氧化應(yīng)激在糖尿病性角膜病變中研究

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摘要：據(jù)統(tǒng)計，目前約有46%～64%的糖尿病患者罹患糖尿病性角膜病變。隨著糖尿病患病率的日益攀升，糖尿病性角膜病變逐漸受到眼科醫(yī)生的重視，但其發(fā)病機制尚未明確。氧化應(yīng)激是機體內(nèi)活性氧和活性氮產(chǎn)生過多，從而損害機體組織細胞的一種病理過程，其參與眾多疾病的發(fā)生發(fā)展，在糖尿病眼部并發(fā)癥中亦扮演重要角色。本文回顧氧化應(yīng)激在糖尿病性角膜病變發(fā)病機制以及治療中的研究進展，希望對臨床診療有所助益。

關(guān)鍵詞:糖尿病性角膜病變;氧化應(yīng)激;發(fā)病機制;研究進展

0引言

根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟(IDF)的最新統(tǒng)計，全球現(xiàn)有約4．64億糖尿病(diabetesmellitus，DM)患者，患病人數(shù)約占全球成年人口的9．3%，其中中國約有1．164億患者，數(shù)量位居世界第一［1］。以糖尿病視網(wǎng)膜病變、并發(fā)性白內(nèi)障、糖尿病性角膜病變(diabetickeratopathy，DK)為代表的DM眼部并發(fā)癥嚴(yán)重影響患者視力，降低患者生活水平，是眼科醫(yī)生一直較為關(guān)注的領(lǐng)域。氧化應(yīng)激(oxidativestress，OS)是指細胞內(nèi)促氧化和抗氧化平衡失調(diào)，導(dǎo)致氧化作用增強的一種氧化還原狀態(tài)，它參與眾多疾病的發(fā)生發(fā)展。OS在DM眼部并發(fā)癥的作用既往已有較多研究，但主要集中在糖尿病視網(wǎng)膜病變，隨著DK發(fā)病率上升日益受到重視，OS反應(yīng)在DK中的作用愈顯重要，本文對此項研究進行綜述。

1DK的病理表現(xiàn)和發(fā)病機制

DK一般表現(xiàn)為眼部外傷或術(shù)后持續(xù)性角膜上皮缺損、愈合延遲、淺層點狀角膜炎，逐步發(fā)展為角膜潰瘍［2］，而這些體征均源于高糖對角膜各層組織細胞的損害。其病理表現(xiàn)主要包括［3－4］:(1)上皮細胞增殖和遷移受到影響，細胞間的黏附下降;(2)上皮基底膜增厚，其間的半橋粒數(shù)目減少伴有晚期糖基化終末產(chǎn)物(advancedglycationendproducts，AGEs)的沉積;(3)角膜基質(zhì)中的錨原纖維組織減少，導(dǎo)致其與基底膜之間的連結(jié)變松;(4)角膜內(nèi)皮細胞密度降低，形態(tài)異常;(5)角膜基底神經(jīng)叢纖維長度變短、纖維密度以及分支數(shù)量均減少。DK的發(fā)病機制主要包括三大類:(1)糖基化終末產(chǎn)物的沉積;(2)有關(guān)上皮修復(fù)信號通路活化的抑制;(3)氧化應(yīng)激反應(yīng)。這三類分子機制并非獨立參與DK的發(fā)生，而是共同作用進而導(dǎo)致細胞凋亡、細胞壞死、激發(fā)炎癥反應(yīng)，最終損害角膜。

