細胞凋亡精選(九篇)

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第1篇：細胞凋亡范文

細胞凋亡是普遍存在于多細胞生物體內(nèi)的一種自發(fā)、主動的細胞死亡過程，是生物體維持細胞數(shù)量相對穩(wěn)定的固有機制。這一機制若有障礙或發(fā)生異常，就有可能引發(fā)腫瘤或其他病變。而腫瘤是一種細胞凋亡過少而增殖過多的疾病，若能抑制腫瘤細胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，腫瘤細胞就有可能停止生長，因而中藥誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡已成為一條很有希望的治療腫瘤的新途徑。目前常用的誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的中藥有：

1.中藥單方制劑

全蝎水浸液提取物可誘導(dǎo)HL――60細胞凋亡，凋亡比例隨藥物濃度增高而上升，土貝母對體外培養(yǎng)的人腎顆粒細胞癌細胞RLC―310的生長具有明顯抑制作用，并能誘導(dǎo)癌細胞凋亡。

2.中藥復(fù)方制劑

國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界先后報道十全大補湯、六君子湯、人參養(yǎng)榮湯、小柴胡湯、當(dāng)歸補血湯等具有誘導(dǎo)不同腫瘤細胞凋亡的作用，并認為誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡是其抗癌機制之

日本學(xué)者對小柴胡湯的研究最為細致。他們用小柴胡湯的幾種水溶性成分柴胡皂甙、人參皂甙、甘草甜素、黃芩皂甙和小柴胡湯的水溶性全部成分；分別處理體外培養(yǎng)的肝癌細胞株、膽管癌細胞株、正常大鼠肝細胞和正常人外周淋巴細胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各藥效成分單獨使用對兩種癌細胞株的凋亡誘導(dǎo)率很低，而小柴胡湯全成分作用最為明顯，且有濃度依賴性，所有試驗藥對所培養(yǎng)的兩種正常細胞都沒有影響。該實驗表明中藥復(fù)方在誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡方面較中藥提取成分更有效。

3.中藥有效提取成分

第2篇：細胞凋亡范文

    1 ROS和凋亡細胞的線粒體功能變化的關(guān)系

    細胞游離系統(tǒng)(cell-freesystem)為認識細胞凋亡機制提供了良好的模型。該系統(tǒng)通過分離細胞核和細胞漿,制備去核細胞(cytoplast)和無漿細胞,可以獨立分析細胞漿和細胞核在細胞凋亡中的作用。以此為基礎(chǔ)的兩大發(fā)現(xiàn)強力地揭示線粒體在細胞凋亡中的重要性:①細胞自發(fā)的受Bcl-2抑制的核固縮和DNA裂解依賴線粒體的存在;②caspase的活化依賴細胞色素C自線粒體釋放。隨后的研究顯示各種因素誘導(dǎo)的細胞凋亡均出現(xiàn)線粒體功能紊亂,尤其是線粒體跨膜電位(ψm)的破壞。業(yè)已清楚,造成ψm下降的主要原因是線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運孔(MPT)的開放。MPT位于線粒體內(nèi)、外膜之間,由一組蛋白復(fù)合體構(gòu)成。許多因素可影響MPT的開關(guān)。其中,定位于線粒體內(nèi)膜的腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)位蛋白(ANT)發(fā)揮重要作用。ANT分子的構(gòu)象改變,尤其是其相鄰巰基的氧化還原狀態(tài)明顯影響MPT的開關(guān)。當(dāng)相鄰巰基氧化為二硫鍵或類似于二硫鍵的交聯(lián)復(fù)合物時,MPT開放。反之,MPT關(guān)閉〔1〕。因此,MPT的開放及ψm的破壞與細胞的氧化還原狀態(tài),如巰基氧化、細胞GSH缺少和ROS的堆積密切相關(guān)。Macho等〔2〕在研究胸腺細胞凋亡機制中發(fā)現(xiàn),早期凋亡細胞胞內(nèi)GSH下降和ROS含量輕度升高。后者進一步引起NADH和NADPH下降,產(chǎn)生大量超氧陰離子自由基。因此,在凋亡過程中,ROS既是促發(fā)和加速MPT開放重要效應(yīng)分子,又是MPT開放的產(chǎn)物。這種正反饋機制使MPT開放具有自我放大效應(yīng)和“全”或“無”的特點,使線粒體ψm的下降進入不可逆過程,細胞發(fā)生凋亡。

    2 ROS和凋亡信號傳導(dǎo)分子Ca2+的關(guān)系

    自從Kaiser等發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的胸腺細胞凋亡與Ca2+離子內(nèi)流增加有關(guān)以來,越來越多的直接或間接證據(jù)表明胞漿Ca2+濃度上升是細胞凋亡的一個重要事件。Ca2+作為第二信使或死亡信號傳導(dǎo)分子,通過參與某些和細胞凋亡相關(guān)的蛋白激酶和核酸酶的活化介導(dǎo)細胞凋亡。實際上,在細胞凋亡過程中胞內(nèi)Ca2+濃度上升和ROS的產(chǎn)生、堆積之間也存在密切聯(lián)系,而且后者往往先于胞內(nèi)Ca2+濃度的上升。例如,Tan等〔3〕發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細胞系HT22凋亡過程中,ROS的大量產(chǎn)生先于胞內(nèi)Ca2+濃度的持續(xù)上升。進一步地,ROS的產(chǎn)生被FCCP(一種能夠抑制線粒體呼吸鏈產(chǎn)生ROS的芳香族化合物)阻斷后,胞內(nèi)Ca2+水平升高不明顯。反之,當(dāng)Ca2+的內(nèi)流被鈷阻斷時,胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生和堆積也受到抑制。因此,他們認為在凋亡早期貯存于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或線粒體的Ca2+釋放引起胞內(nèi)Ca2+水平輕度升高,并協(xié)同其它因素(如GSH的下降等)引發(fā)線粒體大量產(chǎn)生ROS,而ROS進一步促進胞內(nèi)Ca2+濃度持續(xù)升高。David〔4〕等發(fā)現(xiàn)抗氧化劑和MPT抑制劑能夠抑制糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的胸腺細胞內(nèi)Ca2+水平的升高,進而抑制凋亡。他們認為凋亡中產(chǎn)生的ROS可能引起細胞內(nèi)貯存Ca2+的細胞器如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體膜和胞膜的破壞,導(dǎo)致胞內(nèi)Ca2+重分布和胞外Ca2+的內(nèi)流,從而引起細胞內(nèi)持續(xù)的Ca2+水平升高?？傊?ROS的產(chǎn)生堆積和Ca2+水平的升高都是細胞凋亡中的重要事件,且兩者相互促進,在細胞凋亡中發(fā)揮重要作用。

第3篇：細胞凋亡范文

【論文摘要】細胞凋亡是通過正常的方式在多細胞生物中消除不需要的、衰老的和受損的細胞，使機體細胞有絲分裂的速度與凋亡的速度相平衡。認識肝病發(fā)生、發(fā)展中細胞的異常凋亡有重要作用。

細胞凋亡是一個主動過程，是機體在生理或病理條件下受到刺激后，導(dǎo)致細胞產(chǎn)生一系列形態(tài)和生化方面的改變而引起的程序性細胞死亡（programmed cell death，PCD）。

一、細胞凋亡機制與檢測方法

1.凋亡機制

細胞凋亡的生化特點包括質(zhì)膜磷脂排列方向改變、細胞內(nèi)離子環(huán)境自穩(wěn)改變、蛋白酶和核酸內(nèi)切酶激活分別致細胞蛋白質(zhì)裂解和DNA斷裂、細胞內(nèi)產(chǎn)生神經(jīng)酰胺、線粒體功能障礙、谷胱甘肽耗竭以及轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶激活。參與引發(fā)細胞凋亡的蛋白酶有多種，包括半胱氨酰天門冬氨酸特異蛋白酶家族成員和組織蛋白酶等。特別是caspase家族成員與細胞凋亡關(guān)系最為密切，至少有14種哺乳動物caspase已獲克隆，但僅對caspase-3和caspase-8的功能有所了解。caspase-8在細胞凋亡中發(fā)揮啟動作用；caspase-3在細胞凋亡中發(fā)揮效應(yīng)作用。由于各caspase可相互激活，所以caspase蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)是導(dǎo)致細胞凋亡結(jié)構(gòu)改變的主要環(huán)節(jié)。線粒體功能障礙在細胞凋亡發(fā)生機制中起關(guān)鍵作用，能促進線粒體功能障礙的因素很多，包括各種有害刺激和信號傳遞過程，其中某些配體/受體相互作用最為重要。配體與靶細胞表面受體相結(jié)合，就導(dǎo)致復(fù)雜的多蛋白復(fù)合物形成，即將凋亡信號傳遞給效應(yīng)蛋白酶FLICE，F(xiàn)LICE與caspase-8相互反應(yīng)可激活caspase-8，caspase-8激活后就通過某些不明的機制引發(fā)線粒體功能障礙。線粒體功能障礙導(dǎo)致細胞色素C釋放，細胞色素C與凋亡激活因子-2相結(jié)合，使caspase-3激活。caspase-3又激活DNA斷裂因子，導(dǎo)致靜息狀態(tài)的核酸內(nèi)切酶激活，最終引起DNA斷裂。從線粒體功能障礙到DNA斷裂，是細胞凋亡生化途徑的共同途徑。在肝細胞凋亡發(fā)生機制中，以Fas配體/Fas受體引發(fā)凋亡信號級聯(lián)反應(yīng)研究得最多。此外，轉(zhuǎn)化生長因子β1及其受體、腫瘤壞死因子及其受體在肝細胞凋亡發(fā)生機制中均起重要作用。細胞凋亡的主要調(diào)節(jié)因子是B細胞淋巴瘤/白血病-2蛋白家族的成員。Bcl-2，通過抑制凋亡以延長細胞存活時間，是哺乳類動物細胞凋亡的一種強大抑制因子。與Bcl-2關(guān)系密切的同源物是Bcl-x，有兩個RNA拼接變種，長Bcl-X是較大的拼接變種，短Bcl-X是短拼接變種。

