棒狀乳桿菌運用前景探討

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本文作者：馮婷婷、方芳、堵國成、陳堅 單位：江南大學(xué)食品與科學(xué)技術(shù)國家重點實驗室、江南大學(xué)生物工程學(xué)院

市售泡菜、家庭自制泡菜、發(fā)酵香腸、天然奶疙瘩(新疆)、天然發(fā)酵酸奶。培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基：蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，NaCl1g，蒸餾水100mL；MRS(deman，Rogosa，Sharpe)、BHI(BrainHeartInfusion)、MH(Meller-Hinton)培養(yǎng)基：OXIOD公司。磷酸鹽緩沖液：NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO4•12H2O3.63g，KH2PO40.24g，蒸餾水1000mL，pH7.0。大腸桿菌、產(chǎn)堿假單胞菌、熒光假單胞菌、石油假單胞菌、嗜酸乳桿菌(LactobacillusacidophilusATCC4356)：本實驗室保藏菌株；肺炎克雷伯氏菌：江南大學(xué)中國高校工業(yè)微生物資源與信息中心；鼠傷寒沙門氏菌、空腸彎曲桿菌：愛爾蘭國立科克大學(xué)。大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌：LB培養(yǎng)基，37℃搖瓶培養(yǎng)；產(chǎn)堿假單胞菌、熒光假單胞菌、石油假單胞菌：LB培養(yǎng)基，30℃搖瓶培養(yǎng)；鼠傷寒沙門氏菌：BHI培養(yǎng)基，37℃搖瓶培養(yǎng)；空腸彎曲桿菌：BHI液體培養(yǎng)基，MH固體培養(yǎng)基，37℃(5%CO2)培養(yǎng)；嗜酸乳桿菌：MRS培養(yǎng)基，37℃(5%CO2)靜置培養(yǎng)；胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K：上海生工生物工程有限公司。

從市售泡菜、家庭自制泡菜、發(fā)酵香腸、天然奶疙瘩(新疆)、天然發(fā)酵酸奶等發(fā)酵食品中取樣加到20mLMRS液體培養(yǎng)基中，37℃(5%CO2)靜置富集培養(yǎng)12h。用磷酸鹽緩沖液(pH7.0)按梯度稀釋培養(yǎng)液，涂布于添加0.5%CaCO3的MRS平板，37℃(5%CO2)靜置培養(yǎng)48h。挑選有溶鈣圈、表面光滑或稍粗糙、不透明、乳白或灰白色、有光澤的單菌落劃線分離到MRS固體培養(yǎng)基上。48h后，選取革蘭陽性、無芽孢、桿狀菌(乳酸桿菌)進(jìn)行培養(yǎng)和保藏。

挑取上述產(chǎn)生溶鈣圈的乳酸桿菌點種在MRS固體培養(yǎng)基的平板上，37℃(5%CO2)靜置培養(yǎng)24h。然后將培養(yǎng)好的指示菌(大腸桿菌、產(chǎn)堿假單胞菌，107cfu/mL)與軟瓊脂(含瓊脂0.75%~0.8%)培養(yǎng)基按1:100(v/v)混勻，倒在含乳酸桿菌的平板上。適宜溫度下培養(yǎng)過夜，篩選可產(chǎn)生抑菌圈的乳酸桿菌。將具有抑菌效果的乳酸桿菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃(5%CO2)靜置培養(yǎng)24h，離心(8000r/min，4℃)15min取上清液，經(jīng)0.22μm濾膜過濾后置于4℃冰箱保存。復(fù)篩平板底層為2%(w/v)素瓊脂培養(yǎng)基。指示菌為大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、產(chǎn)堿假單胞菌、熒光假單胞菌、石油假單胞菌、鼠傷寒沙門氏菌和空腸彎曲桿菌。將培養(yǎng)好的指示菌(107cfu/mL)按1:100(菌液:軟瓊脂體積比)混勻后傾倒在放有牛津杯的底層培養(yǎng)基上。待凝固后取出牛津杯，在孔中加入100μL乳酸桿菌發(fā)酵上清液，在適宜溫度下培養(yǎng)12~16h，測量抑菌圈直徑。提取乳酸桿菌的全基因組，用16SrDNA的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序(上海生工生物工程有限公司)。將得到的序列通過BLAST在NCBI中進(jìn)行序列同源性比對。

將菌株在產(chǎn)胞外多糖培養(yǎng)基上接種后于37℃(5%CO2)靜置培養(yǎng)24h，用接種針挑取菌落觀察是否有拉絲現(xiàn)象。將培養(yǎng)基培養(yǎng)24h的培養(yǎng)物，離心后用磷酸鹽緩沖液懸浮菌體。將菌體接種到耐鹽性檢測培養(yǎng)基中，于37℃(5%CO2)靜置培養(yǎng)24h，以MRS空白培養(yǎng)基作為空白對照，測定600nm下的OD值，比較菌株的生長情況。將磷酸鹽緩沖液懸浮后的菌體接種到耐硝酸鹽檢測培養(yǎng)基中，于37℃(5%CO2)靜置培養(yǎng)24h，以MRS空白培養(yǎng)基作為空白對照，測定600nm下的OD值，比較生長情況。將懸浮后的菌體穿刺接種于含有溴甲酚紫的軟瓊脂柱中，置于37℃(5%CO2)靜置培養(yǎng)24h，觀察變色情況。軟瓊脂柱顏色由紫色變?yōu)辄S色說明產(chǎn)酸。在不含溴甲酚紫的軟瓊脂柱中穿刺接種后，在上面加蓋一層約5mm厚的2%瓊脂。若軟瓊脂柱內(nèi)產(chǎn)生氣泡或2%瓊脂被頂向上的現(xiàn)象，說明有氣體產(chǎn)生。將菌株接種于含有精氨酸溶液的PY培養(yǎng)基中，并將接種于不含精氨酸的PY培養(yǎng)基作為對照，37℃(5%CO2)靜置培養(yǎng)48h。離心后取上清液，向上清液中加入數(shù)滴奈氏試劑，若出現(xiàn)橙黃色或黃褐色沉淀，說明產(chǎn)氨。

