(xué)提供了另一組工具，一些非生命系統(tǒng)中的化學(xué)過程與生物化學(xué)過程一樣復(fù)雜混亂，但并不妨礙被計(jì)算機(jī)模型所獲取，其結(jié)論是使復(fù)雜的模型簡(jiǎn)單化，原因是一些成分可以被忽略。

3計(jì)算機(jī)模擬藝術(shù)

它不僅分析數(shù)據(jù)也是一種重要工具。物理學(xué)家把其藝術(shù)帶入到了精密狀態(tài)，天體物理學(xué)家能模擬整個(gè)星系世界，生物學(xué)家就能模擬細(xì)胞的微觀世界。計(jì)算機(jī)模擬復(fù)雜的真實(shí)細(xì)胞，預(yù)測(cè)基因活性與細(xì)胞功能變化的基因組，并建立了數(shù)據(jù)庫。研究細(xì)胞中多種過程的比較模型，許多蛋白質(zhì)能同時(shí)催化大范圍化學(xué)反應(yīng)，不同反應(yīng)的相對(duì)重要性會(huì)因基因被激活而產(chǎn)生某種蛋白而再次關(guān)閉，來模擬整個(gè)細(xì)胞行為。工程學(xué)認(rèn)為一個(gè)細(xì)胞事件不會(huì)簡(jiǎn)單的導(dǎo)致某一事件發(fā)生，有時(shí)一個(gè)過程會(huì)影響某個(gè)過程發(fā)生，用工程學(xué)術(shù)語描述就是反饋。即角加速時(shí)人體向一側(cè)傾倒，此時(shí)膜半規(guī)管內(nèi)淋巴液向相反方向流動(dòng)刺壺腹嵴產(chǎn)生神經(jīng)沖動(dòng)，傳至平衡中樞維持人體平衡，這就是人置與平衡中樞間的反饋，這種自我調(diào)節(jié)在工程學(xué)中十分常見。即可用“控制論”和“系統(tǒng)論”來描述它，生物學(xué)家已應(yīng)用在細(xì)胞中。描述生物學(xué)功能包含擴(kuò)大、改編、加強(qiáng)、絕緣、糾錯(cuò)和一致性檢測(cè)等概念。描述新的生物學(xué)語言將來源于綜合科學(xué)，即計(jì)算機(jī)科學(xué)或生物工程學(xué)等學(xué)科[3、4]。

4網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)

世界范圍互聯(lián)網(wǎng)中的信息總是最新的，那里有通信、高速公路、鐵路、航運(yùn)等，為網(wǎng)路提供能量、電流、水、物質(zhì)、友誼等，細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)它們是如此相似。細(xì)胞中每一類分子都視為網(wǎng)絡(luò)的組成部分，任何兩個(gè)分子之間均有聯(lián)系，共同參與生物化學(xué)反應(yīng)，結(jié)論就是細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)與許多社會(huì)網(wǎng)絡(luò)一樣，有著相同的連通結(jié)構(gòu)。這樣的共性對(duì)于定義基因間的相互作用很有幫助，但并不是所有網(wǎng)絡(luò)都相同[5、6]，有時(shí)幾個(gè)連接破壞而迅速瓦解，有時(shí)即便有許多連接被破壞，任何兩個(gè)節(jié)點(diǎn)間仍可保持通暢，細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)也是如此。理解了生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)的特點(diǎn)，為組建細(xì)胞自身系統(tǒng)對(duì)其研究奠定了基礎(chǔ)。

5生物學(xué)模塊

基因通常結(jié)隊(duì)工作當(dāng)細(xì)胞分解糖產(chǎn)生能量，激活一組基因來產(chǎn)生各自所需要的酶[7]。理論生物學(xué)家提示如果能夠找出這類“聯(lián)合作業(yè)”，并將其視為獨(dú)立分子來理解細(xì)胞的復(fù)雜活動(dòng)。即一部分制造蛋白質(zhì)，一部分復(fù)制細(xì)胞分裂的DNA，其他部分對(duì)特殊的酶做出響應(yīng)等等。但這些分子不是基因簡(jiǎn)單的組合,它們包括了蛋白質(zhì)，RNA小信號(hào)分子和富含能量的分子，即酶等共同執(zhí)行其功能, 蛋白質(zhì)組學(xué)顯示了它的特殊貢獻(xiàn)。即細(xì)胞分裂模塊包裹在膜內(nèi)，如線粒體是能量的“工廠”。就像組建大樓一樣，模塊之間通過一類或幾類介質(zhì)分子相互聯(lián)系，各部門備有“辦公室備忘錄”這就解決了每個(gè)突發(fā)件事的需要?？上胂笤O(shè)計(jì)一種更精密的特定模塊，其小部分分子間相互作用的模塊延伸到整個(gè)細(xì)胞。模塊的功能來自其他模塊一部分輸入，并產(chǎn)生輸出影響其他模塊。其集體行為的概念類似于生物物理學(xué)概念，能表現(xiàn)模塊的特性。即模塊大部分功能特征，來自于潛在成分的特征與它們之間相互作用集合的特征。這對(duì)于生物學(xué)家來說是陌生的，但將來會(huì)習(xí)慣這樣的描述。

6TCM生物學(xué)

TCM生物學(xué)家用生物學(xué)微觀實(shí)驗(yàn)手段，即分子與細(xì)胞生物學(xué)、網(wǎng)絡(luò)工程、生物學(xué)工程、生物物理學(xué)等[8-11]，模擬與解釋TCM的基本理論。需要生物工程、網(wǎng)絡(luò)工程與程序工程等共同參與形成綜合性科學(xué)。TCM把“天體”對(duì)生物體的影響都考慮進(jìn)去了，在疾病診治基本原則的基礎(chǔ)上還考慮了季節(jié)變化。即冬天益氣活血，溫腎助陽；春天滋陰潤肺，滋腎柔肝；夏天養(yǎng)心安神，清熱解毒；秋天健脾溫腎，滋陰補(bǔ)血。TCM早已認(rèn)識(shí)到天體變化對(duì)人體的影響，并應(yīng)用在臨床實(shí)踐中。至于經(jīng)絡(luò)到底是什么還沒有誰在人體內(nèi)剖析出來，但臨床工作中銀針證實(shí)了它的存在，并以唯物主義的客觀事實(shí)傳承下來，如何完善它是今后研究的方向。

7TCM診療技術(shù)

