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關(guān)鍵詞:飲料 微生物檢驗 質(zhì)量控制
近年來,隨著我國市場經(jīng)濟的飛速發(fā)展,飲料行業(yè)也取得突飛猛進的發(fā)展,各種營養(yǎng)飲料、保健飲料以及各色礦泉水、純凈水等的市場占有率在迅速提高,飲品正成為人們生活中的必需品,飲料質(zhì)量的問題也接著隨之而來。其質(zhì)量好壞關(guān)系廣大消費者的身體健康。飲料微生物檢驗是飲品安全監(jiān)測的重要組成部分,我們必須對影響檢驗結(jié)果的諸多因素采取控制手段保證檢驗結(jié)果的正確性,不斷提高飲品微生物檢驗的質(zhì)量。
一、檢驗人員素質(zhì)的控制
飲料中微生物檢驗工作不可能完全由全自動鑒定儀器完成,還需要具有專業(yè)知識和豐富經(jīng)驗的檢驗工作人員通過主觀分析和判斷,才能得出較為客觀的結(jié)論,這就要求微生物檢驗人員除具備嚴(yán)肅認(rèn)真的工作態(tài)度、精密細(xì)致的觀察和操作習(xí)慣以外,還必須熟練掌握微生物學(xué)檢驗技術(shù)和豐富的實踐經(jīng)驗。
(一)檢驗人員需進行崗前培訓(xùn)
微生物檢驗人員不但要主動學(xué)習(xí)、接受培訓(xùn)、認(rèn)真聽講座,學(xué)習(xí)新技術(shù),掌握國家食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗方法、標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)法律法規(guī),而且還要直接參與編寫測試程序及儀器的操作程序,學(xué)習(xí)質(zhì)量保證體系知識和計量學(xué)基本知識,以提高自身的檢測水平和分析問題、解決問題的能力
(二)注重職業(yè)操守
飲品已經(jīng)成為人們生活的必需品,飲品質(zhì)量的把關(guān)者,微生物檢驗人員的責(zé)任重大,如何讓你們放心享用各色飲品,微生物檢驗人員第一要做的就是利用自身的專業(yè)知識準(zhǔn)確檢驗飲品微生物含量,是否達到國家標(biāo)準(zhǔn),第二要做的就是,恪守職業(yè)道德,嚴(yán)把檢驗關(guān),不為不法商販所利用,真正做到權(quán)為飲品質(zhì)量所用,讓人民放心。
二、實驗設(shè)備及實驗材料的質(zhì)量控制
(一)確保儀器設(shè)備的準(zhǔn)確性
在飲料微生物檢驗工作中,經(jīng)常會使用各種各樣的儀器設(shè)備,它們質(zhì)量的好壞將會直接影檢驗工作,對高壓滅菌器、干熱滅菌器、培養(yǎng)箱等儀器設(shè)備要確保其完好及準(zhǔn)確。
首先,保證高壓滅菌器隨時準(zhǔn)確使用。操作人員要懂得儀器的工作原理并遵操作規(guī)則使用,滅菌物品在放置時不要放得太過擁擠;大氣門排氣或減壓時要緩緩進行,切不可猛然調(diào)大或調(diào)小,以防容器內(nèi)的液體沖出瓶外;使用時要有必要的監(jiān)測指標(biāo),一般為121℃、15min;滅菌完畢,待壓力自然降至零時,再關(guān)閉電源,開蓋取出滅菌物。
其次,培養(yǎng)箱保持溫度恒定。注意箱內(nèi)不應(yīng)放入過熱或過冷的物品,取放物品時,應(yīng)隨手關(guān)閉箱門,以維持恒溫。如培養(yǎng)物灑到箱內(nèi),應(yīng)馬上清潔,并及時消毒。培養(yǎng)物不宜與培養(yǎng)箱最底層直接接觸,以免影響數(shù)據(jù)的真實性。為保持箱內(nèi)濕度恒定,可放入裝水得容器保持濕度。每天記錄溫度及濕度的變化,觀察培養(yǎng)箱內(nèi)溫度與設(shè)定溫度是否一致。對兩次記錄進行比對,及時校對儀器。
在實驗室內(nèi)需要使用的無菌器也應(yīng)該及時正確地實施滅菌,無菌器具和器皿一般有明顯標(biāo)識,以便與非無菌器具和器皿加以區(qū)別。
(二)嚴(yán)格選用培養(yǎng)基
飲料微生物檢驗一般用乳糖膽鹽培養(yǎng)基、四硫磺酸鈉增菌培養(yǎng)基或亞硒酸鹽胱氨酸增菌培養(yǎng)基等。必須有正規(guī)廠家生產(chǎn),產(chǎn)品質(zhì)量必須符合有關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),培養(yǎng)基平皿的制備商必須按照標(biāo)準(zhǔn)隨產(chǎn)品附上書面鑒定資料,實驗室應(yīng)將此鑒定書保存一定時期。實驗室自制培養(yǎng)基應(yīng)有質(zhì)量控制,包括制備數(shù)量、制備日期、有效日期及制備者名字,培養(yǎng)基顏色、均勻度、厚度、光潔度、溶血與否、有否過多氣泡、是否污染也必須檢查。
培養(yǎng)基的配制應(yīng)嚴(yán)格按照GB4789.28―89規(guī)定的方法進行操作,并做好原始記錄。為保證培養(yǎng)基質(zhì)量,在配制時應(yīng)注意:制備培養(yǎng)基必須在玻璃容器、搪瓷缸或鋁鍋中進行,如用銅、鐵器皿,會對微生物生長方可使用。配制培養(yǎng)基應(yīng)有培養(yǎng)基配制記錄。配制培養(yǎng)基一般有毒害作用;配制培養(yǎng)基時應(yīng)按檢驗項目規(guī)定的配方添加,不得隨意增減或更改培養(yǎng)基成分。此外,要用專用的角匙取藥品,避免交叉污染而影響檢驗結(jié)果;培養(yǎng)基配制最好用蒸餾水,因為蒸餾水不含有含氯等抗菌物質(zhì),更適宜待檢菌株的培養(yǎng)。配制培養(yǎng)基時應(yīng)測調(diào)pH值,不同的菌株各有自身的pH值,調(diào)試過程中也可以使用1M NaOH或1M HC1溶液進行調(diào)節(jié)。
三、飲料微生物檢驗過程的質(zhì)量控制
檢驗過程是保證檢驗質(zhì)量的重要關(guān)口。針對檢驗過程,我國衛(wèi)生、商檢等部門都制訂了一系列統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法,每個檢驗室根據(jù)這些統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)方法結(jié)合本室的具體條件,分別制定了檢驗工作程序和操作規(guī)范,對檢樣的采取、登記編號、記錄要求、檢驗規(guī)范、結(jié)果報告做了詳細(xì)的規(guī)定,保證工作正規(guī)化、標(biāo)準(zhǔn)化。
(一)規(guī)范采集、運送和保存標(biāo)本
在檢驗飲料微生物過程中,樣品的采集學(xué)問很大,首先,要具有代表性,抽樣方案與抽樣工作保持統(tǒng)一,樣品的數(shù)量應(yīng)滿足檢驗、復(fù)檢的需要。當(dāng)樣品送到檢驗室時檢驗人員根據(jù)送檢單要求的檢驗項目一一進行核對,驗收樣品的外觀、包裝狀態(tài)及樣品有無破損、流失、變質(zhì)、污染。
其次,必須按照無菌操作要求進行,穿專用的工作服、帽、口罩、拖鞋并應(yīng)放在無菌室緩沖間,工作前經(jīng)紫外線消毒后方可使用;進無菌室前用肥皂洗手,然后用75%乙醇棉球消毒后才可以進行檢驗工作。在采樣完成后及時準(zhǔn)確貼上標(biāo)簽,做好記錄。
再次,采集完成后的樣品,保存環(huán)境一般在0"C~5"C最為適宜,特殊樣品應(yīng)特殊保存,冷凍樣品應(yīng)保持冷凍狀態(tài),并及時送檢。要嚴(yán)格按照國家制定德爾標(biāo)準(zhǔn)方法與標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范進行檢驗,不可隨意的進行操作。