2.檢查方法

（1）對細胞凋亡形態(tài)學(xué)的觀察有HE染色光鏡觀察以及電子顯微鏡、相差顯微鏡、共聚焦激光掃描顯微鏡檢查。

（2）對DNA降解片段的分析有瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA以及Southern Blotting方法。

（3）熒光標(biāo)記膜蛋白V的檢測。

（4）流式細胞技術(shù)（FCM）可以對活體或已固定的凋亡細胞進行定量分析。（5）末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧尿苷三磷酸缺口末端標(biāo)記術(shù)（TUNEL）。（6）免疫組化。

二、肝中的細胞凋亡

近年來研究表明：肝細胞的死亡方式包括壞死和凋亡兩種。凋亡在肝臟疾病發(fā)展過程中的重要作用得到了人們的重視，現(xiàn)將有代表性的幾種肝臟疾病中的凋亡現(xiàn)象分述如下。

1.病毒性肝炎。Fas系統(tǒng)介導(dǎo)的細胞凋亡在肝炎發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，在不同條件下，穿孔素、顆粒酶、TNF-α、TGF-β等也參與了肝細胞的凋亡。1998年Galle等報道乙型肝炎時肝細胞Fas表達增強，致敏的細胞毒性T細胞（CTL）表達Fas配基（FasL），CTL經(jīng)過免疫途徑介導(dǎo)肝細胞凋亡，參與病毒的清理和肝炎的病理生理過程。若該反應(yīng)過強，則可能誘發(fā)暴發(fā)性肝功能衰竭。

2.肝纖維化。肝纖維化是慢性肝病共有的病理改變，有研究表明各種類型的肝纖維化中都存在凋亡。肝星狀細胞（HSC）的激活是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。1998年Gong等報道HSC向肌成纖維細胞（MFB）的轉(zhuǎn)變與sFasL介導(dǎo)的凋亡增強相平行，Bcl-2和Bcl-XL在早期HSC上的表達高于晚期HSC和MFB，Bax則相反。這說明調(diào)節(jié)HSC的凋亡易感性在肝纖維化發(fā)生機制中起重要作用。

3.肝硬變。凋亡現(xiàn)象在肝硬變病例的肝細胞、膽管細胞、單核細胞中普遍存在。1999年Frommel等對照研究了正常肝組織、丙型肝炎和肝硬變標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)對Bcl-2的表達逐漸增強，肝硬變患者中表達最強，提出了一種解釋肝硬變患者中肝癌高發(fā)生率的新機制。

4.肝癌。肝細胞癌形成過程中，不僅癌細胞異常增生，而且突變的細胞凋亡減少，肝癌細胞對凋亡誘導(dǎo)反應(yīng)明顯缺陷，1998年Jodo等報道肝癌血清中sFas水平升高，切除腫瘤后，sFas水平即下降。一些抑癌劑如:硒、類維生素A、化療藥物等可促進鼠肝的潛在惡性細胞的凋亡，從而降低肝癌的發(fā)病率，這從一個側(cè)面反映了凋亡在肝癌發(fā)病機制中的地位。1997年Cras L等報道在非基因毒性致癌物nafenopin所致的原發(fā)性肝癌中，正常肝細胞和肝腫瘤細胞都會受到抑制。當(dāng)nafenopin的作用消失后，二者的凋亡都增加。后者的增殖率和凋亡率都高于前者。

第4篇：細胞凋亡范文

細胞凋亡(apoptosis)又稱為程序性死亡，是由基因控制的細胞自我消亡過程。其特征是質(zhì)膜保持完整性，而核染色質(zhì)固縮，內(nèi)源性內(nèi)切酶激活，將染色質(zhì)DNA降解成寡聚小體，電泳帶譜表現(xiàn)為特征性梯狀帶，無整個組織的破壞和炎性反應(yīng)。1992年英國科學(xué)家Hickman等首次提出可以將誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡作為以后腫瘤治療研究的主要目標(biāo)和手段，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡治療逐漸成為國際腫瘤研究的一個熱點。近年研究表明，許多中藥的有效成分或其提取液具有誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的作用，中藥誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的作用機制主要有以下幾個方面。

1 阻滯腫瘤細胞增殖周期

一般而言，每一代腫瘤細胞的增殖周期都需要依次經(jīng)歷G1期、S期、G2期、M期四個階段。許多中藥的有效成份能夠作用于細胞周期的某一環(huán)節(jié)，從而使細胞增殖周期受阻，誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。用藤梨根氯仿提取液處理人肺腺癌A549細胞，可以對細胞周期產(chǎn)生影響，表現(xiàn)為G0/G1期細胞增多，S期和G2/M期細胞減少，出現(xiàn)G0/G1期阻滯，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴關(guān)系，伴PI染色檢測的細胞凋亡率增加，提示藤梨根氯仿提取液可抑制A549細胞的有絲分裂，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡[1]。Li等[2]報道黃連提取物及其主要成分小檗堿都可以在不影響CyclinB1 mRNA表達情況下，抑制CyclinB1蛋白活性，但不抑制Cyclin A～Cyclin E蛋白活性，使cdc2激酶活性降低，細胞進入有絲分裂受阻滯，被阻滯在G2期。某些藥物可以阻滯腫瘤細胞由S期進入G2/M期而誘發(fā)其凋亡。左云飛等[3]研究發(fā)現(xiàn)，欖香烯對肝癌腹水瘤細胞系Hca2F25/CL216A3的G0/G1期細胞無明顯作用，主要作用在S期，阻止細胞由S期進入G2/M期，從而抑制腫瘤生長。并觀察到在G0/G1期前出現(xiàn)一個凋亡特異的AP峰。黃志煜等[4]報道小檗胺可抑制人白血病Jurkat細胞的增殖，使細胞阻滯在S期，G0/G1期細胞比例也有減少，同時并也觀察到腫瘤細胞凋亡明顯增加。

較多的中藥通過阻滯腫瘤細胞于G2/M期而發(fā)揮誘導(dǎo)細胞凋亡的作用。馬東禮等[5]在研究欖香烯對HeLa細胞的作用時發(fā)現(xiàn)，HeLa細胞增殖受到明顯的抑制，細胞的分裂能力降低，絕大多數(shù)細胞阻滯在G2/M期。張曼穎等[6]研究發(fā)現(xiàn)，刺五加葉皂苷能誘導(dǎo)肺癌細胞SpcA1凋亡，細胞周期分析發(fā)現(xiàn)，G0/G1和S期細胞比例明顯降低，G2/M期細胞明顯升高，提示刺五加葉皂苷作用也是使SPCA1細胞阻滯于G2/M期。毛蘭素是從鼓槌石斛中分離得到的，也可以阻滯人早幼粒細胞白血病HL60細胞于G2/M期，并伴Bcl2表達下調(diào)，Bax表達上調(diào)，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡[7]。

2 影響癌基因和抑癌基因的表達

在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，腫瘤細胞表達的凋亡相關(guān)基因起重要的調(diào)控作用，其中的某些基因發(fā)生缺失，突變或過度表達，可導(dǎo)致細胞增殖失控或凋亡受阻。因此，如何調(diào)控凋亡相關(guān)基因或其相應(yīng)產(chǎn)物，提高腫瘤細胞對藥物的敏感性，并誘導(dǎo)細胞進入凋亡是腫瘤治療取得成功的關(guān)鍵。目前bcl2、cmyc、p53是幾個了解較為深入的、與凋亡調(diào)控有關(guān)的基因。

野生型p53(wtp53)基因的主要生物學(xué)功能為引起細胞周期阻滯，誘導(dǎo)細胞凋亡和促進分化，對細胞生長起負調(diào)控作用，而因基因缺失或突變產(chǎn)生的突變型P53(mtp53)蛋白則對細胞的增殖和轉(zhuǎn)化起促進作用，抑制細胞凋亡，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[8]。p53基因發(fā)生突變是許多人類惡性腫瘤中常見的基因改變之一。實驗證明[9]，大蒜素通過促進抑癌基因p53和p21的表達誘導(dǎo)人早幼粒細胞白血病HL60細胞和胃癌BGC823細胞凋亡。Wilson等[10]發(fā)現(xiàn)金雀異黃素(genistein)能誘導(dǎo)大腸癌HCT2116細胞的抑癌基因非甾體抗炎藥活化基因NAG21和p53、p21的表達，并通過誘導(dǎo)p53基因來調(diào)節(jié)NAG21的表達。而在大腸癌HCT215細胞(p53基因缺失)中NAG21不能被誘導(dǎo)表達，提示金雀異黃素通過調(diào)節(jié)p53基因而誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。

郭偉劍等[11]采用血清藥理學(xué)方法研究健脾理氣藥(黨參、白術(shù)、茯苓、八月札等)的體外誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)。結(jié)果顯示，含中藥血清作用2天后，誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡，使細胞周期阻滯于S期，并上調(diào)p53蛋白的表達，提示上調(diào)p53蛋白的表達可能為健脾理氣藥誘導(dǎo)肝癌SMMC7721細胞凋亡的分子機制之一?？拱┛诜?由人參、靈芝和白花蛇舌草組成的復(fù)方水煎湯劑)作用于人胃癌MGC803細胞株，發(fā)現(xiàn)其具有明顯抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用，用藥前后凋亡相關(guān)基因p53蛋白、Bcl2蛋白表達均減少，而Fas抗原表達明顯增高，差別均有顯著性改變[12]。