2OS與DM

OS是指活性氧(reactiveoxygenspecices，ROS)和活性氮(reactivenitrogenspecices，RNS)的產(chǎn)生與機體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的清除相失衡，造成ROS和RNS過多，進而對機體組織細胞產(chǎn)生損害。有研究證明［5］免疫細胞在病原體防御中發(fā)揮吞噬作用時，ROS起著至關(guān)重要的作用，這說明輕度OS對機體新陳代謝有積極影響，產(chǎn)生了一定的保護作用。然而ROS、RNS的產(chǎn)生與機體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的清除平衡一旦被打破，過量的ROS不僅會損傷組織細胞的核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子，還會引起機體代謝途徑異常，導(dǎo)致一系列疾病的發(fā)生。既往研究表明［6－7］，OS與癌癥、帕金森病、阿爾茨海默癥、動脈粥樣硬化、心力衰竭等多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，同時也在DM相關(guān)并發(fā)癥中起重要作用。DM患者血液中持續(xù)的高血糖水平會通過增加線粒體氧耗量損傷線粒體功能，導(dǎo)致線粒體功能障礙，還因激活NADH/NADPH氧化酶從而上調(diào)ROS水平，同時增強一氧化氮合酶(NOS)活性導(dǎo)致一氧化碳(NO)合成增加以及抗氧化劑(例如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽和多種維生素)表達降低，進而導(dǎo)致機體組織細胞氧化還原狀態(tài)失衡［8－11］。

3OS與DK

DK的發(fā)病是一個復(fù)雜的過程，而OS貫穿其中。慢性的高糖狀態(tài)會從多個方面影響角膜組織細胞包括角膜神經(jīng)的正常生理狀態(tài)。例如AGEs的沉積、炎性反應(yīng)激活、線粒體功能障礙等，然而這多個途徑最終匯集于一點及ROS/RNS的增多及OS反應(yīng)，OS會引起脂質(zhì)過氧化、蛋白修飾、DNA損傷進而導(dǎo)致細胞凋亡、壞死、角膜神經(jīng)節(jié)段性脫髓鞘、軸突變性、角膜神經(jīng)功能障礙最終引起DK［12］。下文將分述OS如何與DK發(fā)病機制中的各重要物質(zhì)相互作用。

3．1OS與AGEs

在DK中的相互作用AGEs是一組在蛋白質(zhì)、脂肪酸或核酸的氨基基團與還原糖的醛基之間發(fā)生非酶性糖基化反應(yīng)(又稱Maillard反應(yīng))所形成的一系列具有高度活性終產(chǎn)物的總稱，其結(jié)構(gòu)具有高度異質(zhì)性，最早由Maillard于1912年發(fā)現(xiàn)［13］。糖尿病患者在長期高糖狀態(tài)下體內(nèi)合成過量AGEs蓄積在角膜各層，通過與糖基化終末受體(receptorforadvancedglycationendproducts，RAEG)的相互作用激活NADPH氧化酶，導(dǎo)致氧自由基的形成影響下游多條代謝通路，同時過量的ROS產(chǎn)生誘導(dǎo)RAGE表達，從而啟動正反饋循環(huán)，加劇氧化應(yīng)激和炎癥的惡性循環(huán)［14］。AGEs與RAGE結(jié)合還導(dǎo)致MAPK、JAK/STAT等信號通路的激活，增加單核細胞趨化蛋白－1(monocytechemotacticprotein－1，MCP－1)、白細胞介素－6(interleukin－6，IL－6)、腫瘤壞死因子－α(tumornecrosisfactor，TNF－α)和血管細胞黏附分子－1(vascularcelladhesionmolecule－1，VCAM－1)的表達，引起炎性反應(yīng)。RAGE的激活也可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細胞凋亡［15－17］。有研究表明，通過抑制AGEs可以降低OS反應(yīng)，對組織起到保護作用。Kim等［18］團隊將一種四味草藥提取物制成的藥物KIOM－79通過口服用于2型糖尿病大鼠模型，13wk后發(fā)現(xiàn)實驗組小鼠角膜厚度和細胞凋亡程度明顯低于對照組，且各層角膜組織AGEs的積累減少。此外，通過對相關(guān)標(biāo)記物的檢測，其團隊還發(fā)現(xiàn)KIOM－79減弱了角膜中的氧化性DNA損傷、NF－κB激活和Bax過表達，說明其通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)對角膜起到了保護性作用。大量報道顯示［19］，許多類型的天然化合物，如多酚、多糖、萜類、維生素和生物堿，都是抑制AGEs形成的良好候選者。這些化合物通過清除自由基、螯合金屬離子、捕獲活性羰基化合物、覆蓋蛋白質(zhì)的糖化位點和降低血糖水平來阻止AGEs的形成。