(二)準(zhǔn)確記錄實驗數(shù)據(jù)
檢驗檢測過程中及時準(zhǔn)確做好原始記錄,要如實反映檢驗中的重要操作和數(shù)據(jù)結(jié)果。每操作一步得出一組數(shù)據(jù),確認(rèn)后及時記錄,最后對原始數(shù)據(jù)進行整理,去除不必要的誤差,獲得準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。我們可以采取在檢驗報告中設(shè)置空白對照,發(fā)現(xiàn)檢驗操作環(huán)節(jié)中的問題及其原因,以便及時改進。最后在檢驗報告必須要經(jīng)過復(fù)查,消除一些不必要的誤差和低級所悟,但是不得涂改、偽造,需要對數(shù)據(jù)進行修改,需要報請主要負(fù)責(zé)人及有關(guān)人員簽字后,方可修改。
四、檢驗報告及結(jié)果質(zhì)量控制
對原始數(shù)據(jù)進行整理、合并、歸納后,用回歸分析法和方差分析法形成檢驗報告。檢驗報告是對上述檢驗工作的一個總結(jié),必須經(jīng)過規(guī)定的手續(xù)進行復(fù)查,照各類標(biāo)準(zhǔn)對食品衛(wèi)生的微生物學(xué)質(zhì)量進行全面準(zhǔn)確的評價和作出合理的解釋。有關(guān)人員簽字后,加蓋檢驗單位印章,以示生效。檢驗結(jié)果是需要公布的,所以要慎之又慎,這樣才使檢驗結(jié)果既有法律依據(jù)又有學(xué)術(shù)依據(jù)。
控制飲料微生物指標(biāo)主要有菌落總數(shù)、大腸菌群、致病菌及霉菌、酵母菌等,每種指標(biāo)檢測結(jié)果的影響因素的區(qū)別很大,這就給從事具體檢測工作帶來一定的挑戰(zhàn)性。既要對飲料微生物所處的物理因素、化學(xué)因素進行考慮,也要對其所處的生物因素進行通盤監(jiān)督,不良的環(huán)境條件會使微生物的生長受到抑制,甚至導(dǎo)致菌體的死亡。飲料微生物檢驗檢測要按照規(guī)定要求操作,這既是實驗的要求,也是對企業(yè)、對消費者負(fù)責(zé)的表現(xiàn)。
參考文獻
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[關(guān)鍵詞]微生物檢驗;抗菌藥物;規(guī)范化
[中圖分類號]R446.5
[文獻標(biāo)識碼]B
[文章編號]1006-1959(2009)07-0054-01
2004年8月由國家衛(wèi)生部等單位了《抗菌藥物臨床應(yīng)用指導(dǎo)原則》,明確規(guī)定診斷為細(xì)菌感染者,方有指征應(yīng)用抗菌藥物,盡早查明感染病原,根據(jù)病原種類及細(xì)菌耐藥敏感試驗結(jié)果選用抗菌藥物。今年3月25日《衛(wèi)生部辦公廳關(guān)于抗菌藥物臨床應(yīng)用管理有關(guān)問題的通知》公布實施。順應(yīng)合理使用抗菌藥物的需要,微生物實驗室的工作必須加強。
選擇微生物檢驗項目、標(biāo)本采集和運送方法直接影響標(biāo)本的檢驗質(zhì)量。對病原的檢出是確診感染性疾病的主要依據(jù)。標(biāo)本采集與處理不符合要求,則細(xì)菌培養(yǎng)的結(jié)果毫無意義,甚至使檢驗結(jié)果誤導(dǎo)臨床,延誤對患者的正確治療,會造成嚴(yán)重后果。微生物檢驗質(zhì)量控制的主要內(nèi)容之一,就是對標(biāo)本采集的規(guī)范化。對不同的標(biāo)本進行微生物培養(yǎng)及采集、運送應(yīng)嚴(yán)格按照醫(yī)政司頒布的操作規(guī)范進行。
目前從標(biāo)本采集到給臨床以明確的病原學(xué)診斷和抗生素敏感試驗結(jié)果費時較長,需要2~3d甚至更長,此時病人的病情已發(fā)生了變化,檢驗報告對于治療而言失去了一定的價值。為讓臨床醫(yī)師及時了解病原學(xué)檢驗情況,要建立微生物檢驗分級報告制度即先報告涂片染色結(jié)果,再依次報告培養(yǎng)、鑒定和藥敏結(jié)果以及耐藥菌的初篩、確認(rèn)結(jié)果[1]。臨床標(biāo)本直接涂片檢查對快速診斷或提示某些感染有實用價值,要作為臨床微生物實驗室檢驗常規(guī)步驟開展。病原菌的培養(yǎng)檢出,對于感染的確診,抗菌藥物的選用和治療效果有重要意義,結(jié)合臨床考慮有特殊病原的可能時(如厭氧菌、結(jié)核桿菌、真菌等),應(yīng)采用特殊培養(yǎng)基提高陽性率。血培養(yǎng)時如病人已接受抗菌藥物治療,培養(yǎng)基內(nèi)需加入抗生素吸附裝置。痰標(biāo)本接種3種培養(yǎng)基,即血、巧克力、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基。腹瀉病人腸道病原微生物的檢測,根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)腹瀉病綱要和我國衛(wèi)生部臨床檢驗中心有關(guān)操作規(guī)程進行。日常工作需設(shè)計合適的質(zhì)控頻率進行質(zhì)控。質(zhì)控菌株與常規(guī)標(biāo)本一起進行,不能為質(zhì)控菌株設(shè)計單獨操作程序,不能專人專做。質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株的特性發(fā)生改變時要及時更換,在做生化和免疫試驗時一定要設(shè)立陰、陽性對照。參加室間質(zhì)控評比,不斷提高技術(shù)水平。及時更新程序性文件,完善實驗室質(zhì)量保證體系。采用先進技術(shù),做好病原微生物快速檢測和鑒定工作。近年來,病原菌的檢測已向標(biāo)準(zhǔn)化、微量化和快速簡便方面發(fā)展,隨著現(xiàn)代分析技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,氣相色譜、單克隆抗體、核酸雜交、PCR擴增等技術(shù),已用于病原微生物的快速檢測和鑒定。
食品安全問題是整個社會的大問題,而微生物檢驗問題是食品安全問題中的重中之重,為了提高微生物檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性,就必須建立一套行之有效的質(zhì)量控制體系。關(guān)鍵控制點如下:
一、實驗室的建設(shè)和維護
微生物實驗室主要分為無菌實驗室、凈化實驗室、生物安全實驗室等,凈化實驗室應(yīng)采用封閉過濾除菌通風(fēng)形式,吊頂、隔墻、圍護全部采用彩鋼板,地面作環(huán)氧樹脂自流平處理,并設(shè)置非凈化區(qū)、更衣區(qū)、凈化區(qū)。凈化實驗室應(yīng)定期進行風(fēng)速監(jiān)測和及時更換過濾層罩,條件有限的實驗室可使用超凈工作臺;無菌實驗室應(yīng)配紫外線消毒裝置, 在使用前后都應(yīng)用紫外線燈照射消毒,并定期進行紫外線強度和空氣質(zhì)量監(jiān)測;生物安全實驗室除了正常管理、維護之外,要注意空氣過濾的質(zhì)量和工作人員的隔離防護。
二、 人員