原癌基因bcl2、cmyc是主要的凋亡調(diào)控基因。bcl2能抑制細胞凋亡，bcl2受抑制被認為可能是細胞凋亡的共同通道[13]。而bax基因則傾向于分布在終末分化細胞、退化細胞，在凋亡旺盛的細胞中表達更強，在功能上與bcl2相反，其過度表達則觸發(fā)凋亡。袁懷波等[14]用RTPCR和蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)，發(fā)現(xiàn)葛根黃酮提取物、葛根素和大豆苷元處理HL60細胞后能夠上調(diào)bax mRNA表達水平，下調(diào)Bcl2蛋白表達和上調(diào)bax蛋白表達。姚保泰等[15]研究，發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿可通過下調(diào)bcl2的表達而達到防治胃癌及癌前病變的目的。左小東等[16]研究華蟾素誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡與細胞周期阻斷和抗凋亡基因bcl2表達之間的關(guān)系。結(jié)果華蟾素能將腫瘤細胞阻斷在S期，并能抑制bcl2基因的表達。馬靖等[17]研究表明，cmyc、cjun和cfos上調(diào)參與甘草誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的調(diào)控。何承偉等[18]研究半邊旗提取物6F對HL60細胞內(nèi)cmyc、bcl2及增殖細胞核抗原(PCNA)表達的影響，發(fā)現(xiàn)給予6F 8～231nmol/L，作用HL60細胞12小時，流式細胞分析示cmyc、bcl2及PCNA蛋白表達水平明顯下降，并呈劑量效應(yīng)關(guān)系。

因此，中藥誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的機制可能與一些癌基因和抑癌基因的表達改變有關(guān)，但其中可能的具體機制仍需進一步研究。

3 抑制端粒酶活性

端粒酶可能是目前已知的最廣譜的惡性腫瘤分子標(biāo)記物，并且與細胞周期和腫瘤凋亡基因表達關(guān)系密切。因此，鑒于端粒酶在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中所扮演的重要角色，端粒酶活性的抑制可能是某些抗癌藥物發(fā)揮作用的機制。

陳偉忠等[19]利用TRAPELISA法半定量檢測了不同濃度的苦參堿對肝癌細胞HepG2端粒酶活性的影響。結(jié)果顯示，苦參堿對HepG2的端粒酶活性有一定的抑制作用。同時認為苦參堿抗腫瘤的機制可能與抑制hTERT表達、降低端粒酶活性有關(guān)。曾建新等[20]實驗發(fā)現(xiàn)，肝癌HCC9204細胞中端粒酶活性較高，而當(dāng)用AS2O3處理48小時后，測得端粒酶活性顯著降低，提示抑制端粒酶活性是AS2O3誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡的機制之一。黎丹戎等[21]實驗表明，茶多酚具有誘導(dǎo)BEL7402細胞分化的作用，并能降低端粒酶活性的表達。同時并沒有發(fā)現(xiàn)發(fā)生分化的細胞端粒酶活性不下降的情況。說明端粒酶的活性抑制是細胞分化過程所伴有的，提示茶多酚的抗癌機制可能是通過抑制端粒酶的活性而實現(xiàn)。李伏娥等[22]用PCRELISA法對胃癌細胞端粒酶活性進行檢測，苦參堿在誘導(dǎo)細胞凋亡的同時伴隨端粒酶活性下調(diào)，且隨苦參堿濃度增大和時間延長，抑制作用逐漸增強。提示苦參堿誘導(dǎo)細胞凋亡的調(diào)控可能與端粒酶表達調(diào)控之間存在密切聯(lián)系。

韓國槲寄生中的凝集素能抑制肝癌細胞端粒酶活性[23]，桔梗屬grandiflorum的水提取物能抑制肺癌細胞株A549端粒酶活性[24]。姜黃素能誘導(dǎo)白血病細胞株HL60細胞[25]和卵巢癌K562[26]細胞凋亡，伴有端粒酶活性抑制，且表現(xiàn)為濃度依賴性[25，26]。柴胡屬中的scorzonerifolium也能誘導(dǎo)肺癌細胞株A549細胞凋亡并能抑制其端粒酶活性[27]。

目前，多數(shù)研究認為，這些藥物抑制腫瘤細胞端粒酶活性可能是誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的機制之一。

4 影響細胞凋亡信號傳導(dǎo)

caspase是一個半胱氨酸蛋白酶家族， 是細胞凋亡的主要執(zhí)行者。 已發(fā)現(xiàn)的14種caspase均以酶原(procaspase)形式存在并定位于細胞內(nèi)不同的亞細胞部位。 caspase8基因位于染色體2q3334。 caspase8也稱MACH、FLICE、Mch5，1996年被克隆成功， 以無活性的酶原(procaspase8)形式存在于成人及除胎兒腦組織外的各種組織中， 在外周血白細胞中分布較高。 procaspase8有479個氨基酸， 分子量為55kD， 其8種異構(gòu)體中2種有完整的酶活性， 能啟動死亡受體介導(dǎo)的凋亡。 在死亡受體(Fas、DR4和HDR5等)介導(dǎo)的細胞凋亡途徑中， caspase8是關(guān)鍵的啟動型caspase。 caspase3是CE/CED3家族的重要成員， 是細胞凋亡調(diào)控的重要因子之一。 一般以23000相對分子質(zhì)量的無活性前體存在于細胞質(zhì)中， 當(dāng)細胞進入凋亡時被激活， 并可促進ICE家族其他成員一起促進細胞凋亡， 被認為是多種凋亡途徑的共同作用因子。

Moragoda[28]報道，姜黃素能抑制胃癌KAT0III和結(jié)腸癌HCT116細胞增殖并誘導(dǎo)凋亡，使HCT2116細胞的細胞周期停止于G2/M期，免疫印跡結(jié)果顯示兩種細胞cyclinD、E水平下降，其誘導(dǎo)凋亡的機理是導(dǎo)致PARP斷裂，激括caspase8活性，啟動Fas凋亡途徑。

Pan等[29]研究烏龍茶多酚誘導(dǎo)人組織淋巴瘤U937細胞凋亡時發(fā)現(xiàn)，烏龍茶多酚可通過釋放細胞色素C，活化caspase9、caspase3來誘導(dǎo)細胞凋亡。

韓國槲寄生中凝集素[23]、桔梗屬grandiflorum[24]、姜黃素[25，26]、柴胡屬中的scorzonerifolium[27]已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)能誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡且能抑制端粒酶活性，具有毒副作用小的優(yōu)點。他們的研究均提示誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡是通過觸發(fā)細胞色素C從線粒體向胞質(zhì)的釋放，伴有一些caspase激活而實現(xiàn)的，并可見上調(diào)bax表達和下調(diào)bcl2蛋白表達。推測線粒體途徑是主要的通路。

盡管caspase3是多種凋亡途徑共同作用的因子，但并非是所有細胞凋亡途徑的共同通路。有報道證實，冬凌草素甲可以誘導(dǎo)人乳腺癌MCF7細胞凋亡，表現(xiàn)為caspase9依賴性，而非caspase3依賴性[30]。最近，還有報道白藜蘆醇MCF7細胞凋亡與caspase8和casDase3的激活無關(guān)，但與bcl2、NFkappaB下調(diào)有關(guān)[31]。曲古抑菌素A也能誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡，可能與P53和bax蛋白表達增加，bcl2蛋白和SurViVin蛋白表達減少有關(guān)，并獨立于caspase途徑[32]，這也說明細胞凋亡可在沒有caspase參與的條件下發(fā)生，存在不依賴caspase的凋亡通路。

另外，某些中藥誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡的機理還與蛋白激酶(PKC)、cAMP等信息分子有關(guān)。PKC可拮抗皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的胸腺細胞凋亡，槲皮素作為PKC的拮抗劑，可逆轉(zhuǎn)這種作用，增強機體對腫瘤細胞的吞噬能力，誘導(dǎo)細胞凋亡。槲皮素能降低PTK活性，抑制cAMP和cGMP的磷酸二酯酶，增加cAMP水平，降低cGMP水平，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)二者的比值，控制細胞凋亡的蛋白磷酸化，導(dǎo)致腫瘤細胞凋亡[33]。

5 展 望

隨著研究工作的不斷深入，細胞凋亡的研究為腫瘤治療提供了新的思路和靶點。人們已經(jīng)認識到誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡很可能是腫瘤治療的一個新策略。但是，在中醫(yī)藥與細胞凋亡關(guān)系研究領(lǐng)域，相關(guān)中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究明顯滯后于中藥作用機制研究，目前主要限于運用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)手段檢測某些中藥或方劑對腫瘤細胞的誘導(dǎo)凋亡作用，而缺乏對相應(yīng)中醫(yī)理論的探討。因此，將傳統(tǒng)中醫(yī)基礎(chǔ)理論與現(xiàn)代分子生物學(xué)有機地結(jié)合，開展“中醫(yī)分子生物學(xué)”的研究，對中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究具有十分重要的意義。

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第5篇：細胞凋亡范文

【摘要】HSS具有促進肝癌細胞增生和抑制其分裂增生、引起肝癌細胞凋亡的雙向作用。HSS可能與多種化療藥物誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡有協(xié)同作用，并且明顯減輕化療藥物的毒副作用，對化療性肝損傷具有保護作用，有可能開創(chuàng)一種細胞因子與化療藥物相結(jié)合治療肝癌的極具潛力的新療法。

【關(guān)鍵詞】肝細胞刺激因子；肝癌；凋亡

【中圖分類號】R735.7【文獻標(biāo)識碼】A【文章編號】1007-8517(2009)02-0016-02

肝臟是生物體內(nèi)一種具有很強再生能力的器官，從中分離純化出具有再生刺激功能的物質(zhì)一直是國內(nèi)外研究人員關(guān)注的重點。特異性的肝細胞生長刺激因子，HGF（血源性）、HSS（肝源性）、ALR（胞源性）在功能機制方面有許多共同和相似之處，又具有各自獨特的功能。在臨床上，它們既能啟動肝損傷后的再生與修復(fù)，又能抑制某些肝癌細胞的生長，在肝病治療藥物中占有極其重要的地位。由于HSS特異性地促肝細胞生長的活性，參與肝細胞再生的調(diào)控等，一直是肝炎治療、肝細胞調(diào)控的研究熱點。而HSS對肝癌細胞株的作用各家報道不一，限制了HSS臨床應(yīng)用。本文就HSS誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡的研究進展作一綜述。