TCM的基礎(chǔ)理論與臨床診療技術(shù)是根本，特別是中草藥、民間醫(yī)學(xué)很多精髓尚未開發(fā)。如西醫(yī)治療感冒居高不下的體溫(40℃)什么手段都用上了，TCM一付湯藥就能控制體溫即治愈。腫瘤壓迫所致的面神經(jīng)麻痹，TCM不用開刀減壓針灸就能矯正，這說出來好象不可思議但TCM做到了，TCM就是這么神氣有待進(jìn)一步挖掘。TCM不僅應(yīng)懂得自身的基礎(chǔ)理論，并從生物學(xué)角度解釋出來，讓世人相信TCM接受TCM，讓TCM走向世界。

參考文獻(xiàn)

第5篇：細(xì)胞的生物學(xué)特性范文

關(guān)鍵詞：神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體；PRL瘤；生物學(xué)特性

PRL瘤是臨床常見的具有高分泌功能的良性腫瘤，約占所有垂體腺瘤的40%～60%[1]，其主要臨床表現(xiàn)為閉經(jīng)、溢乳、不孕（育）、高泌乳素血癥、垂體占位性病變。既往研究認(rèn)為神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）對(duì)PRL瘤有負(fù)性調(diào)節(jié)作用[2]，本研究旨在探討PRL瘤表達(dá)p75-NGFR與其生物學(xué)特性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2008年2月～2013年10月我院收治的82例PRL瘤患者作為研究對(duì)象，其中男性37例，女性45例；年齡19～65歲，平均（38.1±8.5）歲；術(shù)前泌乳素水平300～600 ng/ml 26例，100～300ng/ml 40例，50～100ng/ml 16例；腫瘤體積5.6～47.2 mm3，平均（16.7±7.5）mm3；腫瘤直徑≤10 mm 27例，腫瘤直徑>10 mm 55例；非侵襲性腫瘤45例，侵襲性腫瘤37例。

1.2方法

1.2.1 p75-NGFR表達(dá)檢測(cè) ①標(biāo)本處理及免疫組化：PRL瘤組織標(biāo)本均常規(guī)石蠟包埋，作5 mm連續(xù)切片，用抗生蛋白鏈菌素生物素復(fù)合體（SABC）法作免疫組化染色。以PBS代替一抗為陰性對(duì)照，用已知的陽性片為陽性對(duì)照。②計(jì)算標(biāo)記指數(shù)：在光學(xué)顯微鏡400倍視野下，每張切片隨機(jī)取10個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，總共計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞。標(biāo)記指數(shù)=（1000個(gè)細(xì)胞內(nèi)染色為陽性的細(xì)胞數(shù)/1000）×100%。③結(jié)果判斷：標(biāo)記指數(shù)

1.2.2 PRL瘤侵襲性判斷標(biāo)準(zhǔn)[3] 有下列情況之一者認(rèn)為腫瘤具有侵襲性：①術(shù)前影像學(xué)檢查顯示腫瘤包繞單側(cè)或雙側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈，或侵入海綿竇生長(zhǎng)；②術(shù)中可見鞍底骨質(zhì)破壞；③術(shù)后鞍底硬膜送檢有腫瘤細(xì)胞浸潤。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料用百分率（%）表示，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（MEAN±SD）表示。p75-NGFR表達(dá)陽性率比較采用四格表χ2檢驗(yàn)，ALD比較采用成組設(shè)計(jì)t檢驗(yàn)，P

2 結(jié)果

2.1 PRL瘤患者p75-NGFR表達(dá)陽性率 82例PRL瘤患者，32例p75-NGFR表達(dá)陽性，陽性率為39.0%。

2.2 p75-NGFR與PRL瘤生物學(xué)特性的關(guān)系 男性組與女性組p75-NGFR表達(dá)陽性率、ALD相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；血清泌乳素≤300 ng/ml組p75-NGFR表達(dá)陽性率、ALD顯著高于血清泌乳素>300 ng/ml組（P10mm組（P

3 討論

垂體腺瘤是目前臨床上常見的良性腫瘤，約占顱內(nèi)腫瘤的10%，在顱內(nèi)腫瘤中僅低于腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤與腦膜瘤[4]。根據(jù)細(xì)胞分泌功能分類法，垂體腺瘤可以分為PRL瘤、生長(zhǎng)激素垂體腺瘤、促腎上腺皮質(zhì)激素垂體腺瘤等，其中以PRL瘤最為常見。值得注意的是，臨床上可見部分PRL瘤患者呈侵襲性生長(zhǎng)且生長(zhǎng)速度快，術(shù)后很快就出現(xiàn)復(fù)發(fā)，并且易并發(fā)垂體瘤卒中，但是其發(fā)生機(jī)制至今尚未完全明確[5]。

NGF是第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營養(yǎng)家族成員，它通過結(jié)合NGFR發(fā)揮維持與促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞的存活、分化、成熟的作用。NGFR可以分為高親和力受體、低親和力受體兩大類，本研究中p75-NGFR是一個(gè)分子量為75kD的跨膜糖蛋白，屬于NGF的低親和力受體，它可結(jié)合神經(jīng)營養(yǎng)家族每一個(gè)成員，其主要作用是調(diào)節(jié)酪氨酸激酶活性，促進(jìn)NGF結(jié)合高親和力受體TrkA，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等[6]。有研究認(rèn)為PRL瘤表達(dá)p75-NGFR明顯高于其他類型垂體腺瘤[7]，但有關(guān)PRL瘤表達(dá)p75-NGFR與其生物學(xué)特性關(guān)系的研究較少見。為此，本研究共分析82例PRL瘤患者，結(jié)果顯示32例p75-NGFR表達(dá)陽性，陽性率為39.0%。通過進(jìn)一步分組、對(duì)比分析，結(jié)果顯示男性組與女性組p75-NGFR表達(dá)陽性率、ALD相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；血清泌乳素≤300 ng/ml組p75-NGFR表達(dá)陽性率、ALD顯著高于血清泌乳素>300 ng/ml組（P10mm組（P

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第6篇：細(xì)胞的生物學(xué)特性范文

《中國藥典》（2010年版）三部收載的生物技術(shù)類制品包括：EPO、IFNα1b、IFNα2a、IFNα2b、IFNγ、白細(xì)胞介素-2、G-CSF、GM-CSF、牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（BFGF）、人表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、SK等[3]；生長(zhǎng)激素，胰島素、阿替普酶等品種由《中國藥典（2010年版）二部》收載[4]?！稓W洲藥典》與《中國藥典》的編制體例有所不同。針對(duì)生物技術(shù)類制品，《歐洲藥典》制定了“重組技術(shù)制品總論”，闡述了生物技術(shù)類制品的定義、特性，并對(duì)生產(chǎn)工藝、過程控制提出了明確要求，是建立品種標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)和技術(shù)依托。在品種各論中，對(duì)產(chǎn)品的原液或原料藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定了具體要求。《中國藥典》則在“凡例”和“通則”中，對(duì)各類產(chǎn)品的共性技術(shù)要求進(jìn)行統(tǒng)一規(guī)定，在產(chǎn)品各論中，分別從原液、中間品到成品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和檢定進(jìn)行了具體規(guī)定。結(jié)合我國生物技術(shù)類制品現(xiàn)狀及研發(fā)趨勢(shì)，有必要參照《歐洲藥典》，制定“生物技術(shù)類制品總論”，并收載于2015年版《中國藥典》。