保證實驗結(jié)果的質(zhì)量,首先應(yīng)重視檢驗人員的科學(xué)技術(shù)素質(zhì),為技術(shù)人員及時了解當(dāng)今的科技進步信息和掌握先進的實驗技術(shù)創(chuàng)造條件。衛(wèi)生檢驗人員應(yīng)具有較強的專業(yè)知識和技能,應(yīng)經(jīng)常參加專業(yè)技術(shù)培訓(xùn)交流,以豐富積累工作經(jīng)驗,提高衛(wèi)生檢驗的水平。而作為衛(wèi)生檢驗人員應(yīng)具有自我監(jiān)督和自我檢查的質(zhì)量控制指導(dǎo)思想.在人員的繼續(xù)教育方面,微檢人員需受過細(xì)菌學(xué)檢驗的專門基礎(chǔ)教育,并以細(xì)菌檢驗為專業(yè),具有嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)工作態(tài)度,及時了解和掌握衛(wèi)生檢驗領(lǐng)域新的進展和動態(tài),并須按照國家衛(wèi)生檢驗標(biāo)準(zhǔn)來進行操作。
三、培養(yǎng)基、試劑的配置及保存
培養(yǎng)基、試劑的購買,應(yīng)要求供貨商出具“三證”。培養(yǎng)基和試劑使用前首先通過外觀、批號、PH值、選擇性等進行初步評估, 應(yīng)檢查培養(yǎng)基和試劑是否合格,是否在保質(zhì)期內(nèi)。培養(yǎng)基和試劑的配制應(yīng)有記錄可查,培養(yǎng)基應(yīng)按照要求選擇合適的壓力和時間進行滅菌,并且應(yīng)有高壓滅菌效果的監(jiān)測記錄。配制的培養(yǎng)基和試劑應(yīng)進行無菌試驗,并有無菌試驗記錄,并根據(jù)檢驗微生物指標(biāo)不同,應(yīng)選擇不同的培養(yǎng)基和試劑?;A(chǔ)培養(yǎng)基不僅要求細(xì)菌能生長,還必須發(fā)育良好,并能使細(xì)菌充分表現(xiàn)出其典型特征;選擇性培養(yǎng)基按不同細(xì)菌的生長條件要求而選擇不同的培養(yǎng)基,此外還要選擇不同的陽性對照菌株做質(zhì)控,以檢驗培養(yǎng)基的質(zhì)量,如細(xì)菌生長、抑制、溶血特征;典型菌落形態(tài)、色素等質(zhì)量情況。配制和傾注培養(yǎng)基時,應(yīng)注意控制培養(yǎng)基的PH值,因為PH值對細(xì)菌的生長影響較大。制好的培養(yǎng)基還應(yīng)進行無菌試驗,即35℃孵育過夜,看是否有菌生長。不同培養(yǎng)基應(yīng)按不同培養(yǎng)要求,接種相應(yīng)菌種,按細(xì)菌的生長抑制、形態(tài)、色素、溶血環(huán)等特征,判斷培養(yǎng)基的質(zhì)量。培養(yǎng)基和試劑的貯存應(yīng)按照其說明的貯存條件來保存,不同批號的培養(yǎng)基和試劑不能混合使用。微生物實驗室應(yīng)配備微檢所需的所有試劑、診斷血清和標(biāo)準(zhǔn)菌株,試劑和診斷血清應(yīng)注意其有效期,并定期用標(biāo)準(zhǔn)菌株監(jiān)測其敏感性和特異性,而標(biāo)準(zhǔn)菌株應(yīng)注意妥善保存,專人保管,并做好菌種領(lǐng)取使用和銷毀的登記制度。各種細(xì)菌鑒定用生化培養(yǎng)基,在有效期,應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)菌株進行質(zhì)量檢驗。試劑如氧化酶、觸酶試劑,每天用前須以陽性菌株測試,革蘭氏染色液可用金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌作為質(zhì)控菌。
四、儀器設(shè)備
細(xì)菌實驗室使用的儀器設(shè)備主要有冰箱、培養(yǎng)箱、高壓滅菌器、凈化臺等。對于連續(xù)工作的儀器如冰箱、培養(yǎng)箱,每天都要對其進行溫度監(jiān)控和記錄并定期維護。高壓滅菌器應(yīng)對其壓力表定期進行檢定,在進行物品滅菌時,應(yīng)做高壓滅菌效果監(jiān)測,并且有監(jiān)測記錄。凈化臺應(yīng)定期檢測風(fēng)速, 要求至少每半年監(jiān)測一次風(fēng)速,若低于0.36~0.54m/s,則應(yīng)更換工作臺上方的高效過濾流罩。對于需要溯源的器具如溫度計,應(yīng)定期進行自校準(zhǔn)和檢定,因為控制溫度在整個細(xì)菌實驗中很重要的。
五、積極參加室間質(zhì)量評價活動
質(zhì)評是質(zhì)量保證體系的重要組成部分。質(zhì)量評價是對實驗室作水平和能力的綜合判斷,也是對實驗室內(nèi)質(zhì)量控制效果的檢驗。因此,除了做好室內(nèi)質(zhì)控的同時,應(yīng)盡可能參加范圍更廣泛的室間質(zhì)評活動,以提高衛(wèi)生檢驗人員的檢驗水平和檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。
六、建立一套完整的質(zhì)量保證體系
1.樣品的管理:樣品應(yīng)正確采樣,并有充分的代表性,嚴(yán)格按照無菌操作要求采樣,且送檢樣品的標(biāo)志應(yīng)是唯一性,同時要做好樣品的交接登記保存及處置等工作。送檢樣品盡快檢驗,避免樣品保存時污染、腐敗變質(zhì),影響檢驗結(jié)果準(zhǔn)確性。2.檢驗方法 :微生物檢驗應(yīng)按國家衛(wèi)生檢驗標(biāo)準(zhǔn)方法或其他實驗室認(rèn)可方法進行。3.檢驗過程:檢驗過程中應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作規(guī)程,每個樣本要做空白對照和平行樣,以保證微生物檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可比性。4.報告制度:每張報告應(yīng)有檢驗者、審核者、簽發(fā)者的簽名,并附有檢驗原始記錄,以盡量避免錯誤的檢驗報告,保證結(jié)果的可靠性和可溯源性。5.完善實驗室管理:建立實驗室內(nèi)審制度,及時更新程序文件,以不斷提高衛(wèi)生檢驗管理水平,完善實驗室質(zhì)量體系。
七、 實驗室的環(huán)境
【關(guān)鍵詞】細(xì)菌 真菌 放線菌 羊草
【中圖分類號】G31 【文獻標(biāo)識碼】A 【文章編號】2095-3089(2012)02-0087-02
羊草為禾本科賴草屬植物,又名堿草。它是歐亞大陸草原區(qū)東部的重要建群種。羊草是多年生根莖型禾草,對不同生境表現(xiàn)出較強的適應(yīng)性,對改善我國北方草原生態(tài)環(huán)境和鹽漬化土地治理具有重大意義。同時,羊草是一種重要的牧草資源,蛋白質(zhì)含量高,適口性好,耐踐踏,在發(fā)展草原畜牧業(yè)方面具有現(xiàn)實的經(jīng)濟和社會意義[1]。羊草作為草原主要牧草資源以及收割干草的重要飼草,是我國東北松嫩草原、內(nèi)蒙古中東部和西北草原的原始當(dāng)家品種。但由于長期以來不合理開荒種地、過度放牧和自然災(zāi)害的影響,使羊草資源受到很大程度的破壞[2]。根際即指植物根周圍數(shù)毫米的區(qū)域,根際微生物(聚居在根際土壤,以根際分泌物為主要營養(yǎng)的一群微生物)在促進植物生長方面有著積極的作用。本試驗對不同生境羊草根際微生物種群進行了定量及定性分析,現(xiàn)將結(jié)果報告如下。
1.研究地區(qū)的自然概況與研究方法
1.1研究地區(qū)的自然概況
研究地點位于吉林省西部長嶺縣境內(nèi)。該地區(qū)為溫帶季風(fēng)氣候,冬夏季風(fēng)更替現(xiàn)象明顯。年平均氣溫4.9℃,最暖月7月平均氣溫為22~25℃,最冷月1月平均氣溫-16~-22℃。年降水量平均為470mm,多集中在6~8月份。年蒸發(fā)量為1668mm。該地區(qū)地帶性植被為羊草草原,水平地帶性土壤為淡黑鈣土。群落類型以羊草群落占絕對優(yōu)勢,廣泛分布在低地平原。