1HSS研究概況

1975年LaBrecque從初斷乳大鼠和肝部分切除后的再生肝中提取出一種生物活性物質(zhì)，稱為肝細胞刺激因子(HSS)。它能刺激肝細胞有絲分裂，促進肝細胞再生和肝細胞DNA的合成，加速肝臟修復(fù)，保護肝細胞的作用。其機制仍不清楚。國內(nèi)目前臨床用的促肝細胞生長素即屬于HSS類。HSS至今尚未得到純化單一的活性物質(zhì)，其分子結(jié)構(gòu)和DNA序列仍不清楚，但有研究顯示是一類分子量約為12～18kD，帶強負電荷、微弱疏水的多肽類物質(zhì)的總和。HSS沒有種屬特異性，但有器官特異性：HSS在體內(nèi)對骨髓、脾臟、腎等器官均不作任何反應(yīng)；在體外，對8種正常的或惡變的非肝臟起源細胞株也沒有作用，然而無論體內(nèi)、外，正?；驉鹤兊母闻K起源的細胞均能對HSS產(chǎn)生較強的反應(yīng)。HSS可由胎肝、再生肝中提取得到，但成年鼠肝臟提取物則無此物質(zhì)。體外翻譯實驗表明，人胎肝細胞的多聚A-mRNA可以引導(dǎo)人HSS的生物合成，表明HSS是人胎肝組織的基因表達產(chǎn)物，而不是酶催化加工的結(jié)果。HSS存在乳肝組織或再生肝組織的肝細胞胞漿中，肝細胞膜上有相應(yīng)的受體，在非肝細胞中未發(fā)現(xiàn)HSS。HSS與其他肝再生調(diào)控因子的主要不同之處在于具有耐熱性并僅存在于生長狀態(tài)的肝臟中。

2HSS誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡的研究進展

HSS具有較強的抗損傷能力，可能減輕多種因素(病毒、細菌、化學(xué)毒物、缺血再灌注等)引起的肝細胞凋亡的發(fā)生[1]，它能刺激肝細胞DNA合成及肝細胞再生，并對肝細胞具有保護作用。HSS對肝癌細胞的作用各家報道不一。由于體外實驗證明HSS對肝癌細胞株DNA合成也有促進作用[2]，因而HSS能否致癌變及能否應(yīng)用于肝癌治療，一直是人們關(guān)心的問題。李茹冰等研究表明，HSS的某些組份在體外尚可抑制肝癌細胞的增殖活性。大多數(shù)研究認為低濃度時，對肝癌細胞生長無明顯刺激作用，較高濃度則有明顯抑制肝癌細胞生長作用[3]。吳國慶等實驗發(fā)現(xiàn)[4]HSS對正常大鼠肝臟細胞和人肝癌細胞呈促進增生和抑制其分裂增生、引起自溶和死亡的雙向作用。研究表明[5]，HSS對肝細胞生長起雙重調(diào)控作用，不但能促進肝細胞DNA合成，同時還能抑制肝癌細胞生長，預(yù)防黃曲霉素導(dǎo)致的大鼠肝癌前病變。在體外實驗，細胞水平證實[6]，HSS能抑制肝癌細胞活力，但無明顯形態(tài)學(xué)損害的表現(xiàn)。有學(xué)者通過瓊脂糖凝膠電泳及流式細胞檢測證實[7]，肝癌細胞活性的降低系HSS和ADR的作用下發(fā)生細胞凋亡所致。其他學(xué)者通過實驗亦得出 HSS對肝癌細胞生長具有抑制作用，且對肝癌細胞的凋亡具有促進作用[8]。但類似的動物實驗尚需進一步證實?？梢奌SS具有誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡的作用是肯定的。當(dāng)然，肝的再生增殖、凋亡等的調(diào)控并不是由單一因素決定的，HSS作為一種促肝生長物質(zhì)是不可能完全獨立發(fā)揮作用的。HSS單獨對肝癌細胞系的凋亡誘導(dǎo)作用很弱，很可能與多種化學(xué)藥物作為促進劑共同發(fā)揮作用。

3HSS誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡的作用機制

自發(fā)現(xiàn)HSS以來，雖然受到一些學(xué)者的關(guān)注，但HSS對相同起源的正常和惡性腫瘤細胞為何表現(xiàn)出相反的作用，其機制仍不清楚。首都醫(yī)科大學(xué)生物學(xué)實驗室報道[9]，HSS刺激肝細胞生長的機理可能是誘導(dǎo)細胞EGF受體(EGFR)mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，上調(diào)EGFR的數(shù)量，提高EGFR的親和力和磷酸化程度，促使其內(nèi)向化。EGFR具有酪氨酸激酶活性，其活化后可誘導(dǎo)形成包括Ras在內(nèi)的細胞信號傳導(dǎo)通路，最終導(dǎo)致細胞增殖[10]。HSS促肝癌細胞生長亦可能通過調(diào)節(jié)EGFR介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路所為。戴杰等[2]報道，HSS系通過調(diào)節(jié)EGFR介導(dǎo)的細胞信號傳導(dǎo)通路促肝癌細胞生長。HSS與肝細胞或肝癌細胞膜表面的EGFR結(jié)合，促使EGF與受體內(nèi)向化，繼而活化EGFR，后者則作用于膜內(nèi)面的p21ras，引發(fā)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的瀑布效應(yīng)。因此，在基因水平HSS刺激EGF受體表達，可能是HSS啟動肝細胞再生的關(guān)鍵。

有學(xué)者通過實驗發(fā)現(xiàn)HSS作用后的肝癌細胞突變型P53蛋白表達明顯降低，可能是HSS促進肝癌細胞凋亡的原因之一[8]。HSS對肝癌細胞的生長調(diào)節(jié)作用與肝癌細胞EGFR/DNA表達密切相關(guān)[11]。HSS誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡亦可能是通過作用于細胞膜上的EGFR而發(fā)揮其生物效應(yīng)的。實際上EGF于不同細胞系可分別誘導(dǎo)凋亡及減輕凋亡。HSS與EGFR結(jié)合后引起EGFR構(gòu)象的改變[12]。HSS進入細胞，產(chǎn)生一系列理化反應(yīng)，最終在核內(nèi)啟動一些基因的表達，如p53基因的表達，進一步表現(xiàn)出其效應(yīng)。也有學(xué)者認為HSS在促進肝細胞再生的同時，可能同時具有促進細胞分化的作用，而肝癌細胞凋亡的發(fā)生可能與這種尚未證實的促分化作用有關(guān)[7]。

4HSS抗化療性肝損傷的作用

HSS通過增強肝細胞抗氧化能力，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，在一定程度上拮抗CTX、CCl4的肝毒性[13]。HSS能夠阻止化學(xué)毒物或藥物導(dǎo)致的肝細胞膜流動性的降低，能夠有效地維持急性肝損傷后線粒體的通透性[5]，線粒體膜通透性改變可能是細胞死亡的關(guān)鍵性機制，改善肝臟線粒體的呼吸功能，因而阻止細胞死亡。據(jù)報道，HSS能促進肝細胞膜的穩(wěn)定性，增強肝細胞對化療藥物的耐受性，減輕肝細胞的損傷，提高化療效果，明顯縮小腫瘤病灶，延長生存期，并能減輕化療引起的嘔吐等消化道反應(yīng)。可見HSS作為一種有效的天然的肝細胞特異性保護劑應(yīng)用于臨床，可望成為化療性肝損傷有效治療方法之一。

5小結(jié)

肝癌的化療敏感性較差，全身化療反應(yīng)率在20%左右，且肝癌的聯(lián)合化療方案并未顯示出比單一藥物化療更明顯的優(yōu)勢，相反，聯(lián)合化療不可避免的具有更高的毒性。研究結(jié)果證實多種化療藥物均有誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的作用，誘導(dǎo)細胞凋亡成為腫瘤治療的一個方向。HSS可能與多種化療藥物誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡有協(xié)同作用，并且明顯減輕化療藥物的毒副作用，對化療性肝損傷具有保護作用，應(yīng)用于人體可能發(fā)揮顯著的抗肝癌作用，有可能開創(chuàng)一種細胞因子與化療藥物相結(jié)合治療肝癌的極具潛力的新療法。

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第6篇：細胞凋亡范文

一、心肌缺血再灌注過程中細胞凋亡的實驗依據(jù)

雖然目前有多項研究顯示缺血再灌注可誘發(fā)心肌細胞凋亡，但是關(guān)于凋亡是由心肌缺血性損傷所誘發(fā)還是由再灌注損傷所誘發(fā)的問題仍然存在有爭議。Kajstura 等[2]發(fā)現(xiàn)，在體大鼠心肌缺血2～3h 后即可出現(xiàn)凋亡細胞，缺血4.5h 后凋亡細胞的數(shù)量達到高峰，然后逐漸降低。采用在體大鼠心肌缺血再灌注模型發(fā)現(xiàn)，持續(xù)缺血 2.25h或缺血45min后再灌注1h均有凋亡細胞的產(chǎn)生，并且隨著再灌注時間的延長，凋亡細胞的數(shù)目增加[3]。與上述研究結(jié)果不同，采用在體家兔心肌缺血再灌注模型發(fā)現(xiàn)，單純?nèi)毖?0min、4.5h 和缺血5min 再灌注4h 的心肌細胞均未出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，而缺血30min再灌注4h的心肌細胞則出現(xiàn)了凋亡，因此認為凋亡是心肌對缺血再灌注損傷的一個特殊反應(yīng)[4]。Zhao等[5]采用犬冠狀動脈完全性梗阻7h或梗阻1h后再灌注6h模型進行研究發(fā)現(xiàn)，盡管長時間缺血后可出現(xiàn)明顯的心肌壞死，但是原位TUNEL 染色顯示壞死區(qū)的凋亡細胞極少，而且缺乏特征性“DNA 梯狀條紋”。相比之下，缺血1h 再灌注6h 則可誘發(fā)凋亡細胞數(shù)目明顯增加和出現(xiàn)典型的特征性“DNA 梯狀條紋”，而且凋亡細胞大多是出現(xiàn)在壞死心肌的周圍區(qū)域，即缺血后血管再通的相關(guān)部位和梗死灶的收縮帶區(qū)域。該研究結(jié)果提示，缺血再灌注后的心肌細胞凋亡主要是由再灌注過程誘發(fā)的。綜合上述文獻，目前認為長時間持續(xù)性缺血和再灌注均可誘發(fā)心肌細胞發(fā)生凋亡，尤其是再灌注后細胞內(nèi)ATP 水平迅速恢復(fù)、胞漿和線粒體內(nèi)鈣超載以及自由基大量生成，更是加速了不可逆性細胞凋亡的發(fā)生[1]。