生物技術(shù)類制品質(zhì)量控制的主要因素

就生物技術(shù)類制品的質(zhì)量控制而言，生物學(xué)活性測(cè)定、理化特性分析和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究建立是十分重要的因素。生物學(xué)活性測(cè)定目前，生物技術(shù)類制品的生物學(xué)活性測(cè)定基本采用細(xì)胞增殖法。比較兩部藥典，最主要的差別在于檢測(cè)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，例如：可信限的設(shè)置?！吨袊幍洹穼?duì)此方面的規(guī)定尚不完善。生物檢定是以藥物的藥理作用為基礎(chǔ)，以生物統(tǒng)計(jì)為工具，運(yùn)用特定的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，在一定條件下比較供試品和標(biāo)準(zhǔn)品所產(chǎn)生的特定反應(yīng)，通過等反應(yīng)劑量間比例的運(yùn)算或限制劑量引起的生物反應(yīng)程度，從而測(cè)定供試品的效價(jià)、生物活性或雜質(zhì)引起的毒性[4]。由此可見，統(tǒng)計(jì)方法在生物學(xué)活性測(cè)定中的重要意義?！吨袊幍洹罚?015年版）三部擬收錄“生物檢定統(tǒng)計(jì)法”，進(jìn)一步完善制品生物檢定結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。理化特性分析《歐洲藥典》對(duì)制品的理化特性分析得比較清晰明確，每個(gè)制品均標(biāo)注了蛋白質(zhì)一級(jí)序列、二硫鍵的具置以及化學(xué)結(jié)構(gòu)式。蛋白質(zhì)的理化特性分析一般包括含量測(cè)定、純度分析、鑒別分析等項(xiàng)目。含量測(cè)定《中國藥典》附錄中規(guī)定的總蛋白檢測(cè)的方法多采用Lowry法，以人或牛白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品。人或牛白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品為非同質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，其氨基酸組成、化學(xué)結(jié)構(gòu)均與供試品不同，測(cè)量中引入了系統(tǒng)誤差，無法與同類進(jìn)口產(chǎn)品的質(zhì)量進(jìn)行比對(duì)分析，不利于制品質(zhì)量與國際接軌?！稓W洲藥典》一般采用紫外分光光度法和高效液相色譜法（HPLC），并采用同質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測(cè)定。純度分析純度分析即用限量標(biāo)準(zhǔn)控制制品中非藥效活性成分。《中國藥典》主要以十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳法、HPLC進(jìn)行控制。純度分析應(yīng)盡量依據(jù)蛋白質(zhì)不同的理化特性，選擇分析原理不同的檢測(cè)方法，二者相互補(bǔ)充。G-CSF、GM-CSF、BFGF、EGF、SK質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中采用分別基于蛋白質(zhì)分子大小和疏水特性的SDS-PAGE電泳法、反相高效液相色譜法（RP-HPLC）進(jìn)行分析；其余質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)均以SDS-PAGE電泳和分子篩這兩個(gè)基于一種分析原理的檢測(cè)方法對(duì)純度進(jìn)行控制?！吨袊幍洹穼?duì)主藥蛋白的含量作出了限值要求?！稓W洲藥典》對(duì)于制品的純度分析較為詳細(xì)，針對(duì)不同的分子采用不同的分析方法和具體的判定標(biāo)準(zhǔn)。以IFNγ1b為例，純度分析包括了共價(jià)二聚體和低聚物、單體和多聚體、脫?；脱趸?、異質(zhì)二聚體、正亮氨酸及其他雜質(zhì)的限量要求；分別采用了分子排阻色譜法、離子交換色譜法、還原-非還原電泳法、高效液相氨基酸分析法。對(duì)于SDS-PAGE電泳等分辨率相對(duì)較低的方法，設(shè)立相應(yīng)控制帶以提高限量判定的準(zhǔn)確度?！稓W洲藥典》純度分析大致分為制品相關(guān)雜質(zhì)、工藝相關(guān)雜質(zhì)、相關(guān)物質(zhì)分析。制品相關(guān)雜質(zhì)產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)是在生產(chǎn)和/或貯存過程中產(chǎn)生的降解產(chǎn)物。其分子量、生物學(xué)活性、有效性和安全性均不同于主藥蛋白[5]。工藝相關(guān)雜質(zhì)工藝相關(guān)雜質(zhì)是生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的，可能源自工程菌/工程細(xì)胞（殘余蛋白質(zhì)、殘余DNA）、培養(yǎng)基（誘導(dǎo)劑、抗生素、培養(yǎng)基成分）或者下游工藝（試劑、層析過程產(chǎn)生的雜質(zhì)）[5]。同一制品的不同生產(chǎn)單位，由于其工藝、表達(dá)系統(tǒng)的差異，殘余宿主細(xì)胞的DNA、蛋白無論從結(jié)構(gòu)還是組成比例均會(huì)存在差異。因此，檢測(cè)方法在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的選擇、抗原、抗體的制備方式均具有特異性。根據(jù)“質(zhì)量源于設(shè)計(jì)”理念，采用生產(chǎn)單位根據(jù)工藝自行制備的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和檢測(cè)用試劑對(duì)工藝相關(guān)雜質(zhì)進(jìn)行控制，更為真實(shí)客觀，對(duì)于工程控制也更有意義。制品相關(guān)物質(zhì)制品相關(guān)物質(zhì)是在生產(chǎn)或貯存過程中，產(chǎn)生的不同于主藥蛋白的分子，其具有的生物學(xué)活性，對(duì)于制品的安全性和有效性沒有影響。它們的特性與主藥蛋白相似，不被認(rèn)為是雜質(zhì)[5]。鑒別分析在理化鑒別方面，《中國藥典》與《歐洲藥典》的差距主要是在理化對(duì)照品方面。《中國藥典》收載的生物技術(shù)類制品標(biāo)準(zhǔn)尚未提供理化對(duì)照品。以肽圖分析為例，肽圖分析是國內(nèi)外藥典用于評(píng)價(jià)產(chǎn)品一致性和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定的技術(shù)手段?！稓W洲藥典》采用全面結(jié)構(gòu)鑒定和理化分析的對(duì)照品作為鑒別判定依據(jù)，在儀器分析總體要求的基礎(chǔ)上，《歐洲藥典》對(duì)色譜柱粒徑、長(zhǎng)度、柱溫，以及系統(tǒng)適用性中保留時(shí)間、分辨率等均有詳盡的描述，并采用非線性色譜梯度分離?！吨袊幍洌?010版）》也采用了酶切后RP-HPLC的方式，但尚未提供完成全面結(jié)構(gòu)鑒定和理化分析的對(duì)照品，其次在方法要求細(xì)節(jié)與系統(tǒng)適用性方面也存在一定差距。2.3標(biāo)準(zhǔn)品的建立標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究和建立是藥品質(zhì)量控制的重要組成部分?！稓W洲藥典》收錄藥品標(biāo)準(zhǔn)的鑒別、理化特性分析、生物學(xué)活性測(cè)定中，絕大多數(shù)檢驗(yàn)方法均有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為技術(shù)依托。然而，目前我國在相關(guān)生物技術(shù)類制品的質(zhì)量控制中，僅可以提供生物學(xué)活性標(biāo)準(zhǔn)品，但在理化分析、含量測(cè)定方面的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研發(fā)還有待加強(qiáng)，在體制和機(jī)制上確保實(shí)物標(biāo)準(zhǔn)和文本標(biāo)準(zhǔn)同步發(fā)展與實(shí)施，完善標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)國家數(shù)據(jù)庫。