1.2研究方法
1.2.1 4月20日羊草返青期開始,按五點取樣法在天然羊草地、人工羊草草地、林邊羊草草地、農(nóng)田邊羊草草地選取羊草植株,將其根系區(qū)土樣用鐵鏟挖出,抖掉根系土,取緊貼在根表附近的土樣。在未種羊草的同一地塊上取土作為對照。采樣深度為0cm~10cm和10cm~20cm兩個層面,按四分法將從各點采集的土樣充分混合均勻,攤平,劃分十字把土分為四份,取對角二份。分別將根系連同根際土壤一同放入無菌袋采回,具體參照文獻。
1.2.2根際微生物的分離培養(yǎng):細(xì)菌的分離采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,放線菌的分離采用高氏一號培養(yǎng)基,真菌的分離采用馬丁氏培養(yǎng)基。自生固氮菌:稀釋平板法,28℃培養(yǎng)7天后計數(shù),阿須貝瓊脂培養(yǎng)基;氨化細(xì)菌:MPN法,30℃培養(yǎng)5天后計數(shù),蛋白胨液體培養(yǎng)基;硝化細(xì)菌:MPN法,28℃培養(yǎng)10天后計數(shù),改良的斯蒂芬遜液體培養(yǎng)基;纖維素分解菌用Hutchinson培養(yǎng)液MPN法。
1.2.3土壤微生物數(shù)量測定:細(xì)菌和放線菌的計數(shù)采用平板混菌法,真菌計數(shù)采用表面涂抹平板法。
1.2.4菌株的鑒定:主要鑒定指標(biāo)包括菌體形態(tài)和菌落特征培養(yǎng)觀察、生理生化指標(biāo)測定,具體方法參照文獻。
2.結(jié)果與分析
2.1羊草根際微生物的類群
(1)細(xì)菌。(2)放線菌。(3)真菌。
2.2不同生境根際細(xì)菌的數(shù)量變化
細(xì)菌在不同生境中數(shù)量分布大小的順序為:人工草場>林邊>天然草場>鹽堿地。真菌分布順序為:天然草場>人工草場>鹽堿地>林邊。放線菌分布順序為:林邊>天然草場>人工草場>鹽堿地。
不同生境植物群落的種類組成、結(jié)構(gòu)不同,所形成有機質(zhì)的量和營養(yǎng)成分存在一定差異。微生物主要以植物殘體為營養(yǎng)源,植物的質(zhì)和量的差異必然導(dǎo)致根際微生物在各植物群落中分布的不均一性。
2.3不同生境根際微生物主要生理群分析
實驗結(jié)果表明,根際中自生固氮菌、纖維素分解菌、氨化細(xì)菌的數(shù)量分布呈現(xiàn)出不均一性。自生固氮菌在不同生境中數(shù)量分布大小的順序為:天然草場>林邊>鹽堿地>人工草場。纖維素分解酶分布順序為:鹽堿地>天然草場>林邊>人工草場。硝化細(xì)菌分布順序為:人工草場>天然草場>林邊>鹽堿地。氨化細(xì)菌分布順序為:林邊>天然草場>人工草場>鹽堿地。
3.討論
植物根際是生物和物理特性受到根系影響的緊密環(huán)繞根的區(qū)域,在這一區(qū)域內(nèi),微生物種群豐富,研究和利用這一豐富的微生物資源庫,正不斷受到人們的重視,但國內(nèi)外對羊草根際微生物的研究卻未見報道。因此研究一定區(qū)域內(nèi)羊草根際微生物數(shù)量的變化規(guī)律具有一定的現(xiàn)實意義。由于工作量較大,對根際真菌和放線菌的研究,只探討了其數(shù)量的變化,未對種群進行鑒定分析,此項工作有待進一步完善。本實驗通過對不同生境羊草根際微生物數(shù)量的研究,為進一步研究根際微生物對羊草不同生境生長發(fā)育影響和指導(dǎo)羊草生產(chǎn)提供理論依據(jù),也有助于羊草根際微生物生態(tài)、微生物肥料等研究工作的開展。
參考文獻:
提高臨床微生物檢驗質(zhì)量,及時、準(zhǔn)確地將檢驗結(jié)果回報給臨床醫(yī)生,對于感染性疾病的診斷和治療是非常重要的。但目前臨床微生物送檢率和檢驗質(zhì)量普遍不高,分析其原因,筆者認(rèn)為以下幾個問題是普遍存在的,應(yīng)加以注意。
1醫(yī)院管理的問題
1.1醫(yī)院對微生物室的投入不夠微生物學(xué)檢驗較臨床生化檢驗、免疫學(xué)檢驗成本高、技術(shù)性強、人員素質(zhì)要求高,醫(yī)院對微生物室的軟件、硬件投人不夠,特別是近年心血管、腫瘤等疾病發(fā)病率上升,醫(yī)院管理者及醫(yī)務(wù)人員對傳染病的危險性及病原學(xué)檢驗的重要性有所忽視。臨床科室開展微生物檢驗項目,專挑一些效益好、操作簡單項目甚至采用給臨床醫(yī)師提供“開單費”吸納標(biāo)本,為獲取局部利益,降低成本、取消室內(nèi)質(zhì)控、不參加室間質(zhì)評。
1.2臨床醫(yī)師對臨床微生物學(xué)新進展了解甚少臨床醫(yī)師不能借助微生物學(xué)知識對疾病進行診斷、治療。由于醫(yī)師接收大量抗菌藥物信息,用藥前采集標(biāo)本的原則遵循率低。有些醫(yī)師甚至認(rèn)為細(xì)菌培養(yǎng)和藥物敏感試驗限制了自由用藥而加以抵制。
1.3職稱評定受限臨床微生物學(xué)工作人員現(xiàn)大多數(shù)按技師資格評審職稱,人為地割斷了與臨床密不可分的聯(lián)系;某些院校技師職稱無研究生導(dǎo)師資格等,導(dǎo)致有一定臨床經(jīng)驗同時具有豐富臨床微生物學(xué)經(jīng)驗的人才缺乏,進而導(dǎo)致對新疾病病原缺乏預(yù)見性和警惕性,對生物恐怖缺乏足夠的應(yīng)對能力。
1.4危險崗位工作津貼發(fā)放不合理津貼發(fā)放,微生物室與檢驗科一樣,低于感染病科和皮膚科的現(xiàn)象普遍存在。
1.5收費方式不合理目前各醫(yī)院微生物學(xué)檢驗收費方式采用按項目收費,由于標(biāo)本分離病原菌的不可預(yù)知性,陽性標(biāo)本常因高昂的細(xì)菌鑒定及藥敏費用導(dǎo)致賠本,制約了醫(yī)院和科室開展工作的積極性。
1.6標(biāo)本采集、運送過程中的問題標(biāo)本采集不合要求,采集方法和時間、使用容器不當(dāng),標(biāo)本保存和運送不及時不規(guī)范,標(biāo)本標(biāo)識不清等。
2檢驗人員的個人素質(zhì)問題
臨床微生物檢驗具有專業(yè)性、技術(shù)性以手工操作為主,多依靠形態(tài)學(xué)和生化反應(yīng)進行鑒定,每一步驟均需要有效強的判斷能力。雖然也有一些自動化儀器可以利用,但和臨床基礎(chǔ)檢驗、臨床化學(xué)、免疫學(xué)檢驗等相比,檢驗人員的基礎(chǔ)知識、個人經(jīng)驗顯得更為重要。因此檢驗人員必須經(jīng)常閱讀有關(guān)資料,不斷地進行專業(yè)知識和技術(shù)的更新,提高個人專業(yè)水平和改進操作技術(shù)。檢驗人員都必須接受專門培訓(xùn),學(xué)習(xí)新的專業(yè)理論和專業(yè)技術(shù),掌握新型儀器的操作使用和維護[1]。細(xì)菌室專業(yè)人員應(yīng)保持穩(wěn)定,。糾正只求檢驗速度,不顧質(zhì)量的不良作風(fēng)。
目前存在的另一個問題是檢驗人員和臨床聯(lián)系不密切,包括與臨床醫(yī)生和與患者之間的聯(lián)系,如果檢驗人員能做到隨醫(yī)生查房,多了解患者的病情和治療情況,對檢驗方案的設(shè)計及得出正確的結(jié)果無疑會有很大幫助。
3標(biāo)本的質(zhì)量問題