二、心肌缺血和再灌注過程中細胞凋亡及壞死的時程變化關(guān)系

在缺血后再灌注期間，心肌細胞的凋亡過程可分為幾個階段：①再灌注早期的起始階段；②中性粒細胞浸潤的中間階段；③數(shù)天、數(shù)周或數(shù)月之后的延遲階段，該階段可能與心室重塑和心功能衰竭的發(fā)生有關(guān)[6]。

對于心肌缺血和再灌注過程中細胞凋亡及壞死的演變規(guī)律，目前同樣存在著較大的爭議。Kajstura等[2]采用在體大鼠心肌缺血模型研究發(fā)現(xiàn)，心肌缺血2h后，凋亡細胞和壞死細胞同時出現(xiàn)；隨著缺血時間延長，在凋亡細胞增多的同時亦演變?yōu)閴乃兰毎?。Zhao 等[7]采用犬心肌局部缺血1h 再灌注 6h、24h、48h 或72h 模型研究發(fā)現(xiàn)，心肌壞死的程度在再灌注24h時最為嚴重，此后一直保持著相對恒定的狀態(tài)。相比之下，隨著再灌注時間延長，凋亡細胞在壞死組織周圍區(qū)進行性增多，至再灌注72h 時達到高峰。這提示細胞壞死和細胞凋亡在再灌注期間可同時發(fā)生，并且在再灌注早期壞死的發(fā)生率相對較高，而在再灌注后期凋亡的發(fā)生率較高。

三、細胞凋亡在心肌缺血再灌注損傷中的作用

由于再灌注期間凋亡細胞主要是出現(xiàn)在壞死心肌的周圍區(qū)域，所以提示凋亡可能在缺血再灌注后心肌梗死范圍的擴大中發(fā)揮著一定的作用[5]。為此，有人采用核酸內(nèi)切酶抑制劑—金精三羧酸（ATA）分析了凋亡在缺血再灌注后心肌梗死中的作用[7]。結(jié)果顯示，在犬冠狀動脈梗阻1h 再灌注24h 模型上，再灌注開始時采用ATA處理可明顯減少壞死組織周圍區(qū)凋亡心肌細胞的數(shù)目，同時伴有特征性“DNA梯狀條紋”的缺失。這種凋亡程度的降低主要是與Bcl-2 上調(diào)以及Bax 和細胞凋亡蛋白酶（Caspase-3）活性降低有關(guān)。更為重要的是，ATA 所致的心肌凋亡抑制可明顯縮小心肌梗死的面積。采用小鼠心臟特異性細胞凋亡蛋白酶過度表達模型的研究發(fā)現(xiàn)，在缺血后心肌細胞凋亡加重的同時，亦出現(xiàn)了心肌梗死面積的擴大和心功能的惡化 [1]。這說明細胞凋亡和細胞壞死之間存在著一定的交叉和聯(lián)系，因此抑制心肌細胞凋亡可能是臨床上有效防治心肌缺血再灌注損傷的一條重要途徑。

四、心肌缺血再灌注過程中細胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

目前認為，各種促凋亡的損傷因素一般是通過激活死亡受體（death receptor， DR）依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和線粒體依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘發(fā)細胞凋亡[8]。死亡受體被其相應(yīng)的促凋亡配體激活后，可導(dǎo)致凋亡調(diào)控基因（主要是Bcl-2 家族）表達失衡和胞漿蛋白酶（即Caspase 家族）活化。而線粒體依賴性途徑被激活后，可誘發(fā)線粒體釋放細胞色素C（cyto C）和凋亡蛋白酶活化因子-1（Apaf-1），并與半胱天冬酶9 的前體形成復(fù)合物，激活下游的半胱天冬酶。半胱天冬酶是細胞凋亡過程的執(zhí)行器，通過上述兩條途徑激發(fā)半胱天冬酶家族的級聯(lián)反應(yīng)是細胞發(fā)生凋亡的一個中心環(huán)節(jié)[9]。

（一）由死亡受體介導(dǎo)的細胞凋亡

腫瘤壞死因子（TNFα）、Fas配體（FasL）和TNF-相關(guān)性凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）均可誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡，因此被稱為死亡因子（death factor）。介導(dǎo)它們誘導(dǎo)凋亡作用的受體被稱之為死亡受體。位于細胞膜表面的死亡受體主要包括TNFR1（亦稱為 p55 或CD120a）、Fas（亦稱為CD95 或Apo1）、DR3、DR4 和DR5，它們的共同特征是胞內(nèi)部分有一大約80 個氨基酸殘基構(gòu)成的死亡功能域（death domain，DD）。死亡因子可分別激活相應(yīng)的受體，啟動導(dǎo)致凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。激活的死亡受體可與細胞內(nèi)的多種亦具有死亡功能域的受體接頭蛋白相結(jié)合。其中，激活的Fas 和DR3 可與Fas相關(guān)性死亡功能域（FADD）相結(jié)合，而激活的TNFR1和DR4可與TNFR相關(guān)性死亡功能域（TRADD）相結(jié)合。此外，通過TRADD 和FADD 之間的相互作用，來自 TNFR1的激活信號亦可與Fas 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)生聯(lián)系[10]。

死亡受體激活后，可通過一系列反應(yīng)激活胞漿內(nèi)的胱門蛋白酶。一般認為，胱門蛋白酶的活化是凋亡執(zhí)行過程中的最后通路。胱門蛋白酶家族屬于白介素-1β轉(zhuǎn)化酶（ICE）類蛋白，因可在天冬氨酸殘基之后將底物裂解，故目前被稱之為半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶。根據(jù)胱門蛋白酶在細胞凋亡中的作用及其N 端的長度，可將其分為啟動子胱門蛋白酶（包括胱門蛋白酶-8、9 和10）和效應(yīng)子胱門蛋白酶（包括胱門蛋白酶-3、6 和7，能被啟動子胱門蛋白酶所激活）。在正常情況下，胱門蛋白酶是以無活性的酶原形式存在。在心肌缺血性損傷和再灌注損傷的刺激下， Fas-FADD 和TNFα-TRADD 可誘導(dǎo)啟動子胱門蛋白酶-8 和10 的激活，然后酶解激活下游的效應(yīng)子胱門蛋白酶-3、6和7而導(dǎo)致細胞凋亡。效應(yīng)子胱門蛋白酶（尤其是胱門蛋白酶-3）是細胞凋亡的執(zhí)行器，活化后可裂解破壞細胞的必需成分（例如細胞骨架和核蛋白）和抑制受損傷DNA 的修復(fù)，從而誘發(fā)細胞凋亡。研究顯示，促凋亡配體與死亡受體結(jié)合后誘發(fā)細胞凋亡的反應(yīng)可在數(shù)小時內(nèi)迅速發(fā)生，無須RNA 或蛋白質(zhì)合成，而且亦不依賴于線粒體[11]。也有研究發(fā)現(xiàn)，死亡受體TNFR1 被激活后還可進一步激活核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）和絲裂素活化蛋白激酶（MAPK）/c-jun氨基末端激酶（c-jun N-terminal kinase，JNK）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來調(diào)控心肌細胞凋亡，但是激活后的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路目前尚未被完全闡明[9]。

（二）由線粒體損傷啟動的細胞凋亡

在死亡信號到達線粒體之后，首先引起線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運孔開放，然后線粒體內(nèi)外膜間的凋亡誘導(dǎo)蛋白被釋放進入胞漿，主要包括cyto C、凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）和半胱天冬酶-2、3、9的前體。在dATP的存在下，線粒體釋放的cyto C 可與Apaf-1 形成三聚體。該復(fù)合體可將半胱天冬酶-9 的前體直接裂解為線粒體依賴性凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中最上游的半胱天冬酶[11]。隨后，活化的半胱天冬酶-9 可將半胱天冬酶-3 的前體裂解為半胱天冬酶-3。而AIF可通過直接激活半胱天冬酶-3而誘發(fā)細胞凋亡。一般認為，凋亡的整個過程通常分為3 個階段：①決定死亡階段：細胞表面的促凋亡信號與細胞內(nèi)的抗凋亡信號發(fā)生聯(lián)合，促使細胞作出生與死的決策；②執(zhí)行死亡階段：如果細胞內(nèi)的平衡狀態(tài)傾向于凋亡，則可激活半胱天冬酶家族酶級聯(lián)反應(yīng)或AIF 核轉(zhuǎn)位而誘發(fā)DNA 降解。③殘體清除階段：包括鄰近細胞對凋亡細胞的包圍和吞噬消化。由于細胞發(fā)展成為不可逆性凋亡的時間需數(shù)分鐘至數(shù)小時或更長，所以在凋亡過程執(zhí)行前可通過操縱有關(guān)因素而影響結(jié)局。這就為損傷后治療干預(yù)提供了一個“機會窗”，在這個機會窗內(nèi)采用一定的措施挽救走向凋亡的心肌細胞，可起到心肌保護作用[12]。