藥典相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)比較

僅以EPO、G-CSF原液（原料藥）的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為例，對(duì)照分析中外藥典中相關(guān)檢定項(xiàng)目的技術(shù)要求?！稓W洲藥典》收載的生物技術(shù)類制品原液按原料藥管理，有批準(zhǔn)文號(hào)。而在我國，原液是禁止在市場(chǎng)流通的。詳見表（表略）

第7篇：細(xì)胞的生物學(xué)特性范文

方法：對(duì)289例胃癌根治術(shù)患者3年和5年生存率、復(fù)發(fā)原因進(jìn)行對(duì)照分析。

結(jié)果：對(duì)高惡度胃癌擴(kuò)大手術(shù)范圍和提高預(yù)防性治療級(jí)別，可提高治療效果。

結(jié)論：

胃癌治療應(yīng)根據(jù)其生物學(xué)特性及病理學(xué)分型，采用合適的手術(shù)范圍及術(shù)前、術(shù)中化療等措施，可明顯延長(zhǎng)生存期，改善生存質(zhì)量。

關(guān)鍵詞：胃腫瘤胃癌生物學(xué)特性病理學(xué)分型化學(xué)療法生存期

【中圖分類號(hào)】R4【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B【文章編號(hào)】1008-1879（2012）12-0186-02

胃癌的腹膜種植轉(zhuǎn)移是胃癌根治術(shù)后復(fù)發(fā)的主要原因[1]，而胃癌的淋巴轉(zhuǎn)移對(duì)胃癌的預(yù)后有一定的影響。作者對(duì)289例胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和漿膜脫落細(xì)胞進(jìn)行研究，擴(kuò)大手術(shù)范圍，采用術(shù)前、術(shù)中化療，以探討胃癌生物學(xué)特性與預(yù)后的關(guān)系，為預(yù)防術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，延長(zhǎng)生存期，提高生存質(zhì)量提供理論依據(jù)。

1資料和方法

1.1一般資料。1990年―1999年我院共施行進(jìn)展期胃癌手術(shù)289例，男210例，女79例。年齡40～77歲，平均65歲。

1.2方法。胃癌手術(shù)開腹后探查前用100～150ml生理鹽水倒入腹腔上部或盆腔，輕輕攪動(dòng)后收集沖洗液，離心沉淀，吸取有核細(xì)胞層涂片4～6張，以瑞氏法和蘇木精-伊紅染色鏡下觀察有無脫落細(xì)胞，并對(duì)沖洗液的有核細(xì)胞層懸液進(jìn)行了臺(tái)盼藍(lán)染色觀察。

1.3病理學(xué)分型及分組。根據(jù)病理學(xué)分型，分為高分化腺癌組（n=135）、中分化腺癌組（n=83），低分化腺癌組（n=51）和其他病理類型組（n=20），回顧性分析術(shù)后3年和5年生存率、復(fù)發(fā)及死亡原因。

1.4術(shù)式及化療方案。根據(jù)腫瘤分期、部位、類型選擇D2、D3、D4式手術(shù)?；煼桨福盒g(shù)前選用FAM方案，術(shù)中溫生理鹽水420ml+5-Fu500mg腹腔灌注沖洗。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用行×列表X2檢驗(yàn)，P

2結(jié)果

2.13種分化胃腺癌患者不同術(shù)式及化療方案5年生存率的比較組內(nèi)與D2清除及D3、D4清除比較：P

2.2其他病理類型組生存情況其他3種類型胃癌病例較少，其中印戒細(xì)胞癌9例，黏液細(xì)胞癌7例，其他類型癌4例（包括未分化癌、不能分類的癌等）。這20例患者亦采用了以上幾種手術(shù)方式，經(jīng)統(tǒng)計(jì)，無論采用何種術(shù)式及術(shù)前、術(shù)中是否化療，生存期均未超過1年。

2.3胃癌死亡原因本組死亡病例共84例，其中腹腔廣泛種植轉(zhuǎn)移52例，肝轉(zhuǎn)移22例，其他原因10例。

3討論

胃癌的發(fā)病率及死亡率始終居消化系統(tǒng)惡性腫瘤之前列。當(dāng)今胃癌的淋巴結(jié)清除范圍，應(yīng)根據(jù)患者的胃癌病期和癌腫的生物學(xué)特性加以區(qū)別對(duì)待。在此原則下，應(yīng)充分考慮到患者的諸多個(gè)體特點(diǎn)，優(yōu)選出合理的手術(shù)方案。對(duì)胃癌應(yīng)根據(jù)不同病理類型和不同的病期選擇合理的治療方案，術(shù)前對(duì)于病理類型的判斷尤為重要。很多研究表明新輔助化療可以提高進(jìn)展期胃癌的手術(shù)切除率及改善預(yù)后，因而廣受重視。本組結(jié)果顯示，早期及高分化癌的手術(shù)根治率較高，行新輔助化療的意義不大，中晚期及高惡度胃癌則明顯可以看出其作用，故術(shù)前對(duì)患者進(jìn)行腫瘤分期和明確病理類型極為重要。