3．2OS與沉默信息調(diào)節(jié)因子

1在DK間的相互作用沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)是一種具有代表性的組蛋白脫乙酰酶，作為Sirtuin蛋白家族的一員，其酶活性依賴于NAD+作為輔助因子。SIRT1通過組蛋白修飾控制基因表達、DNA修復(fù)、代謝、氧化應(yīng)激反應(yīng)、線粒體功能等來調(diào)節(jié)多種細胞活動［20］。SIRT1調(diào)控氧化應(yīng)激的機制主要包括:(1)通過去乙?；せ钸^氧化物增殖子激活－受體因子γ輔激活因子(peroxisomeproliferator－activatedreceptorcoactivator－1，PGC－1α)的基因轉(zhuǎn)錄，并通過調(diào)節(jié)核受體過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)、核呼吸因子(NRF)和線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(TFAM)等基因的轉(zhuǎn)錄，參與調(diào)節(jié)線粒體功能［21］以及葡萄糖和脂質(zhì)的代謝［22］。(2)SIRT1調(diào)節(jié)抗氧化劑如超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶的表達［23］。此外，由于線粒體功能障礙會導(dǎo)致細胞凋亡，SIRT1可以通過介導(dǎo)PGC－1α的乙?；苯诱{(diào)節(jié)細胞凋亡過程［24］。SIRT1還通過調(diào)控NF－κBp65的乙酰化水平控制炎癥反應(yīng)，同時調(diào)控炎癥因子相關(guān)基因的表達:如白細胞介素(IL)－1、腫瘤壞死因子α(TNF－α)、IL－8、IL－6等［21－22，25］。近年來，關(guān)于SIRT1對DK作用機制的研究逐漸增多，且OS是不可或缺的一環(huán)。Wei等［26］研究發(fā)現(xiàn)在1型DM小鼠模型中，SIRT1的下調(diào)可促進ROS的產(chǎn)生、抑制角膜上皮細胞活性促進細胞凋亡，可望通過調(diào)節(jié)SIRT1的表達影響細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激進而起到對DK的保護作用;Liu等［27］通過建立DM相關(guān)干眼小鼠模型觀察到相對于普通干眼對照組，OS反應(yīng)顯著增強伴SIRT1表達下降;Li等［28］發(fā)現(xiàn)NAD+含量和NAMPT表達在1型DM小鼠和2型DM患者中均下降，細胞實驗證明體外補充NAD+可恢復(fù)角膜上皮細胞增殖和遷移的能力，此外，在DM小鼠中，NAD+及其前體煙酰胺單核苷酸(nicotinamidemononucleotide，NMN)和煙酰胺核糖苷(nicotinamideriboside，NR)也促進角膜上皮和神經(jīng)再生，同時還伴有SIRT1、磷酸化的上皮生長因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)以及AKT和ERK1/2的表達增加。