正確采集、運送和處理標(biāo)本,對提高檢出率是至關(guān)重要的。標(biāo)本采集時間是否恰當(dāng)采集方法是否正確是整個檢驗的關(guān)鍵。如中下呼吸道標(biāo)本,臨床醫(yī)生不但要注意要讓患者在用抗生素前或者停藥24h后來采痰,還要是深部咳痰后第2口痰,并用無菌容器封裝,然后及時送微生物室檢驗;間歇性寒戰(zhàn)或發(fā)熱的患者血標(biāo)本的采集,寒戰(zhàn)或發(fā)熱的前后采集也有不同的時間要求,且成人與兒童的血量上也有區(qū)別;現(xiàn)在醫(yī)院微生物檢驗的標(biāo)本很多是由臨床醫(yī)生或是患者自己采集,特別是糞、尿和痰液標(biāo)本。采集尿液多用中斷尿采集法,尿標(biāo)本要取中段尿10~20m,l并要排入無菌容器中;醫(yī)生常讓患者不經(jīng)無菌操作自行收集中斷尿,故常將外尿道的常居菌帶入,造成標(biāo)本嚴(yán)重污染。據(jù)研究,經(jīng)嚴(yán)格無菌操作收集的尿液和不經(jīng)清洗消毒處理,由患者自行收集的尿進行對比測試,往往得出完全不同的結(jié)果。對于痰液標(biāo)本,常由于缺少醫(yī)生必要的指導(dǎo),得到的痰標(biāo)本常帶有一定量的氣管、咽喉及口腔常居菌,甚至有的根本沒有下呼吸道的成分。正確的方法應(yīng)該是清晨起床后用涼開水漱口多次,以除去口腔內(nèi)大量雜菌,用力咳出肺深部的膿痰,置于無菌容器中送檢。
4檢驗方案設(shè)計問題
設(shè)計合理的檢驗方案對提高檢出率也是至關(guān)重要的。如在形態(tài)學(xué)檢驗中常用的抗酸染色,多數(shù)實驗室仍使用齊-尼二氏染色法,而這種方法和熒光染色法相比,陽性率要低10~30倍,尤其對用胺硫脲治療的患者,這是因為胺硫脲能破壞分枝桿菌的抗酸性,而保留其熒光性。據(jù)資料介紹,有人用熒光法檢查經(jīng)多次齊-尼二氏染色法陰性的痰標(biāo)本,陽性率高達13.5%。再有結(jié)核桿菌的直接涂片法和集菌檢查法相比,后者的檢出率明顯高于前者,據(jù)調(diào)查,目前多數(shù)實驗室仍使用直接涂片檢查法。
在培養(yǎng)檢查上,標(biāo)本的前處理和培養(yǎng)基的選擇很重要。有些臨床標(biāo)本,如痰、尿等,進行必要的前處理,可除去污染的雜菌,明顯提高陽性檢出率。在培養(yǎng)基選擇上。如疑是淋菌敗血癥患者,選用血培養(yǎng)基應(yīng)不含多聚茴香腦硫酸鈉(SPS),因(SPS)對淋菌有毒性。為了抑制革蘭陰性菌,分離淋菌所用的培養(yǎng)基一般都加萬古霉素。但據(jù)研究,有的地區(qū)多達15%的淋菌對培養(yǎng)基中萬古霉素敏感而造成漏檢。再比如,在取糞便分離培養(yǎng)時,常規(guī)所用的培養(yǎng)基是伊紅美藍瓊脂和SS瓊脂平板。在這兩種培養(yǎng)基上,致病的腸桿菌科細(xì)菌能被選擇出來,但同樣能引起腹瀉的弧菌科有些細(xì)菌,如副溶血性弧菌因具有嗜鹽性,在伊紅美藍瓊脂上是不生長的,在SS瓊脂平板上多數(shù)也不生長。如果對這類細(xì)菌仍用常規(guī)培養(yǎng)基分離培養(yǎng),其結(jié)果也是造成漏檢,所以在培養(yǎng)前做培養(yǎng)基性能試驗,對培養(yǎng)基質(zhì)量進行控制是十分必要的。
筆者認(rèn)為以上幾方面是臨床微生物檢驗中比較關(guān)鍵的問題,實驗后的數(shù)據(jù)處理、結(jié)果報告等方面也是影響微生物檢驗質(zhì)量的因素。能從上述幾方面注意微生物檢驗質(zhì)量問題,臨床微生物檢驗的現(xiàn)狀一定會有所改善。
【關(guān)鍵詞】 平板菌落計數(shù)法;平板放置時間;平板涂布方法
DOI:10.14163/ki.11-5547/r.2016.16.196
平板菌落計數(shù)法是將待測樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋, 在規(guī)定的條件下培養(yǎng)后, 所得1 ml或1 cm2樣品中含菌落的總數(shù)。一般認(rèn)為, 一個肉眼可見的菌落代表原樣品中的一個單細(xì)胞。選擇合適的稀釋度并乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)就可以獲得樣品中微生物的數(shù)量[1]。平板菌落計數(shù)法以其重復(fù)性好, 能真實地反應(yīng)樣品中活菌數(shù)量的優(yōu)勢成為我國衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的公認(rèn)可行的方法, 并且在食品藥品研究領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。尤其在醫(yī)藥方面, 控制口服制劑中微生物的污染狀況是藥品質(zhì)量控制的重要指標(biāo), 也是評價企業(yè)各生產(chǎn)環(huán)節(jié)衛(wèi)生狀況的重要手段和依據(jù)[2]。另一方面, 平板菌落計數(shù)法也可用于檢測活菌制劑類藥物的活菌數(shù)量。乳酸菌是食品工業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)中被廣泛應(yīng)用的菌株之一, 其活菌數(shù)的多少直接影響產(chǎn)品的質(zhì)量和功能。因此, 研究乳酸菌的平板菌落計數(shù)法的影響因素有助于提高其檢測的準(zhǔn)確程度, 進而有效控制藥品制作中微生物數(shù)量, 提高產(chǎn)品品質(zhì)。現(xiàn)將研究結(jié)果報告如下。
1 材料與方法
1. 1 材料 MRS液體培養(yǎng)基:蛋白胨5 g, 牛肉膏5 g, 酵母粉5 g, 胰蛋白胨10 g, 吐溫(Tween)-80 1 ml, 葡萄糖20 g, 磷酸氫二鉀2 g, 檸檬酸氫二銨2 g, 乙酸鈉5 g, 硫酸鎂0.5 g, 硫酸錳0.25 g, 蒸餾水定容至1000 ml, 調(diào)節(jié)pH值至5.8, 121℃滅菌15 min, 用于菌體的活化。MRS固體培養(yǎng)基:MRS液體培養(yǎng)基添加2%(W/V)的瓊脂粉, 121℃滅菌15 min, 用于菌落計數(shù)。BCN1360型生物潔凈工作臺;DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱。
1. 2 方法 菌體的活化從-80℃取出嗜酸乳桿菌復(fù)蘇純化, 37℃、14 h活化兩代。
1. 2. 1 菌懸液的制備 將上述活化后的第三代嗜酸乳桿菌菌液用0.85% (W/V) 的無菌氯化鈉溶液分別梯度稀釋至10-5、10-6、10-7, 備用。
1. 2. 2 涂布方法及平板放置時間的影響檢測 分別采用圓形、井字、先圓形后井字和90°轉(zhuǎn)動平板橫線4種涂布方法, 將10-5、10-6、10-7三個稀釋度的菌液涂布在分別放置了3、6、9、12 h的MRS平板上。37℃培養(yǎng)48 h后, 挑選菌落數(shù)在30~300的平板計數(shù)。
2 結(jié)果
2. 1 不同涂布方法對于活菌數(shù)的影響不明顯, 而對于同一涂布方法來說, 平板放置12 h后, 微生物生長的菌落數(shù)最低。見圖1。
2. 2 通過觀察發(fā)現(xiàn)不同涂布方法相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均大約在10%以內(nèi)。見表1。
3 討論