許多文獻(xiàn)表明新輔助化療可以提高進(jìn)展期胃癌的手術(shù)切除率及預(yù)后，因而廣受重視。早、中期胃癌手術(shù)切除治療率高，行新輔助化療的意義不大。腫瘤腹腔廣泛播散或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者預(yù)后太差，也不應(yīng)納入其范疇內(nèi)。所以準(zhǔn)確的術(shù)前術(shù)中分期對(duì)病例的術(shù)式選擇至關(guān)重要[2]。從本組可以看出，腫瘤細(xì)胞分化程度越低，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移越多，腹膜種植轉(zhuǎn)移概率越高，說明其浸潤廣泛，對(duì)術(shù)后5年生存率有明顯的影響。胃癌新輔助化療有幾個(gè)優(yōu)勢(shì)：①可以殺滅術(shù)區(qū)以外的亞臨床轉(zhuǎn)移灶，預(yù)防醫(yī)源性腫瘤播散。②殺滅癌細(xì)胞，降低臨床分期，增加手術(shù)切除率或根治性切除的機(jī)會(huì)。③獲得腫瘤的個(gè)體藥敏資料，為術(shù)后選擇輔助化療提供依據(jù)。④腫瘤對(duì)化療的效果是判斷患者預(yù)后的指標(biāo)之一。

腹膜種植轉(zhuǎn)移是胃癌患者術(shù)后最常見的復(fù)發(fā)形式，由于其早期診斷有一定困難，目前腹膜種植轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)患者尚無有效的治療方法。從死因可以看出，患者術(shù)后復(fù)發(fā)主要為腹膜種植轉(zhuǎn)移，術(shù)中預(yù)防醫(yī)源性癌細(xì)胞脫落尤為重要。術(shù)中應(yīng)注意無瘤操作技術(shù)，不用紗布擦拭手術(shù)野外的臟器，盡量減少暴露、擦拭、損傷腹膜，以免增加癌細(xì)胞的黏附因素；盡量防止血液流入腹腔，去除白細(xì)胞、血小板高黏附癌細(xì)胞的因素；同時(shí)腹腔灌注化療必不可少，優(yōu)點(diǎn)是腹腔內(nèi)藥物濃度高，可有效殺滅脫落的癌細(xì)胞。術(shù)前或術(shù)中證實(shí)有腹膜轉(zhuǎn)移患者，除術(shù)中化療以外，應(yīng)于術(shù)后輔以腹腔灌注化療及全身化療，可望減少術(shù)后腹膜種植復(fù)發(fā)率。

手術(shù)范圍的選擇也極為重要。一些學(xué)者認(rèn)為擴(kuò)大胃周圍淋巴結(jié)清除能夠提高患者術(shù)后5年生存率，并且淋巴結(jié)清除及病理學(xué)檢測(cè)對(duì)術(shù)后的正確分期判斷預(yù)后、指導(dǎo)術(shù)后監(jiān)測(cè)和選擇術(shù)后治療方案都有重要的價(jià)值。D3術(shù)式在高分化癌中，并不比D2能提高生存率，反而增加了手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)，而對(duì)于低度分化癌中，D3術(shù)式則是明顯提高了5年的生存率，故根據(jù)病理切片類型選擇術(shù)式，對(duì)于胃癌的預(yù)后也有明顯的影響。從本組結(jié)果可以看出：高中分化腺癌行D2術(shù)式已能完成患者的治療，而D3術(shù)式并不比D2術(shù)式生存率高，術(shù)前化療及術(shù)中的腹腔化療并不能提高生存率，反而增加了患者的創(chuàng)傷?？傊谖赴┲委熯^程中，應(yīng)重視其生物學(xué)特性對(duì)預(yù)后的影響，結(jié)合病理診斷及其分期，采取不同的術(shù)式，術(shù)前術(shù)中采用不同的預(yù)防措施，可明顯延長(zhǎng)患者的生存期及改善生存質(zhì)量。胃癌的治療選擇及預(yù)后取決于多種因素，本文僅從病理類型方面作了初步探討，其他因素的影響還有待深入研究。

參考文獻(xiàn)

第8篇：細(xì)胞的生物學(xué)特性范文

【Abstract】 AIM: To evaluate the biological safety of polypyrrole film electropolymerized on Tisubstrates for possible use as dental implant. METHODS: The biological safety was evaluated through the experiments including hemolysis test， shortterm systemic toxicity test， oral mucous membrane irritation test and cytotoxicity test (MTT test). RESULTS: The material had no hemolytic activities. The shortterm systemic toxicity test results showed that no histopathological changes were found in the vital organs such as heart， kidney and liver of tested animals. No local response was observed in the oral mucosa membrane irritation test. MTT revealed that L929 cells grew well in the extract and the grade of cytotoxicity was zero. CONCLUSION: The Tisubstrates coated with polypyrrole film have good biological safety.

【Keywords】 dental implants; polypyrrole; biological safety; biocompatible materials

【摘要】 目的： 評(píng)價(jià)純鈦表面聚吡咯涂層的生物安全性，為口腔種植體表面改性提供依據(jù). 方法： 分別通過溶血試驗(yàn)、口腔黏膜刺激試驗(yàn)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)（MTT法）和急性全身毒性試驗(yàn)，初步評(píng)價(jià)純鈦表面聚吡咯涂層的生物安全性. 結(jié)果： 純鈦表面聚吡咯涂層材料無溶血現(xiàn)象，不影響凝血功能；短期全身毒性實(shí)驗(yàn)的受試小鼠心、腎、肝的組織切片均未見病理變化；口腔黏膜刺激實(shí)驗(yàn)未見異常組織學(xué)反應(yīng)；MTT試驗(yàn)顯示L929細(xì)胞在涂層浸提液中生長(zhǎng)良好，細(xì)胞毒性為0級(jí). 結(jié)論： 純鈦表面聚吡咯涂層材料具有良好的生物安全性.

【關(guān)鍵詞】 牙種植體，聚吡咯，生物安全性，生物相容性材料

口腔種植修復(fù)是目前最具前景的義齒修復(fù)手段，如何在種植創(chuàng)愈合初期，促進(jìn)成骨細(xì)胞在種植體表面早期地附著生長(zhǎng)，完善地表達(dá)其成骨功能是提高種植體與骨組織結(jié)合效率的關(guān)鍵. 在純鈦種植體表面固定生物活性大分子能夠提高材料的生物相容性，使純鈦種植體既有骨傳導(dǎo)作用，又具備骨誘導(dǎo)活性. 然而作為金屬材料，純鈦表面不可能同高分子材料一樣具有豐富的反應(yīng)性功能基團(tuán)來連接側(cè)鏈、配基或生物活性分子，這成為了制約純鈦種植體表面生物有機(jī)修飾的瓶頸［1］. 聚吡咯(Polypyrrole， PPy)，是一種能夠表現(xiàn)出半導(dǎo)體和導(dǎo)體的許多光、電、磁特性的導(dǎo)電高分子聚合物，能夠在金屬表面形成良好的結(jié)合［2-3］. 因此，在純鈦表面制備PPy涂層，有望增加其表面的有機(jī)修飾活性位點(diǎn)，提高口腔種植手術(shù)成功率. 我們利用對(duì)純鈦進(jìn)行表面涂層改性，初步探索其生物安全性，為這一新型材料的后續(xù)應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ).