將菌株劃線接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃(5%CO2)靜置培養(yǎng)24h，將過氧化氫快速檢測試紙條沒入發(fā)酵液1s后取出，10s后觀察變色情況。通過顏色比對判定是否有H2O2產(chǎn)生。將菌株接種于V-P反應(yīng)培養(yǎng)基中，空白培養(yǎng)基作為對照，37℃(5%CO2)靜置培養(yǎng)24h后，向培養(yǎng)液中加入40%(w/v)KOH溶液10~20滴，再加入等量的5%(w/v)α-萘酚溶液，混勻后于沸水浴加熱2min，若出現(xiàn)紅色則為陽性。將菌株穿刺接種于產(chǎn)H2S檢測培養(yǎng)基中，未接種的培養(yǎng)基作為空白對照，37℃(5%CO2)靜置培養(yǎng)24h。若有黑色物質(zhì)產(chǎn)生，說明有H2S生成。培養(yǎng)基中，37℃(5%CO2)靜置培養(yǎng)48h，在培養(yǎng)液中加入格里斯試劑，若溶液變?yōu)榉奂t色、玫瑰紅色、橙色或棕色則表示硝酸鹽被還原為亞硝酸鹽，反應(yīng)為陽性，否則為陰性。將接種的石蕊牛奶培養(yǎng)基置于37℃培養(yǎng)24~72h，觀察石蕊牛奶產(chǎn)酸和凝固反應(yīng)。若石蕊牛奶變?yōu)榧t色，則有酸產(chǎn)生，當(dāng)酸度很高時，可使牛奶凝固。將菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，置于37℃培養(yǎng)72h，以嗜酸乳桿菌ATCC4356作為對照，每隔12h取樣測定pH，觀察pH變化情況。將菌株接種于含有不同氨基酸的生物胺檢測培養(yǎng)基中，37℃(5%CO靜置培養(yǎng)48~72h，觀察顯色情況。若培養(yǎng)基由棕黃色變?yōu)樽仙?，則說明有生物胺產(chǎn)生，并且每種氨基酸都有對應(yīng)的生物胺(組氨酸、色氨酸、酪氨酸、精氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、鳥氨酸分別對應(yīng)組胺、色胺、酪胺、精胺或亞精胺、尸胺、苯乙胺、腐胺)。

從5種食品樣品中共分離到產(chǎn)生溶鈣圈以及外觀符合乳酸桿菌特征的菌株共169株。以大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、產(chǎn)堿假單胞菌、熒光假單胞菌、石油假單胞菌、空腸彎曲桿菌和鼠傷寒沙門氏菌為指示菌，從家庭自制泡菜中篩選到一株對7株指示菌都具有抑菌作用的乳酸桿菌BBE-H3。經(jīng)過16SrDNA序列測序和比對，鑒定出該菌株為棒狀乳桿菌(Lactobacilluscoryniformis)，命名為棒狀乳桿菌BBE-H3。

對棒狀乳桿菌BBE-H3主要發(fā)酵特性的檢測結(jié)果如表2所示，棒狀乳桿菌BBE-H3具有典型的乳酸菌發(fā)酵特性，并且在7種生物胺檢測培養(yǎng)基中，無相應(yīng)生物胺產(chǎn)生。乳桿菌ATCC4356在發(fā)酵12h后，其發(fā)酵液的pH變化曲線基本平衡?？梢姡魻钊闂U菌BBE-H3產(chǎn)酸速度與嗜酸乳桿菌ATCC4356基本接近，其培養(yǎng)24h后的產(chǎn)酸能力好于嗜酸乳桿菌ATCC4356。

本研究從家庭自制泡菜中篩選到一株對革蘭陰性菌如大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、空腸彎曲桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、產(chǎn)堿假單胞菌、熒光假單胞菌和石油假單胞菌具有抑制作用的棒狀乳桿菌BBE-H3。對棒狀乳桿菌BBE-H3的發(fā)酵特性考察結(jié)果表明，棒狀乳桿菌BBE-H3具有典型的乳酸菌發(fā)酵特性，可耐受8%NaCl和400mg/L的亞硝酸鹽，并且不發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)氣，不產(chǎn)生物胺、不水解精氨酸產(chǎn)氨、不產(chǎn)H2O2和H2S等影響食品品味的物質(zhì)，產(chǎn)酸性能好，具有作為發(fā)酵食品安全生產(chǎn)菌株的應(yīng)用前景。