“2. 1結(jié)果”可能是由于培養(yǎng)基在放置12 h后內(nèi)部的水分活度沒有其他時間段利于微生物的生長[3]。由于在試驗過程中發(fā)現(xiàn)平板放置3 h時培養(yǎng)基表面較滑, 不利于涂布操作。綜合考慮, 選擇放置6~9 h的平板更適于菌落計數(shù)。
測定樣品中的菌數(shù)方法主要有顯微鏡直接計數(shù)法、平板菌落計數(shù)法、濁度測量法、粒子計數(shù)法、三磷酸腺苷(ATP)生物發(fā)光法、電阻抗測量法、放射測量法、接觸酶測量法等。這些方法都存在各自的適用范圍及優(yōu)缺點。平板菌落計數(shù)法具有能檢測出活菌數(shù), 更真實地反映樣品狀況以及重復(fù)性好, 樣品中菌數(shù)高或低都適用的特點, 因此在藥品研究及實踐中廣泛應(yīng)用。但是對于平板菌落計數(shù)法的影響因素研究卻甚少, 通過本研究發(fā)現(xiàn), 涂布方法對于平板菌落計數(shù)的影響是不顯著的。相反, 平板的放置時間對于最終菌落計數(shù)的結(jié)果有顯著性影響, 當(dāng)培養(yǎng)基放置時間過長(>12 h)時, 水分活度的改變會影響所培養(yǎng)微生物的生長。這利于提高平板菌落計數(shù)的準(zhǔn)確性, 對更好地控制食品、藥品中微生物的數(shù)量具有重要意義。
參考文獻
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[2] 張松青, 王鑫, 鄭笠. 麻荊止咳顆粒微生物限度檢查方法的建立. 海峽藥學(xué), 2014, 12(34):78-79.
在臨床醫(yī)學(xué)中,一個較為重要的內(nèi)容就是臨床微生物檢驗技術(shù)。由于新感染病的出現(xiàn)、耐藥菌的涌現(xiàn)、常見感染病原譜的變遷和易感人群的不斷增加,使得感染性疾病并沒有象人類曾經(jīng)所預(yù)料的那樣隨著抗感染化療時代的到來而逐一銷聲匿跡。相反,近年來感染性疾病又重新成為人類關(guān)注的熱點。新時期,我國臨床微生物檢驗技術(shù)如何順應(yīng)形勢的發(fā)展,積極幫助臨床做好感染性疾病的救治工作已顯得十分迫切。
一、臨床微生物檢驗的基本原則
發(fā)現(xiàn)感染應(yīng)及時采集微生物標(biāo)本作病原學(xué)檢查,二、三級醫(yī)院微生物標(biāo)本送檢率不應(yīng)低于70%。 盡量在抗菌藥物使用之前采集標(biāo)本。 標(biāo)本采集時應(yīng)嚴(yán)格無菌操作,減少或避免機體正常菌群及其它雜菌污染。標(biāo)本采集后應(yīng)立即送至細(xì)菌室。床旁接種可提高病原菌檢出率。以棉拭子采集的標(biāo)本如咽拭子、肛拭或傷口拭子,宜插入運送培養(yǎng)基送檢。 送檢標(biāo)本應(yīng)注明來源和檢驗?zāi)康?,使?xì)菌室能正確選用相應(yīng)的培養(yǎng)基和適宜的培養(yǎng)環(huán)境。
二、標(biāo)本采集質(zhì)量對微生物檢驗質(zhì)量的影響
標(biāo)本采集主要有兩種形式,分別是患者自行采集和醫(yī)生采集。提高檢出率的重要因素就在于一定要進行正確采集標(biāo)本。標(biāo)本采集時,一定要進行嚴(yán)格的無菌操作,避免標(biāo)本感染而產(chǎn)生誤檢,直接影響微生物檢驗的臨床檢驗診斷。
1、血標(biāo)本的采集:對于寒戰(zhàn)患者和間歇性發(fā)熱患者,尤其是間歇性菌血癥患者,應(yīng)該在其體溫寒戰(zhàn)期或上升期進行采集血液。采集的血量兒童一般采集1~5mL,成人一般采集8~10mL。為了有效地提高其血液培養(yǎng)的陽性率,采集血標(biāo)本時應(yīng)該掌握好其采集血的頻率、部位、容量、時間等因素,另外,還應(yīng)該在24h內(nèi),從患者不同的身體部位采集2~3份血樣。
2、膿標(biāo)本的采集:應(yīng)該將膿標(biāo)本的采集置于用抗生素之前,這樣可以避免出現(xiàn)無細(xì)菌生長的情況發(fā)生。因膿標(biāo)本分為兩種,分別是外源性和內(nèi)源性,采集外源性的膿標(biāo)本時,選定膿標(biāo)本采集部位的時候應(yīng)該選擇深部的膿腫部位。采集標(biāo)本完之后,馬上就送到檢驗部門進行檢驗,只有這樣才能夠有效地避免出現(xiàn)細(xì)菌中途死亡的問題。而相對于采集外源性的膿標(biāo)本而言,采集內(nèi)源性的膿標(biāo)本更加困難,需要在在無菌操作下進行病理切片。
3、痰標(biāo)本的采集:應(yīng)該患者需要不斷地進食,那么自然患者口腔內(nèi)的菌群會隨著攝入變質(zhì)的食物的數(shù)量增加而增加,所以在痰標(biāo)本的采集時,務(wù)必要囑咐患者避免使用牙膏,用干凈清水漱口來清潔口腔,避免出現(xiàn)雜菌導(dǎo)致誤檢的情況發(fā)生。在采集痰標(biāo)本之后,應(yīng)該馬上用無菌器皿封裝,快速送往微生物室進行檢驗。對咳嗽乏力或昏迷病人,可用吸痰管經(jīng)鼻腔或口抵達氣管腔內(nèi)吸引痰液。用纖維支氣管鏡可直接在病灶部位采集高濃度的感染病原菌,但不能完全避免咽喉部正常菌群感染。 痰標(biāo)本不能及時送檢者,可暫存4℃冰箱。室溫下?lián)鷶R數(shù)小時定植于口咽部的非致病菌呈過度生長而肺炎鏈球菌、葡萄球菌和流感嗜血桿菌檢出率明顯降低
4、 尿標(biāo)本的采集:為避免尿標(biāo)本的采集的過程中受到污染,應(yīng)該要囑咐患者認(rèn)真清洗尿道口和外陰,在睡前少飲水,最好為晨尿中的中段尿。。因尿內(nèi)含有大量有利于細(xì)菌生長的營養(yǎng)成分,所以應(yīng)該盡快送檢,控制在采集尿標(biāo)本之后的一小時之內(nèi),這樣才能夠避免出現(xiàn)誤檢。
5、其他標(biāo)本采集:采集厭氧菌培養(yǎng)標(biāo)本時,務(wù)必要清楚厭氧培養(yǎng)適合于哪些標(biāo)本;對于采集大便標(biāo)本而言,應(yīng)該將性狀與顏色都較為特殊的部分直接放入無菌容器內(nèi)。
三、臨床微生物檢驗的心得體會
1、積極向臨床醫(yī)師和護士宣傳微生物檢驗的新方法、新技術(shù)和新概念。比如血培養(yǎng)技術(shù)改進原理,特別在提高陽性率、縮短培養(yǎng)結(jié)果報告時間等方面的優(yōu)越性;真菌顯色培養(yǎng)基在念珠菌快速培養(yǎng)和菌種鑒定中的價值;快速細(xì)菌鑒定和藥敏測試儀。臨床醫(yī)師只有在正確了解新技術(shù)的發(fā)展和臨床意義后,才會積極應(yīng)用于臨床工作實踐,即增加了標(biāo)本的送檢率。 同時,還應(yīng)該指導(dǎo)臨床開展微生物標(biāo)本檢驗項目的正確選擇、采樣與運送方法。微生物檢驗項目的選擇、標(biāo)本 采集和 運送方法正確與否直接影響標(biāo)本的檢驗質(zhì)量,是我們能否準(zhǔn)確及時的將檢驗結(jié)果反饋給臨床的重要保證。
2、及時更新和評估檢驗方法、操作規(guī)程,提高檢驗質(zhì)量。微生物學(xué)是一門古老而又充滿生機、不斷發(fā)展的學(xué)科。近幾十年來,感染的病原譜和耐藥性發(fā)生許多變化,臨床微生物檢驗技術(shù)也在 不斷創(chuàng)新和完善之中,因此定期更新和評估檢驗方法十分重要。