3．3OS與炎性反應(yīng)在DK中的相互作用

炎癥是機體對病原體入侵、組織損傷和刺激物等各種病理過程的重要生理反應(yīng)。慢性炎癥主要通過自由基的持續(xù)和過量產(chǎn)生以及抗氧化劑的消耗導(dǎo)致細胞損傷［29］。ROS可以刺激核因子－κB(NF－κB)和激活蛋白－1(AP－1)等轉(zhuǎn)錄因子，增加促炎細胞因子的表達。因此，有理由認為靶向氧化應(yīng)激－炎癥細胞因子信號通路可能是治療糖尿病并發(fā)癥的潛在策略［30］。人高遷移率族蛋白B1(high－mobilitygroupbox1protein，HMGB1)是一種在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起重要作用的非組蛋白核蛋白［31］，HMGB1是介導(dǎo)糖尿病并發(fā)癥一關(guān)鍵的炎癥介質(zhì)。它通過與晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptorforadvancedglycationendproducts，RAGE)、Toll樣受體(TLR2和TLR4)結(jié)合激活NF－κB，進而導(dǎo)致促炎因子、黏附分子和血管生成因子的上調(diào)。Hou等［32］研究表明，HMGB1及其相關(guān)受體與DK的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示RAGE和TLR4(HMGB1受體)以及HMGB1相關(guān)信號通路也可能參與糖尿病角膜傷口和神經(jīng)愈合。促炎性HMGB1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑主要通過其兩個受體TLR和RAGE進行轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終增加NF－κB的活化和促炎性細胞因子的產(chǎn)生，包括TNF－α，IL－1β和IL－6。NF－κB的激活和促炎細胞因子的產(chǎn)生反過來又可以誘導(dǎo)HMGB1及其受體的表達，從而導(dǎo)致過度和持續(xù)的炎癥反應(yīng)正反饋循環(huán)。給予外源性HMGB1肽可以明顯抑制糖尿病眼損傷后角膜上皮/角膜神經(jīng)的恢復(fù)，而甘草酸二鉀(dipotassiumglycyrrhizinate，DG)(HMGB1抑制劑)治療可以顯著加速這種恢復(fù)過程。HMGB1的兩個受體RAGE和TLR4也被發(fā)現(xiàn)參與糖尿病患者角膜上皮/角膜神經(jīng)愈合過程。這些結(jié)果表明HMGB1信號通路在DK的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，有望通過對HMGB1的抑制調(diào)控炎癥反應(yīng)進而治療DK并促進角膜神經(jīng)修復(fù)。

3．4OS與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

在DK中的相互作用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)是一種專職于蛋白質(zhì)折疊和運輸?shù)募毎?，對細胞?nèi)穩(wěn)態(tài)和細胞外刺激的變化高度敏感。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmicreticulumstress，ERS)主要是由ROS積累、毒性物質(zhì)、基因突變等引起應(yīng)激反應(yīng)，其應(yīng)激原主要來自細胞內(nèi)部環(huán)境改變，包括蛋白錯誤折疊、鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)、未折疊蛋白聚集等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂［33］。研究發(fā)現(xiàn)ERS和OS存在相互作用:OS可誘導(dǎo)ERS，相反ERS也可以促進細胞內(nèi)ROS生成。正常狀態(tài)下，細胞內(nèi)部分ROS來源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的氧化蛋白折疊過程中二硫鍵的形成，該過程中蛋白二硫化異構(gòu)酶(proteindisulphideisomerase，PDI)通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化酶1α(endoplasmicreticulumoxidase，ERO1α)轉(zhuǎn)移電子給分子氧，相繼生成了副產(chǎn)物過氧化氫［34］。高糖狀態(tài)可誘發(fā)ERS，上調(diào)的PDI和ERO1α可導(dǎo)致大量過氧化氫形成，同時細胞代償功能有限，生成的還原性谷胱甘肽不足以中和超量的過氧化氫，繼而引起OS損傷。伴隨著細胞內(nèi)線粒體裂解和鈣超載，ERO1α介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子的釋放，亦可引起線粒體超氧化物的生成［35－36］。Wang等［37］的研究發(fā)現(xiàn)，中腦星形膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(MANF)在小鼠和人的角膜廣泛存在，其促進糖尿病患者角膜上皮修復(fù)和神經(jīng)再生。主要機制是通過調(diào)控Akt信號通路抑制了高糖環(huán)境所致的細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及ERS介導(dǎo)的細胞凋亡，MANF有望在改善DK患者角膜上皮延遲愈合和神經(jīng)損傷再生中扮演重要角色。