1材料和方法

1.1材料6 mo齡新西蘭大耳白兔1只，雄性，體質(zhì)量1.5 kg (第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，昆明成年小白鼠16只，體質(zhì)量18～22 g（第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），60～70 d金黃色地鼠10只，體質(zhì)量140～160 g (西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)，小鼠結(jié)締組織成纖維細(xì)胞L929 細(xì)胞株（第四軍醫(yī)大學(xué)口腔生物實(shí)驗(yàn)室），鈦材TA2(Ti 西北有色金屬研究院)，對(duì)甲苯磺酸鈉(ToSNa，西安化學(xué)試劑廠)，Pyrrole(Py，美國Sigma公司)， 217型KCl飽和甘汞電極(上?；瘜W(xué)試劑廠)，ZF5型恒電位儀(上海正方電子電器有限公司)，JSM840型掃描電鏡(日本Jeol公司)，BX41型光學(xué)顯微鏡(日本 Olympus公司)，MPSUV260型紫外分光光度儀(日本 島津公司)，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（美國BioTek公司），DMEM培養(yǎng)液（美國Gibco BRL公司），胎牛血清（浙江金華清湖犢牛利用研究所），胰蛋白酶（上海浦東生化試劑廠），MTT（美國Sigma公司）.1.2方法

1.2.1純Ti表面PPy涂層制備與表面形貌觀察將TA2加工成直徑18 mm，厚1 mm的圓型試件，金相砂紙從280#逐級(jí)打磨至800#. 激光焊接機(jī)將直徑0.3 mm Ti絲焊接于圓型試件側(cè)面，作為工作電極引線. 采用ZF5型恒電位儀在Ti試件表面恒電流電化學(xué)聚合PPy，聚合電流密度控制為1 mA/cm2. 電解液為0.1 mol/L對(duì)甲苯磺酸鈉、0.1 mol/L Pyrrole水溶液，pH值為4.0左右. Ti試件為工作電極，鉑片為對(duì)電極，217型KCl飽和甘汞電極為參比電極. 涂層厚度由聚合過程中通過的電量來計(jì)算. 每通過100 mC/cm2單位面積的電量大約生成0.28 μm厚度的PPy涂層［4］. PPy涂層厚度均控制為100 μm. 采用JSM840型掃描電鏡進(jìn)行表面形貌觀察.

1.2.2溶血試驗(yàn)將10個(gè)Ti表面PPy涂層試件無菌試管完全浸沒于20 mL DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃培養(yǎng)箱中72 h，獲得浸提液. 心臟穿刺抽取新西蘭大耳白兔血10 mL，立即加入20 g/L的草酸鉀0.5 mL，抗凝，取8 mL兔血加入10 mL生理鹽水中稀釋備用. 實(shí)驗(yàn)分為3組，每組平行3份試樣. 陰性對(duì)照組： 0.2 mL稀釋兔血加入10 mL生理鹽水；陽性對(duì)照組：0.2 mL稀釋兔血加入10 mL三蒸水；涂層實(shí)驗(yàn)組： 0.2 mL稀釋兔血加入10 mL浸提液. 37℃水浴60 min，離心，取上清. 在MPSUV260型紫外分光光度儀上測(cè)A540 nm值. 溶血率計(jì)算公式為：溶血率（%）=（實(shí)驗(yàn)組A540 nm-陰性對(duì)照組A540 nm）/（陽性對(duì)照組A540 nm-陰性對(duì)照A540 nm）×100%. 溶血率大于5%則預(yù)示陽性結(jié)果.

1.2.3急性全身毒性試驗(yàn)將PPy涂層用鋒利刀片從Ti表面刮下，研磨粉碎后高溫高壓消毒，無菌條件下配制成100 g/L生理鹽水混懸液，使用前37℃下保持1 h. 選用昆明小鼠隨機(jī)分配為Ti表面PPy涂層實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組，每組各8只. 實(shí)驗(yàn)組采用胃內(nèi)針給藥，1 g/kg. 對(duì)照組給以等量的生理鹽水. 連續(xù)給藥7 d，停藥后繼續(xù)觀察7 d. 每日檢查動(dòng)物的臨床中毒體征，并予以記錄. 停藥7 d后，采用頸椎脫臼法將動(dòng)物處死. 取動(dòng)物心、肝和腎，多聚甲醛固定，常規(guī)HE染色后BX41型光學(xué)顯微鏡下觀察.

1.2.4口腔黏膜刺激試驗(yàn)將金黃色地鼠腹腔注射10 g/L的戊巴比妥鈉麻醉動(dòng)物，消毒，鋪巾. 用醫(yī)用縫合線將試樣穿頰黏膜縫合固定到頰囊黏膜上，每只固定經(jīng)消毒備用的2個(gè)試樣，左側(cè)為實(shí)驗(yàn)組Ti表面PPy涂層試件，右側(cè)為作為陰性對(duì)照的Ti試件. 術(shù)后每日觀察黏膜組織反應(yīng)及試樣在位情況，即試片周圍有無充血、糜爛、腫脹等. 術(shù)后14 d處死動(dòng)物，取與材料接觸的頰囊部全層組織，HE染色，BX41型光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察.