3、協(xié)助臨床正確閱讀和分析微生物檢驗報告單。近年來,不少感染性疾病特別是醫(yī)院感染的病原 譜和 藥敏譜發(fā)生 很大變化。以往罕見的微生物頻頻出現(xiàn)在檢驗報告單上,藥敏試驗的方法、受試品種、結(jié)果解釋也又不少改變。臨床醫(yī)師對利用臨床微生物檢驗資料發(fā)生了空前的困惑。微生物室應(yīng)積極與臨床溝通,幫助解決臨床醫(yī)師在判讀微生物檢驗和藥敏結(jié)果報告單時的困難。指出正常菌群、污染菌和感染菌的鑒別與判斷;檢驗報告為少見菌或罕見菌的意義;細(xì)菌培養(yǎng)陰性時的可能原因;藥敏試驗結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)和局限性等。
參考文獻:
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〔2〕 李秀珍.微生物檢驗質(zhì)量控制工作體會〔J〕.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生,2004
關(guān)鍵詞:食品;不確定度;菌落總數(shù);檢測
測量不確定度是指表征合理地賦予被測量之值的分散性,與測量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù),測量結(jié)果的完整表示中應(yīng)包括測量不確定度。因此,正確評定測量不確定度對客觀分析測量結(jié)果,進行實驗室質(zhì)量管理具有重要的意義?!?】在ISO\IEC 17025:2005中明確指出:“檢測實驗室應(yīng)具有并應(yīng)用評定測量不確定度的程序”。【2】
食品的衛(wèi)生狀況與人們健康的關(guān)系極為密切。食品中微生物的檢測是評價食品質(zhì)量的重要衛(wèi)生指標(biāo)之一,而食品中菌落總數(shù)是反映食品污染度的重要指標(biāo)。
在食品微生物學(xué)中,基質(zhì)對測量不確定度的影響是不可避免的,因此本文以同樣基質(zhì)的10個樣品進行分析。依據(jù):ISO\TS 19036:2006《食品微生物學(xué) 測量不確定度評估指南》,GB 4789.2-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》,探討食品中菌落總數(shù)檢測結(jié)果不確定度的評估方法。
1 實驗部分
1.1 基質(zhì):10分相同基質(zhì)的涼菜,分別設(shè)為樣品S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10。
1.2操作:操作A和操作B:分別代表測試員A和測試員B的操作,而且操作A與操作B不在同一日期進行。
1.3檢測依據(jù):GB 4789.2-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》。
1.4培養(yǎng)基:由青島海博生物技術(shù)提供的平板計數(shù)瓊脂。
1.5檢測儀器:賓得生化培養(yǎng)箱、壓力蒸汽滅菌器、冰箱、拍打式均質(zhì)器、渦旋振蕩器、1ml移液器。
1.6檢測過程:分別進行無菌操作,將25g樣品剪碎到無菌均質(zhì)袋中,加入225ml滅菌生理鹽水,根據(jù)樣本的污染情況,選擇2~3個稀釋度,每個稀釋度做2個平皿。及時將培養(yǎng)基注入平皿約15ml混勻,置36度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h±2h,計數(shù)后,按標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的方法計算菌落總數(shù)結(jié)果。【3】
1.7檢測結(jié)果:
2 數(shù)學(xué)模型及不確定度來源
2.1根據(jù)GB 4789.2-2010,建立菌落總數(shù)的計算公式為:
(N為菌落總數(shù),d為第一稀釋度,C為可計數(shù)平板菌落數(shù)之和,n1和n2為可計數(shù)稀釋倍數(shù)的平板數(shù)。當(dāng)僅一個稀釋倍數(shù)的平板菌落數(shù)在計數(shù)范圍內(nèi)時,n2=0。)
2.2不確定度分量的主要來源
菌落總數(shù)的不確定度主要由系統(tǒng)性效應(yīng)和隨機效應(yīng)引起。本實驗的不確定度與樣品稀釋、操作者、時間、溫度、培養(yǎng)基和人員計數(shù)有關(guān)。
2.3評估原理
ISO/TS 19036:2006標(biāo)準(zhǔn)采用整體法評估測量不確定度。它以影響測試結(jié)果的分析程序的總變量為基礎(chǔ)進行評估,其中,總變量包括可觀察到的精密度(任意成分)和偏差(系統(tǒng)成分)。在食品微生物領(lǐng)域的實際應(yīng)用中,通常僅考慮精密度。測量不確定度的整體法評估,是對全部測量程序最終結(jié)果可再現(xiàn)性的標(biāo)準(zhǔn)偏差進行實驗性評估得到的。該標(biāo)準(zhǔn)偏差相當(dāng)于合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度?!?】
2.4計算
依照慣例,在計算之前,數(shù)據(jù)(微生物計數(shù)結(jié)果)單位應(yīng)從CFU/g或CFU/ml轉(zhuǎn)換為log10(CFU/g)或log10(CFU/ml)。
計算n個給定基質(zhì)樣品的再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)差SR的方法見式:
式中:
yij--對數(shù)轉(zhuǎn)換值,單位為log10(CFU/g)或log10(CFU/ml)
i--樣品的序號, =1-n(n≥10)
j--再現(xiàn)性條件的編號,j=A或j=B
3 測量不確定度報告
3.1測量不確定度的標(biāo)示
不確定度表述的方法可以為log10為單位的區(qū)間、自然值(每克或每毫升的CFU值)或百分比。
按照《測量不確定度表示指導(dǎo)》的定義,擴展不確定度U為合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度uc(y)和包含因子k的乘積。取k值為2(大約對應(yīng)95%的置信水平)。
測試結(jié)果可按照以下形式進行報告:
(1) ;
(2) ;
(3)xCFU/g或xCFU/ml ;
(4)xCFU/g或xCFU/ml
3.2不確定度的計算
根據(jù)表1計算再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)偏差:
以1號樣品A操作為例(7.0×105CFU/g),測試結(jié)果可報告為:(5.85-0.14)log10~(5.85+0.14)log10,查反對數(shù)表,結(jié)果為512861CFU/g~977237CFU/g。
4 小結(jié)
測量不確定度評估是實驗室質(zhì)量體系的重要組成部分。有關(guān)菌落總數(shù)檢測結(jié)果不確定度的報道也越來越多,有人提出對同一樣品進行多次重復(fù)測試來評估;有人提出合并樣品方差來評估;也有人采用了Seppo I Niemela提出的根據(jù)菌落泊松分布特點去評估不確定度?!?】本文通過整體法評估了菌落總數(shù)檢測的不確定度,用實驗室內(nèi)的再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)偏差來獲取測量不確定度。在日常工作中具有很強的操作性,比較適宜用于菌落計數(shù)的不確定度評估。
參考文獻
【1】雷質(zhì)文.食品微生物實驗室質(zhì)量管理手冊[M].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社.