4DK氧化應(yīng)激的治療

4．1甘草酸

甘草酸(glycyrrhizin，GLY)是一種從甘草根中提取的皂苷類物質(zhì)，具有抗炎等多種藥理作用，其已被證明對敗血癥、結(jié)腸炎腦損傷、角膜炎的動物模型有效［38－40］，在臨床上已被用于治療慢性肝炎患者。Somayajulu等［41］將GLY作用于高糖培養(yǎng)的小鼠角膜上皮細胞，發(fā)現(xiàn)其具有一定的保護作用，且降低了促炎癥反應(yīng)和OS標(biāo)志物如HMGB1、IL－1b、TLR2、TLR4、NOD樣受體蛋白3炎癥小體(NOD－，LRR－andpyrindomain－containingprotein3，NLRP3)、環(huán)氧合酶－2(cyclooxygenase2，COX2)、超氧化物歧化酶－2(superoxidedismutase2，SOD2)血紅素氧合酶－1(hemeoxygenase－1，HO－1)、谷胱甘肽過氧化酶2(glutathioneperoxidase2，GPX2)的表達量。另外該團隊在糖尿病小鼠模型的飲水中給予GLY，發(fā)現(xiàn)與對照組相比除了上述標(biāo)志物，C－X－C型趨化因子配體2(C－X－Cmotifchemokineligand2，CXCL2)和誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(induciblenitricoxidesynthase，iNOS)表達也下降，這進一步說明GLY對高糖所致的OS具有保護作用。

4．2色素上皮衍生因子

色素上皮衍生因子(PEDF)主要由視網(wǎng)膜色素上皮合成，是一種50kDa的分泌蛋白，屬于非抑制性絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族的一員［42］。它也存在于角膜、結(jié)膜和睫狀體上皮細胞、穆勒神經(jīng)膠質(zhì)細胞、視網(wǎng)膜星形膠質(zhì)細胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞［43］。大量研究證明PEDF可以降低RAGE的表達并發(fā)揮抗氧化作用，Liu等［44］選取6周齡小鼠注射STZ建立1型DM小鼠模型，并給予50nmol/L量的PEDF滴眼每日3次，持續(xù)8wk后發(fā)現(xiàn)與給予人工淚液的DM對照組小鼠對比，其角膜上皮染色評分降低且淚液分泌量和角膜敏感性均有顯著提高。進一步對小鼠角膜行組織學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)PEDF可減少DM小鼠角膜中ROS的累積、降低RAGE的表達以及增加抗氧化劑SOD1的表達，說明PEDF對DM所致的眼表損傷具有保護作用。

4．3α－硫辛酸

α－硫辛酸(alpha－lipoicacid，ALA)是一種天然存在的低分子量(206．32g/mol)二硫醇微量營養(yǎng)素，作為與線粒體代謝相關(guān)的生物能酶活性的輔助因子，它參與體內(nèi)的物質(zhì)代謝中的?；D(zhuǎn)移，能消除導(dǎo)致加速老化與致病的自由基。ALA的潛在抗氧化作用可歸因于直接活性氧(ROS)清除能力、金屬離子螯合能力和恢復(fù)細胞抗氧化劑的能力，如還原谷胱甘肽(GSH)、輔酶Q、維生素C和E水平。研究證明［45－47］ALA具有抗氧化的生物活性，對心血管疾病、炎癥、衰老和阿爾茨海默病認知功能障礙具有保護作用，因而其藥理機制受到關(guān)注。另外關(guān)于ALA的大多數(shù)臨床研究顯示了其在減輕DM患者的OS、神經(jīng)病變和神經(jīng)病變相關(guān)疼痛和感覺異常方面也具有較強潛力［48］。

5展望

OS參與眾多疾病的發(fā)生發(fā)展，其重要性體現(xiàn)在連接包括異常代謝、炎癥反應(yīng)以及ERS等多種發(fā)病機制。目前OS在DM眼部并發(fā)癥的研究主要集中在糖尿病視網(wǎng)膜病變，在DK中的研究尚有不足，且多局限于角膜上皮損傷修復(fù)，未來OS在DK的發(fā)病機制中的作用有待進一步研究。

作者:黃鈺清 楊燕寧 單位:武漢大學(xué)人民醫(yī)院眼科中心