（三）線粒體與半胱天冬酶在誘導(dǎo)細胞凋亡中的相互關(guān)系

線粒體與半胱天冬酶在誘導(dǎo)細胞凋亡的過程中均具有重要作用，而且它們之間可互相獨立又可互相促進?？傮w來講包括下列三種情況：①C半胱天冬酶直接誘導(dǎo)細胞凋亡，沒有線粒體的參與，例如Fas 誘導(dǎo)的凋亡；②線粒體直接誘導(dǎo)細胞凋亡，半胱天冬酶不參與。這種情況主要見于Bax 或Bax 類似蛋白大量表達而抑制半胱天冬酶，使DNA 發(fā)生凝集（而半胱天冬酶可使DNA 發(fā)生降解）和線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運孔開放；③線粒體和半胱天冬酶共同參與細胞凋亡，以實現(xiàn)死亡信號的級聯(lián)放大，加快凋亡的發(fā)生[11]。

目前，線粒體損傷和半胱天冬酶活化在缺血再灌注過程中誘發(fā)心肌細胞凋亡的作用已經(jīng)得到了證實。采用培養(yǎng)的心肌細胞缺氧/復(fù)氧模型、在體大鼠局部心肌缺血再灌注模型以及氧化應(yīng)激介導(dǎo)的犬心室功能障礙模型進行的研究均發(fā)現(xiàn)，cyto C 釋放以及半胱天冬酶-3 和半胱天冬酶-9 活化可誘發(fā)心肌細胞凋亡。能夠阻斷cyto C 釋放和半胱天冬酶活化的藥物和處理措施均可明顯減輕心肌細胞凋亡的程度，而加入外源性細胞色素C 和dATP 則可激活足以誘發(fā)心肌細胞凋亡的半胱天冬酶[6，11]。而且，在原發(fā)性心肌病患者心肌中檢測到的心肌凋亡細胞亦可能是由線粒體cyto C 釋放所致的半胱天冬酶-3 活化引起的。在犬心肌缺血再灌注損傷模型的研究顯示，缺血心肌內(nèi)存在活化型半胱天冬酶-3 的高度表達[7]，并且抑制半胱天冬酶的活性可明顯減輕心肌細胞凋亡的程度和縮小心肌梗死的面積[13]。

五、心肌缺血再灌注過程中細胞凋亡的發(fā)生機制

（一）心肌細胞凋亡的基因調(diào)控

細胞凋亡的調(diào)控基因分為誘導(dǎo)基因（死亡基因）和抑制基因（生存基因）。在生理條件下，心肌細胞有序而協(xié)調(diào)地激活凋亡誘導(dǎo)基因（Bax、Fas、p53 等）和/或凋亡抑制基因（Bcl-2 等），共同調(diào)控細胞代謝而維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。但是在缺血再灌注過程中，凋亡相關(guān)基因及其表達產(chǎn)物發(fā)生了變化，從而導(dǎo)致心肌細胞凋亡的發(fā)生。在調(diào)控凋亡的基因中，目前研究較多的是Bcl-2基因家族。

Bcl-2家族包括一組抗凋亡基因（Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w、Bag-1和BI-1）和一組促凋亡基因（Bax、Bak、Bad、Bid和Bim）。Bcl-2是最主要的抗凋亡基因，而Bax 的作用則正好相反，Bcl-2/Bax的比值將決定細胞是否發(fā)生凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，長時間缺血誘發(fā)心肌細胞發(fā)生凋亡之后，心肌內(nèi)Bcl-2 表達減少而Bax 表達增多[14]。據(jù)報道，在梗死區(qū)周圍的存活心肌中有Bcl-2 的陽性表達，而在心肌梗死區(qū)內(nèi)則有Bax 的過度表達。在Bcl-2過度表達的轉(zhuǎn)基因小鼠，缺血和再灌注所致的心肌細胞凋亡、心肌梗死和心功能均明顯減輕。

通常認為Bcl-2 具有抗氧化自由基的作用，可通過減輕脂質(zhì)過氧化和增強細胞對活性氧的耐受而預(yù)防凋亡的發(fā)生。另外，Bcl-2還可防止細胞內(nèi)酸中毒、抑制細胞內(nèi)鈣超載、抑制TNFα的合成和釋放、減輕促凋亡基因Bax的細胞毒性作用以及穩(wěn)定線粒體膜電位和抑制線粒體釋放cyto C 和AIF 等。這些作用均有助于減輕缺血再灌注過程中心肌細胞凋亡的發(fā)生[14]。

（二）心肌細胞凋亡的外部誘發(fā)因素

1．中性粒細胞浸潤 研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細胞在再灌注心肌中聚集增加可加重心肌細胞凋亡的程度，并且危險區(qū)中性粒細胞聚集與凋亡細胞數(shù)目的增加呈線性關(guān)系，提示中性粒細胞與心肌細胞凋亡的發(fā)生密切相關(guān)[5，15]。關(guān)于中性粒細胞如何介導(dǎo)心肌細胞凋亡的發(fā)生目前尚不十分清楚，可能是由于中性粒細胞聚集堵塞微血管而導(dǎo)致無復(fù)流現(xiàn)象，亦可能與中性粒細胞活化后釋放大量的炎性介質(zhì)（例如自由基和細胞因子）有關(guān)[16]。

2．巨噬細胞活化 采用離體和在體心肌缺血再灌注損傷模型的多項研究顯示，巨噬細胞誘發(fā)的炎癥反應(yīng)可能是促發(fā)心肌細胞凋亡的重要因素[16，17]。離體實驗研究顯示，巨噬細胞可通過釋放細胞因子和細胞毒性介質(zhì)（例如TNFα和NO）而誘發(fā)細胞凋亡。在大鼠離體心肌細胞進行的研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞釋放的細胞因子可呈時間依賴性誘導(dǎo)心肌細胞凋亡。近年來也還有研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注心肌內(nèi)的大部分巨噬細胞在再灌注6～24h內(nèi)一直維持著較為完整的形態(tài)，直到48h后才發(fā)生明顯的脫顆粒。再灌注48h 和72h 后聚積在危險區(qū)內(nèi)的巨噬細胞數(shù)和凋亡細胞數(shù)呈明顯的線性關(guān)系，提示活化的巨噬細胞可能參與了再灌注誘發(fā)的延遲性心肌細胞凋亡[5，17]。

3．非炎癥細胞激活 在心肌缺血再灌注過程中，除了上述炎癥細胞之外，被激活的血管內(nèi)皮細胞和心肌細胞亦可合成和釋放大量的炎癥介質(zhì)，然后通過死亡受體依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而誘發(fā)心肌細胞凋亡[15]。

4．氧化應(yīng)激增強 多項研究顯示，氧自由基是啟動凋亡的重要因子，采用抗氧化劑和自由基清除劑可有效抑制細胞凋亡的發(fā)生。氧自由基誘發(fā)凋亡的機制可能為：①氧化破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體膜的完整性而導(dǎo)致細胞內(nèi)鈣超載；②促使線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運孔開放而釋放cyto C；③激活轉(zhuǎn)錄因子AP-1 和NF-κB，后者可通過上調(diào)TNFα和白介素-6而誘導(dǎo)心肌細胞凋亡的發(fā)生[18]。

5．細胞因子與黏附分子大量表達 在心肌缺血再灌注期間，活化的巨嗜細胞、肥大細胞、中性粒細胞以及心肌細胞本身可產(chǎn)生大量的細胞因子和黏附分子。細胞因子不僅可促進心肌炎癥，而且還可與黏附分子相互作用而加重心肌細胞凋亡[15]。在缺血和再灌注期間，心肌細胞內(nèi)的TNFα表達明顯上調(diào)，TNFα可通過下列機制誘發(fā)心肌細胞凋亡：①與其受體TNFR1 結(jié)合后，直接激活心肌細胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；②激活酸性鞘磷脂酶，通過產(chǎn)生脂質(zhì)信使神經(jīng)酰胺而介導(dǎo)細胞凋亡的發(fā)生； ③誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞和部分心肌細胞表達IL-1、IL-2、IL-6、細胞間黏附分子-1（ICAM-1）和血小板活化因子，促進中性粒細胞與內(nèi)皮細胞的黏附和脫顆粒，并激活NADPH 氧化酶而釋放氧自由基，從而間接地調(diào)控凋亡過程[19]。

6．細胞內(nèi)鈣超載 細胞內(nèi)鈣超載是各種損傷因素的最后共同通路。在缺氧誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡中，無論是阻斷細胞外Ca2+內(nèi)流還是減少細胞內(nèi)Ca2+釋放，均能有效減少心肌細胞凋亡的發(fā)生[20]。細胞內(nèi)Ca2+濃度升高后可激活內(nèi)源性Ca2+-Mg2+依賴性核酸內(nèi)切酶，使細胞核內(nèi)染色體DNA降解成寡核苷酸片段。此外，Ca2+還可激活Ⅱ型轉(zhuǎn)谷酰胺酶，使大量蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)，在脂質(zhì)膜下形成蛋白質(zhì)網(wǎng)，防止胞漿內(nèi)成分外漏，避免了像壞死所致的炎癥反應(yīng)。而且，轉(zhuǎn)谷酰胺酶還參與了胞漿膜的修飾，從而有利于吞噬細胞識別形成的凋亡小體而將其吞噬。

7．細胞內(nèi)酸中毒 在心肌缺血再灌注時，無氧代謝可導(dǎo)致細胞內(nèi)、外H+濃度增加而引起酸中毒。細胞內(nèi)酸化可使細胞趨向凋亡，可能與凋亡過程中的一些酶例如核酸內(nèi)切酶的最佳pH

8．一氧化氮與細胞凋亡 一氧化氮（nitric oxide，NO）是體內(nèi)一種重要的生物信號分子，在心血管生理學(xué)和病理學(xué)過程中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)， NO具有細胞毒性作用，可增強氧化應(yīng)激（尤其是iNOS的激活和過氧亞硝基陰離子的大量生成）、干擾能量代謝、直接損害DNA、激活多聚ADP 核糖聚合酶[PARP]或擾亂細胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)，從而誘導(dǎo)包括心肌細胞在內(nèi)的多種細胞發(fā)生凋亡；但是亦有研究報道，NO是一種細胞保護因子，可通過抑制中性粒細胞的黏附和聚集、上調(diào)cGMP、抑制Bcl-2降解和線粒體釋放cyto C以及降低半胱天冬酶的活性而抑制細胞凋亡的發(fā)生[21，22]。至于NO 在心肌缺血再灌注過程中是發(fā)揮促進細胞凋亡還是抑制細胞凋亡的作用，可能取決于NO在心臟內(nèi)發(fā)揮作用的濃度和心臟的氧化還原狀態(tài)。