【2】ISO\IEC 17025:2005檢測和校準(zhǔn)實驗室認(rèn)可準(zhǔn)則[S]
【3】GB 4789.2-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定[S]
1資料與方法
1.1一般資料
選擇內(nèi)蒙古疾病預(yù)防控制中心下發(fā)的樣品測試內(nèi)容對奶粉中所含食源性致病菌進行檢驗,對檢驗結(jié)果實施定性分析。生化反應(yīng)鑒定要求到屬或者種。
1.2方法
1.2.1儀器、試劑
檢驗所用主要儀器設(shè)備為恒溫培養(yǎng)箱,VITEK2-compact細(xì)菌鑒定分析系統(tǒng)(生產(chǎn)企業(yè):法國梅里埃公司生產(chǎn))。所用培養(yǎng)基以及試劑主要由BD、北京陸橋技術(shù)、法國科瑪嘉、青島海博有限公司提供。經(jīng)過檢定及校準(zhǔn),研究中所用儀器設(shè)備、試劑等均在有效期內(nèi)。
1.2.2研究方法
本次研究主要以《2016年食源性致病菌監(jiān)測工作手冊》、食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗標(biāo)準(zhǔn)[1]作為參照,對所選樣品實施微生物檢驗。在檢驗過程中實施室內(nèi)質(zhì)量控制,保證檢驗所得相關(guān)結(jié)果的真實可靠性和準(zhǔn)確性。
1.2.3實驗室檢驗
①無菌操作分別將樣品接種mLST-Vm肉湯、李氏增菌肉湯LB、緩沖蛋白胨水、腸道菌增菌肉湯、氯化鈉堿性蛋白胨水(3%)、改良EC肉湯、氯化鈉肉湯(7.5%)、胰酪胨大豆多粘菌素肉湯中,然后放置于恒溫培養(yǎng)箱中適當(dāng)溫度環(huán)境中進行適當(dāng)時間的培養(yǎng)。②分別挑取以上增菌液接種至阪崎腸桿菌顯色平板、TSA、PALCAM平板、沙門菌顯示平板、HE、XLD、TCBS平板、弧菌顯色平板、MAC、大腸顯色平板、金黃色葡萄球菌顯色平板、B-P平板、MYP平板中,放置恒溫培養(yǎng)箱適當(dāng)溫度環(huán)境中進行適當(dāng)時間的培養(yǎng)。③對增菌液中細(xì)菌的生長情況進行密切觀察,對平板上菌落特點進行密切觀察;④在MAC菌落特點為粉紅色、中等大小菌落,大腸顯色平板上為藍色菌落。阪崎腸桿菌顯色平板上為藍綠色菌落,在TSA上為黃色菌落。其它平板上無可疑菌落。⑤選取平板上可疑菌落進行涂片染色鏡檢;挑MAC、大腸顯色平板、阪崎腸桿菌顯色平板及TSA上可疑菌落接種至TSI(三糖鐵)、MIU(動力-靛基質(zhì)-脈酶)、普通平板中,并進行培養(yǎng)。⑥對MIU、TSI結(jié)果進行觀察,選取普通平板上出現(xiàn)的菌落實施氧化酶實驗。選取兩種可疑菌純培養(yǎng)物行生化鑒定。
2結(jié)果
主要檢出致病菌為大腸埃希氏菌和阪崎腸桿菌。增菌之后行接種選擇平板相關(guān)操作和所獲得的結(jié)果均與直接接種法相同。本次研究結(jié)果上報內(nèi)蒙古疾病預(yù)防控制中心。質(zhì)控樣品檢驗獲得“滿意”結(jié)果。
3討論
在實施食品安全微生物檢驗中,微生物實驗室間比對試驗為一種對實驗室檢測結(jié)果的可靠性、準(zhǔn)確性進行驗證的最有效措施之一[2]。目前,在食品安全風(fēng)險監(jiān)測室間,主要選用該種方法對微生物檢驗結(jié)果實施質(zhì)控考核。在質(zhì)控考核過程中,相關(guān)分析工作人員必須具備扎實的實驗室檢測專業(yè)知識及操作技能,同時還必須對醫(yī)學(xué)檢驗、食品衛(wèi)生檢驗所涉及的相關(guān)知識,操作步驟和流程等均有全面了解,并嫻熟掌握,在實際工作過程中,還須充分結(jié)合實際情況,對污染樣品中可能存在的相關(guān)病原菌進行全面考慮[3]。在實施細(xì)菌鑒定過程中,工作人員須時刻保持清晰思路。同時實施增菌、直接劃平板,對增菌以及分離培養(yǎng)基進行合理選擇,保證培養(yǎng)基營養(yǎng)狀況以及培養(yǎng)環(huán)境的溫濕度等能夠符合培養(yǎng)條件,在檢驗過程中最大限度降低漏檢率,提高檢出率。在常規(guī)樣品檢測、實驗室間質(zhì)控考核工作的實施過程中,均須首先要保證室內(nèi)質(zhì)量控制,保證實驗室檢測結(jié)果的精準(zhǔn)性。同時,在檢驗工作的開展過程中,檢驗及分析工作人員必要要重視每份樣品,嚴(yán)格按照相關(guān)要求和標(biāo)準(zhǔn)實施檢驗流程及操作。只有這樣才能保證樣品微生物檢驗過程中設(shè)計的樣品采集、樣品處理、細(xì)菌染色、培養(yǎng)基選擇、試劑使用等各個環(huán)節(jié)均能夠保持良好的精準(zhǔn)性,進而保證樣品微生物檢驗結(jié)果的可靠及準(zhǔn)確性。在食品衛(wèi)生檢驗工作中,食品微生物檢驗為一個不可或缺的重點內(nèi)容。相關(guān)機構(gòu)必須定期對食品微生物檢驗實施實驗室間質(zhì)量控制考核,對實驗結(jié)果進行嚴(yán)格把關(guān),進而推動衛(wèi)生檢疫人員不斷提高自身專業(yè)知識技能及素質(zhì),促進實驗室檢測水平得到不斷提升,進而保證食品微生物檢驗工作能夠有序、快速進行,并保證檢驗質(zhì)量,進而為衛(wèi)生監(jiān)督執(zhí)法部門工作的開展提供可靠依據(jù),保證食品衛(wèi)生安全。
作者:曲桂娟 許杰 單位:內(nèi)蒙古赤峰市疾病預(yù)防控制中心
參考文獻
[1]柳勤,葉新,張惠文,等.2015年天河區(qū)食品安全風(fēng)險監(jiān)測微生物結(jié)果與分析[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2016,14(10):540-541.