1.2.5細(xì)胞毒性試驗(yàn)按照CB/T16886.52003 《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)》體外細(xì)胞學(xué)毒性試驗(yàn)的試驗(yàn)方法進(jìn)行［5］. 選擇L929細(xì)胞為受試細(xì)胞株，實(shí)驗(yàn)前用PBS新鮮配制MTT溶液，微孔濾器過濾除菌，4℃保存. 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞系，常規(guī)胰酶消化后制備成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106 L，接種細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板（100 μL/孔，n=5），置于5 mL/L CO2， 37℃培養(yǎng)箱中，在飽和濕度條件下培養(yǎng)48 h. 然后將浸提液加入各實(shí)驗(yàn)組（150 μL/孔）. 陰性對(duì)照為DMEM培養(yǎng)基，陽性對(duì)照為1 mL/L苯酚，常規(guī)培養(yǎng). 培養(yǎng)12， 24， 48 h后酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定A570 nm值，并計(jì)算出各組的A570 nm均值及細(xì)胞增殖百分率（P%）. P%=各濃度組A570 nm均值/陰性對(duì)照組A570 nm均值×100%. 按照CB/T16886.52003標(biāo)準(zhǔn)，P%可分為6級(jí)： >100%為0級(jí)；75%～100%為Ⅰ級(jí)；50%～74%為Ⅱ級(jí)；30%～49%為Ⅲ級(jí)；15%～29%為Ⅳ級(jí)；0～14%為Ⅴ級(jí). 只有細(xì)胞毒性為I級(jí)或0級(jí)的生物材料才能用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn).

2結(jié)果

2.1Ti表面PPy涂層掃描電鏡觀察高倍鏡下可見PPy涂層呈現(xiàn)典型的菜花樣、結(jié)節(jié)樣顆粒. 顆粒大小為0.5～1.5 μm左右，顆粒間的孔徑大多約在1～2 μm之間（圖1）.

圖1Ti表面聚吡咯涂層形貌SEM ×2000

2.2溶血試驗(yàn)各測(cè)試組光吸收度測(cè)定值見表1，以每組測(cè)定值的平均數(shù)計(jì)算溶血程度，溶血程度為1.49%，小于5%，即Ti表面PPy涂層無溶血反應(yīng).

2.3短期全身毒性試驗(yàn)所有小鼠在胃內(nèi)灌入混懸液后2 wk內(nèi)一般情況良好，活動(dòng)、進(jìn)食情況正常，體質(zhì)量無下降，無步態(tài)不穩(wěn)、驚厥、癱瘓、呼吸困難等不良反應(yīng)，無死亡. 各組小鼠心、腎、肝的組織切片均未見細(xì)胞變性、壞死等病理變化，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組無差異.表1各實(shí)驗(yàn)組光吸收度測(cè)定值 2.4口腔黏膜刺激試驗(yàn)各組金黃色地鼠進(jìn)食、飲水正常，毛發(fā)光澤，反應(yīng)靈活. 肉眼觀察，材料接觸處口腔黏膜表面未見明顯充血、腫脹、糜爛或潰瘍. 組織切片觀察，Ti陰性對(duì)照組，頰黏膜的黏膜上皮排列整齊，細(xì)胞形態(tài)正常，較少量炎性細(xì)胞浸潤，黏膜下結(jié)締組織中有少量血管擴(kuò)張和充血. Ti表面PPy涂層實(shí)驗(yàn)組頰黏膜各層細(xì)胞排列整齊，較少量炎性細(xì)胞浸潤，黏膜下結(jié)締組織中有少量血管擴(kuò)張和充血（圖2）. 實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組的組織學(xué)觀察結(jié)果相似，均未見明顯異常反應(yīng).圖2Ti表面聚吡咯涂層植入頰黏膜后組織反應(yīng)×100

2.5細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果各組A570 nm值，細(xì)胞增殖率及細(xì)胞毒性分級(jí)見表2. 倒置相差顯微鏡觀察陽性對(duì)照組，正常細(xì)胞形態(tài)消失，核固縮或溶解，而實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞形態(tài)良好，細(xì)胞折光性強(qiáng)，與陰性對(duì)照組相似，并可見多個(gè)分裂相細(xì)胞，表明細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛. 細(xì)胞毒性測(cè)試為0級(jí)，說明Ti表面PPy涂層對(duì)L929細(xì)胞無抑制作用.表2各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖率及細(xì)胞毒性分級(jí)

3討論

純鈦種植體在體內(nèi)，直接也是最先與組織、細(xì)胞相接觸的是材料的表面. 材料的表面性質(zhì)影響細(xì)胞的吸附、增殖、分化等一系列反應(yīng). 學(xué)者們一直致力于將一些有生理功能的物質(zhì)如蛋白質(zhì)、多肽、酶和細(xì)胞生長(zhǎng)因子等固定在純鈦種植體表面，充當(dāng)鄰近細(xì)胞、基質(zhì)或可溶性因子的配基或受體. 這種在種植材料表面引入具有誘導(dǎo)骨組織再生的活性因子、細(xì)胞或活體組織的方法稱為生物材料表面有機(jī)修飾. 它能夠極大地改善材料的生物學(xué)性能，是實(shí)現(xiàn)材料良好生物誘導(dǎo)活性的根本途徑［5-6］. 然而，金屬材料表面與高分子材料完全不同的性質(zhì)決定了其幾乎不存在任何反應(yīng)性功能基因來連接側(cè)鏈、配基或生物活性分子，這是鈦基金屬表面生物有機(jī)修飾的技術(shù)難點(diǎn).

長(zhǎng)期以來，高分子一直被視為結(jié)構(gòu)材料和絕緣材料. 1971年日本化學(xué)家白川英樹在用齊格勒―納塔催化劑合成聚乙炔時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)聚乙炔與I2，AsF5等反應(yīng)之后，電導(dǎo)率達(dá)到1×102～1×103 S/cm. 傳統(tǒng)意義上的絕緣體竟然表現(xiàn)出半導(dǎo)體和導(dǎo)體的許多光、電、磁特性，這對(duì)經(jīng)典的材料分類法和導(dǎo)電理論是巨大的挑戰(zhàn)和突破，也意味著新的一代功能高分子的誕生. 鑒于這類聚合物表現(xiàn)出的傳統(tǒng)高分子材料所不具備的導(dǎo)體、半導(dǎo)體、鐵磁體、發(fā)光體等的特性，這類功能高分子被稱為導(dǎo)電聚合物（conducting polymers）或合成金屬（synthetic metals）. PPy就是其中發(fā)現(xiàn)較早并經(jīng)過系統(tǒng)研究的導(dǎo)電聚合物之一［7］. 因此，我們?cè)噲D通過PPy的導(dǎo)體特性同鈦金屬基底形成良好的結(jié)合，同時(shí)又利用高分子材料表面反應(yīng)性功能基因豐富的特性來進(jìn)行生物材料表面有機(jī)修飾，從而增強(qiáng)鈦種植體的生物活性.