六、缺血再灌注過程中心肌細胞凋亡的防治

目前，防治心肌缺血再灌注過程中細胞凋亡發(fā)生的措施包括：消除誘發(fā)細胞凋亡的因素、切斷細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、提高心肌細胞內(nèi)源性保護機制和瓦解細胞凋亡信號。由于心肌缺血再灌注過程中細胞凋亡的發(fā)生是多因素和多途徑的，所以阻斷細胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和抑制參與多信號途徑的介質(zhì)是防治細胞凋亡的最有效方法[15]。

研究發(fā)現(xiàn)，β受體阻斷劑可抑制高濃度兒茶酚胺促發(fā)的細胞凋亡[23]，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑亦可抑制血管緊張素Ⅱ引起的心肌細胞凋亡。針對氧化應(yīng)激[18]、細胞內(nèi)鈣超載[24]和改善心肌血流灌注[15]的方法亦具有同樣的效應(yīng)。采用可溶性死亡受體或受體拮抗劑清除死亡因子，可減輕死亡受體介導(dǎo)的心肌細胞凋亡[1]。

采用抗凋亡基因Bcl-2產(chǎn)物和可溶性存活因子例如胰島素樣生長因子1（IGF1）能夠抑制缺血所致的細胞凋亡[25]。IGF1 過度表達可減少非梗死區(qū)細胞凋亡和促進梗死后有利的心肌重構(gòu)。細胞凋亡的執(zhí)行包括線粒體擴大和半胱天冬酶激活在內(nèi)的一系列信號途徑的活化。內(nèi)源性半胱天冬酶抑制劑能抑制缺血再灌注刺激所致的細胞凋亡。抑制半胱天冬酶的藥物亦可短期抑制心肌細胞凋亡的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，L-肉堿可抑制半胱天冬酶和降低TNFα，從而防止心肌細胞凋亡的發(fā)生[19]。

第7篇：細胞凋亡范文

關(guān)鍵詞：凋亡；中藥；綜述 

細胞凋亡(apoptosis)是一種細胞生理性死亡的形式，是多細胞有機體為保持身體組織穩(wěn)定、調(diào)控自身細胞增殖和死亡之間的平衡、由基因控制的細胞自動性死亡過程，在機體的生長發(fā)育、衰老、免疫調(diào)節(jié)、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定以及腫瘤、感染、自身免疫性疾病等生理病理過程中均有重要意義。機體通過凋亡過程來清除體內(nèi)不需要或有害細胞，或通過抗凋亡過程維持細胞功能。抑制凋亡在維護生命個體的穩(wěn)定、抗衰老等過程中有很重要的作用。近年來有關(guān)中藥抑制細胞凋亡的研究日漸增多，研究涉及缺氧、缺血等因素導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)、心腦血管、胃腸功能損傷的保護、腫瘤治療(放、化療)后骨髓、免疫功能損傷的防治等方面。中醫(yī)藥可對細胞凋亡過程的不同環(huán)節(jié)進行調(diào)節(jié)，進而抑制細胞凋亡，維持機體內(nèi)平衡，阻止組織病理過程的惡化。 

 

1 通過調(diào)控細胞凋亡途徑抑制凋亡 

機體內(nèi)存在多條細胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，其中內(nèi)源性的線粒體細胞色素C途徑和外源性的死亡受體途徑所介導(dǎo)細胞凋亡是目前研究較多的途徑。 

1．1 通過調(diào)控線粒體細胞色素C途徑抑制凋亡 許多研究結(jié)果均表明，線粒體在細胞凋亡過程中起著“主開關(guān)”作用，是最重要的途徑之一，其通過Cyt－C途徑誘導(dǎo)細胞凋亡。在細胞凋亡信號的刺激下，會使caspases激活，胞質(zhì)Ca2+水平升高，產(chǎn)生ceramide，諸如此類的改變會直接或間接地引發(fā)線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔道(PTP)開放，使能量產(chǎn)生中斷，線粒體內(nèi)膜跨膜電位(ψm)的下降，并導(dǎo)致外膜破裂，釋放出Cyt－C等各種活性蛋白，Cyt－C從線粒體內(nèi)釋放是關(guān)鍵的一步。胞漿內(nèi)的Cyt－C在dA7P存在下，與凋亡蛋白酶活化因子－1(Apaf－1)結(jié)合，誘導(dǎo)caspase－9前體的寡聚化，并形成凋亡體。凋亡體的形成可激活caspase－9，繼而活化Caspase－3，啟動Caspase的級聯(lián)反應(yīng)，引起細胞凋亡。 

有研究以缺氧／缺糖再給氧為模型，觀察清開靈注射液對神經(jīng)細胞線粒體膜電位的保護作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)清開靈注射液能顯著降低細胞內(nèi)Ca2+濃度，抑制細胞凋亡，提高線粒體膜電位和活性，認為清開靈注射液可抑制缺氧一缺糖再給氧損傷所致的線粒體膜電位的降低、抑制神經(jīng)細胞內(nèi)鈣超載與抑制細胞凋亡有關(guān)。 

1．2 通過調(diào)控死亡受體途徑抑制凋亡 凋亡還可以通過死亡受體通路介導(dǎo)，現(xiàn)知死亡受體途徑主要包括Fas／FasL途徑和TNFa／TNFR途徑。死亡受體家族成員包括7NFRl、TNFR2、Fas／CD95、TRAlL－Rs等，當(dāng)死亡受體與其相應(yīng)的配基(死亡配體)特異性結(jié)合后，將凋亡信號由胞外傳人胞內(nèi)，在連接分子的媒介下，激活Caspase，導(dǎo)致細胞凋亡。

    1．2．1 通過調(diào)控Fas／FasL途徑抑制凋亡 中藥可以通過調(diào)控Fas／FasL的表達，抑制受損細胞的凋亡。參附注射液對培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞缺氧及缺氧／復(fù)氧時凋亡相關(guān)基因Fas／FasL蛋白表達影響研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)果缺氧4.5h及10.5h后，心肌細胞Fas／FasL蛋白的陽性表達指數(shù)(positive expressionindex，PEI)參附注射液組明顯低于缺氧組；參附注射液可通過下調(diào)Fas／FasL蛋白表達，參附注射液組還見到caspase-3活性下降，提示參附注射液抑制乳鼠心肌細胞凋亡是通過Fas／FasL-caspase-3途徑實現(xiàn)的。

1．2．2 通過調(diào)控TNFa／TNFR途徑抑制凋亡 研究還發(fā)現(xiàn)中藥通過調(diào)控7NFa／TNFR途徑抑制細胞凋亡。枸杞多糖對老年大鼠T細胞過度凋亡及相關(guān)基因表達研究發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖可以下調(diào)促凋亡的TNFRl基因mRNA表達并上調(diào)抗凋亡的Bcl-2基因mRNA表達，降低老年大鼠T細胞的過度凋亡，從而改善老年大鼠T細胞過度凋亡的狀態(tài)。 

 

2 通過影響凋亡信號傳導(dǎo)抑制凋亡 

細胞抗凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是在內(nèi)外生存因子的刺激下，激活多種信號偶聯(lián)途徑的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。常見的凋亡信號傳導(dǎo)途徑有磷脂酰肌醇－3－激酶(P13K)／蛋白激酶B(PKB或稱為AKT)途徑，RAS－MAPK途徑，NF－κB途徑，N()途徑等。

    2．1 P13K／PKB途徑 P13K是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，PKB是P13K的靶蛋白之一，P13K與PKB是促進凋亡作用的重要調(diào)節(jié)因子；其過量表達可抑制細胞的凋亡。黃芪多糖(APS)對2型糖尿病大鼠腎組織胰島素信號分子表達的研究發(fā)現(xiàn)，認為黃芪多糖降低2型糖尿病大鼠血糖水平的機制可能與提高糖尿病大鼠腎組織中胰島素受體(InsR)、胰島素受體底物－1(IRS－1)、P13K水平，增加組織對胰島素的敏感性，改善胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。 

第8篇：細胞凋亡范文

【關(guān)鍵詞】 短發(fā)夾RNA；干預(yù)治療；磷酸二酯酶5；心肌細胞

doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2013.06.035 文章編號：1004-7484（2013）-06-2893-02

病理性細胞凋亡是心肌細胞喪失的形式之一，是心血管疾病發(fā)生和發(fā)展的基礎(chǔ)[1]。心肌細胞凋亡既是心肌細胞損傷的一種反應(yīng)，同時又是心功能受損的一個重要參與因素。因此，減少心肌細胞凋亡，可能會減輕心室重構(gòu)，減輕心肌纖維化，改善心臟功能，抗細胞凋亡成為心力衰竭生物治療的一個新方向。越來越多的證據(jù)表明PDE5與心血管系統(tǒng)疾病有密切的關(guān)系。最近研究表明PDE5在晚期心力衰竭患者心肌中表達增加，并且會加重心衰患者的心室重構(gòu)，可能是由于cGMP/PKG信號的下降，加劇心功能惡化[2]。RNA干擾是近年發(fā)現(xiàn)的一種由雙鏈RNA引發(fā)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機制，能特異性地抑制靶基因的表達，具有快速、高效、容易操作、序列特異性強等優(yōu)點[3-4]。本實驗通過構(gòu)建磷酸二酯酶5的短發(fā)夾RNA重組腺病毒載體（PDE5 shRNA），研究其對缺氧缺糖條件下乳鼠心肌細胞的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物新生C57BL/6J小鼠購自大連醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，許可證號：SCXK（遼）2008-0002），用于乳鼠心肌細胞的培養(yǎng)。