對(duì)生物材料安全性的評(píng)價(jià)方法較多，國際標(biāo)準(zhǔn)化組織公布的醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)指南(ISO標(biāo)準(zhǔn)，1997)中基本評(píng)價(jià)的生物學(xué)試驗(yàn)包括細(xì)胞毒性、致敏、刺激或皮內(nèi)反應(yīng)、全身急性毒性、亞慢性亞急性毒性、遺傳毒性、植入、血液相容性等［8-9］. 我們選擇了溶血實(shí)驗(yàn)、短期全身毒性實(shí)驗(yàn)、口腔黏膜刺激實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞毒性試驗(yàn)4種較為常見的生物學(xué)試驗(yàn)方法. 其中細(xì)胞毒性檢測(cè)采用MTT試驗(yàn)法，原理為MTT可被線粒體上的脫氫酶還原成藍(lán)紫色結(jié)晶，經(jīng)有機(jī)溶劑二甲基亞砜等溶解后可使用分光光度計(jì)測(cè)定MTT結(jié)晶物的染色濃度，從而評(píng)價(jià)細(xì)胞的增殖率和死亡率，操作簡(jiǎn)便、快速，能夠靈敏反映細(xì)胞受損害的程度. 我們的結(jié)果表明純鈦表面聚吡咯涂層材料不引起溶血反應(yīng)，不干擾細(xì)胞功能，對(duì)口腔黏膜顯示無刺激性，無短期毒性作用，具有可靠的生物安全性，是一種具有良好生物相容性的材料，具有進(jìn)一步應(yīng)用于鈦種植體材料表面改性研究的廣闊前景.

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第9篇：細(xì)胞的生物學(xué)特性范文

[關(guān)鍵詞]外泌體;分離;鑒定;差速離心法

中圖分類號(hào)：TU755 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1009-914X（2016）24-0193-01

近年來，越來越多的證據(jù)表明外泌體對(duì)于細(xì)胞生物學(xué)以及醫(yī)學(xué)研究方面具有重要的價(jià)值，而由于外泌體的體積結(jié)構(gòu)方面的因素，其分離純化還存在很大的困難，目前比較常用的分離方法有差速離心法、密度梯度離心法、超濾離心法、免疫磁珠法、多聚物沉降法等。

1.差速離心法

陳紹倩[1]等人以白血病細(xì)胞系K562細(xì)胞為材料，采用多步離心的方法成功地提取到了的外泌體。此種實(shí)驗(yàn)方法操作不是很復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求相對(duì)簡(jiǎn)單，擁有超速離心機(jī)和細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備即可，是一種比較簡(jiǎn)便的提取外泌體的方法，基本可以滿足實(shí)驗(yàn)研究的要求。但分離純度不是很高，并且經(jīng)過多次離心對(duì)外泌體的理化性質(zhì)造成一定的影響。

2.密度梯度離心法

像所有的脂質(zhì)小囊泡一樣， 外泌體懸浮于特定密度梯度的蔗糖中，其密度范圍從 1.13g/ml到1.210g/ml，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于蔗糖介質(zhì)的頂部，通過重力或離心力場(chǎng)的作用使細(xì)胞分層、分離，從而將外泌體從混雜的物質(zhì)如蛋白聚集物或細(xì)胞凋亡的核小體碎片等中分離出來[2]。崔焱[3]等人根據(jù)其這一特性，從大量培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞上清中分離純化外泌體，并對(duì)此進(jìn)行了電鏡鑒定;在得到大量較高純度的外泌體的基礎(chǔ)上，將其加入含有白細(xì)胞介素-2（1L-2）的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體系中，觀察其對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的影響。

3.超濾離心法

王偉[4]等人以樹突狀細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料，基于對(duì)外泌體物理特性，大小以及密度的了解，將超濾離心分離外泌體的方法與傳統(tǒng)的分級(jí)離心法進(jìn)行了比較，通過實(shí)驗(yàn)證明超濾離心法耗時(shí)少，產(chǎn)量和純度都得到了很大程度的提高，是一種比較高效的制備外泌體的方法。

4.免疫磁珠法

將具有磁性的磁珠表面包被特殊的抗體，細(xì)胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性抗體結(jié)合，在外加磁場(chǎng)中，通過抗體與磁珠相連的細(xì)胞被吸附而滯留在磁場(chǎng)中，無該種表面抗原的細(xì)胞由于不能與磁珠結(jié)合而不能在磁場(chǎng)中停留，從而使細(xì)胞得以分離。Richard Wubbolts[5]等人在對(duì)外泌體進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)和生化分析的過程中，將外泌體的標(biāo)志性蛋白―抗MHCII抗體包被于磁珠表面，通過抗原抗體特異性識(shí)別的特性有效的將外泌體分離出來。

無論采用哪種方法進(jìn)行分離，如果想對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)的研究都必須首先確定分離得到的產(chǎn)物是不是外泌體，其次要鑒定外泌體是否達(dá)到實(shí)驗(yàn)所要求的純度和數(shù)量。因此，外泌體的鑒定是必不可少的。目前，常用的鑒定方法主要有電子顯微鏡觀察、動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)、Western blot、納米顆粒跟蹤分析技術(shù)等。

其中電子顯微鏡觀察法是從形態(tài)和大小上對(duì)外泌體進(jìn)行鑒定，但由于電鏡拍攝視野有限，因此這種方法只能對(duì)個(gè)別外泌體進(jìn)行觀察。而動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)則是從整體上對(duì)外泌體大小的分布情況進(jìn)行檢測(cè)，具有準(zhǔn)確、快速、可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，但對(duì)于多分散的復(fù)雜外泌體樣本的測(cè)量還存在一定的問題。Western blot則是通過抗原抗體特異性結(jié)合的原理，對(duì)外泌體中的標(biāo)志蛋白進(jìn)行檢測(cè)，從蛋白質(zhì)組學(xué)方面對(duì)外泌體進(jìn)行鑒定。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，納米顆粒跟蹤分析技術(shù)逐漸成為外泌體鑒定的新技術(shù)，不但可以實(shí)時(shí)對(duì)外泌體進(jìn)行觀測(cè)，同時(shí)還可以對(duì)每個(gè)顆粒的布朗運(yùn)動(dòng)進(jìn)行追蹤和分析，從而計(jì)算出外泌體半徑和濃度。

外泌體作為細(xì)胞間物質(zhì)信息的傳遞者，在細(xì)胞生物學(xué)以及分子生物學(xué)領(lǐng)域中，扮演著越來越重要的角色。因此，提高外泌體的分離純度，改進(jìn)外泌體的分離方法尤為重要。目前，雖然外泌體的分離與鑒定已經(jīng)擁有系統(tǒng)的理論基礎(chǔ)，但實(shí)際操作起來依然存在很多困難，無論是哪種方法，都有各自的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，因此只有將各個(gè)方法有效的結(jié)合起來，例如差速離心法與免疫磁珠法、電鏡法與Western blot結(jié)合使用，才能達(dá)到更好的分離鑒定效果。

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