藥品與試劑DMEM培養(yǎng)基、FBS購自美國Sigma公司，TUNEL試劑盒購自Promega公司，cGMP、PKG試劑盒購自美國SantaCruz公司。

1.2 方法 shRNA重組腺病毒載體構(gòu)建我們根據(jù)鼠的PDE5A序列設(shè)計PDE5短發(fā)卡RNA，兩個互補PDE5的寡核苷酸序列是：SENSE 5`-GATCCGGAGC AGCAGTCATT GGAAGTCGAA ACTTCCAATG ACTGCTGCTC CTTTTTTG-3` and ANTISENSE 5`-AATTCAAAAA AGGAGCAGCA GTCATTGGAA GTTTCGACTT CCAATGACTG CTGCTCCG-3`.根據(jù)鼠PDE5序列設(shè)計并合成shRNA寡核苷酸片段，退火形成雙鏈并克隆進入載體pSIREN-DNR-DsRed-Express Vector，獲得鼠PDE5的shRNA表達載體質(zhì)粒（pSIREN-DNR-PDE5-shRNA-DsRed）。然后將供體注入到骨架腺病毒pLP-Adeno-X LP CMV，獲得pLP-Adeno-PDE5 shRNA，沒有插入shRNA的普通腺病毒載體作為對照組（Null），然后將攜帶有PDE5 shRNA的腺病毒載體（shPDE5）和普通的腺病毒載體（Null）分別轉(zhuǎn)染HEK 293細胞，放在DMEM和10% FBS混合培養(yǎng)液中培養(yǎng)，通過HEK293細胞擴增病毒，并經(jīng)離心、提取、純化制備高滴度重組腺病毒載體。

準(zhǔn)備和培養(yǎng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的心肌細胞按照文獻[6]從一日齡C57BL/6J小鼠提取心肌細胞，在含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)液中37°C培養(yǎng)24小時，進行心肌細胞的鑒定。

分組及給藥分為實驗組和對照組，實驗組（shPDE5）用濃度1X106個/ml的PDE5shRNA腺病毒轉(zhuǎn)染心肌細胞，對照組（Null）轉(zhuǎn)染等量未攜帶PDE5shRNA的腺病毒載體（Null），在正常條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)16小時候在激光共聚焦顯微鏡下觀察鑒定。

1.3 原位末端標(biāo)記分析（TUNEL） 正常培養(yǎng)的心肌細胞，用缺糖Hanks液代替正常培養(yǎng)基，放在37°C飽含95%N2/5%CO2密閉容器中培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)8小時之后，利用原位末端標(biāo)記分析對各組心肌細胞進行細胞凋亡檢測。

1.4 統(tǒng)計分析 用SPSSl7.0進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，均數(shù)比較用單因素方差分析（one―wayANOVA），P

2 結(jié) 果

2.1 PDE5shRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)鑒定 經(jīng)PDE5 shRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)16小時以后，實驗組大多數(shù)細胞在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)紅色，證明PDE5 shRNA腺病毒載體轉(zhuǎn)到心肌細胞是成功的（圖1）。

2.2 TUNEL陽性檢測 細胞在缺氧缺糖條件下培養(yǎng)8小時后進行TUNEL分析顯示，實驗組的心肌細胞在缺氧缺糖條件下能夠耐受細胞損傷，而對照組細胞對細胞損傷很敏感，細胞在缺氧缺糖條件下培養(yǎng)8小時之后，與實驗組比較，對照組TUNEL陽性心肌細胞明顯增加（圖2）。

3 討 論

RNA干擾是指當(dāng)細胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA（double stranded RNA，dsRNA）時，通過dsRNA介導(dǎo)特異性的使內(nèi)源性mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達沉默的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，又稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默[6-7]。由RNAi現(xiàn)象產(chǎn)生的RNAi技術(shù)可以特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達，該技術(shù)已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領(lǐng)域。

本研究發(fā)現(xiàn)，利用靶目標(biāo)PDE5的短發(fā)夾RNA（PDE5 shRNA）對缺氧缺糖條件下心肌細胞干預(yù)治療，通過抑制PDE5的表達明顯拮抗缺氧缺糖誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡。這些觀察結(jié)果與早先的報道一致，即PDE5抑制劑西地那非可以拮抗心肌局部缺血引起的心肌細胞凋亡[8]，有研究者提出，cGMP/PKG信號通路在PDE5抑制劑抗心肌細胞凋亡方面起到非常重要的作用[9-10]，本實驗結(jié)果證明，經(jīng)過PDE5 shRNA 干預(yù)，細胞凋亡明顯減輕，這些都高度提示cGMP/PKG信號通路在減少細胞凋亡方面起到核心作用。

總之，PDE5 shRNA明顯拮抗缺氧缺糖誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡，通過持續(xù)抑制心肌細胞PDE5基因表達對缺氧缺糖條件下心肌細胞發(fā)揮顯著的保護作用。

參考文獻

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[2] Pokreisz P，Vandenwijngaert S，Bito V，et al.Ventricular phosphodiesterase-5 expression is increased in patients with advanced heart failure and contributes to adverse ventricular remodeling after myocardial infarction in mice[J].Circulation，2009，（119）：408-416.

[3] Bernstein E，Caudy AA，Hammond SM，et al.Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference[J].Nature，2001，409（6818）：363-366.

[4] Nishikura K.A short primer on RNAi：RNA-directed RNA polymerase acts as a key catalyst[J].Cell，2001，107（4）：415-418.

[5] Wang L，F(xiàn)eng ZP，Kondo CS，et al.Developmental changes in the delayed rectifier K+ channels in mouse heart[J].Circ Res，1996，（79）：79-85.

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[8] Das A，Xi L，Kukreja RC.Phosphodiesterase-5 inhibitor sildenafil preconditionscardiac myocytes against necrosis and apoptosis.Essential role of nitric oxide signaling[J].J Biol Chem，2005，（280）：12944-12955.

第9篇：細胞凋亡范文

【關(guān)鍵詞】 舒林酸；胃癌細胞；細胞凋亡；環(huán)氧化酶2；凋亡相關(guān)基因

0 引言

流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)常服用非甾體類抗炎藥（NSAIDs）者，其結(jié)、直腸腫瘤的發(fā)病率下降將近50% [1]。動物實驗研究表明NSAIDs對許多動物誘發(fā)性腫瘤如結(jié)腸癌、膀胱癌有明顯的化學(xué)預(yù)防作用 [2，3]，臨床上非甾體類抗炎藥舒林酸可使家族性腺瘤肉病患者的腸道息肉消退 [1]。對于胃癌，這方面的研究較少，其作用機制也不清楚。本實驗將舒林酸設(shè)置不同的作用濃度和作用時間，于人胃癌細胞株BGC-823共培養(yǎng)，觀察舒林酸對胃癌細胞凋亡的調(diào)控作用，探討其作用機制。

1 材料與方法

將舒林酸作用于人胃癌BGC823細胞（購自中國科學(xué)院上海細胞生物學(xué)研究所；舒林酸購自Sigma公司）。設(shè)置3個實驗組，舒林酸濃度分別為0.6mmol/L、0.9mmol/L和1.2mmol/L，以不加藥為對照組，作用時間分別為24、48、72h。應(yīng)用流式細胞術(shù)、TUNE法檢測胃癌細胞的凋亡率（200倍光鏡下每張爬片隨機計數(shù)1 000個細胞，每組4張涂片共計數(shù)4 000個細胞，計數(shù)其中的陽性細胞數(shù)，計算陽性率。陽性率＝陽性細胞數(shù)/4 000×100％）；透射電鏡觀察胃癌細胞超微結(jié)構(gòu)改變；免疫組化SP法檢測凋亡相關(guān)基因蛋白bcl2、survivin的表達以及環(huán)氧化酶2（COX2）蛋白的表達（鼠抗人COX2、bcl2、survivin單克隆抗體、免疫組織化學(xué)SP試劑盒、TUNEL試劑盒，均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）。

2 結(jié)果

2.1 流式細胞儀檢出了凋亡峰（圖略），該峰隨著舒林酸作用濃度的增大而升高；隨作用時間的延長而升高。經(jīng)0.6mmol/L、0.9mmol/L、1.2mmol/L濃度舒林酸作用24h后，凋亡細胞分別占8.7%、20.1%和36.7%，而對照組僅為1.9%；作用48h后，凋亡細胞分別上升至19.8%、35.6%和54.9%，對照組為2.8%。各藥物組與對照組比較有顯著性差異（P

轉(zhuǎn)貼于

2.2 TUNEL法檢測細胞凋亡率

隨著舒林酸濃度增大，細胞凋亡率增加。各實驗組與對照組比較以及實驗組之間比較均有顯著性差異（P

2.3 透射電鏡下，對照組BGC-823細胞體積較大，結(jié)構(gòu)完整，核形規(guī)整、核膜清晰，染色質(zhì)分布均勻。舒林酸作用組可見細胞皺縮、核質(zhì)比例減小，核仁不清晰，染色質(zhì)聚集于核膜下呈塊狀或新月狀（圖略），并見到細胞質(zhì)膜包被的凋亡小體（圖略）。

2.4 免疫組化檢測凋亡相關(guān)基因蛋白bcl2、survivin表達和COX2蛋白表達，結(jié)果顯示胃癌細胞的bcl2蛋白和survivin蛋白表達下降，COX2蛋白的表達陽性率也低于對照組，以上結(jié)果均呈時間和劑量依賴性(P

3 討論

本實驗應(yīng)用FCM，在不同濃度舒林酸作用24、48h后，各實驗組均檢測到凋亡峰，且細胞凋亡率顯著高于對照組（P

【參考文獻】

［1］Sandler RS， Glanko JC， Murray SC， et al. Aspirin and non steroidal antiinflammatory agents and risk for colorectal adenomas [J]. Castroenerology， 1998，114(30)：441447.