堅(jiān)定的錫兵精選(九篇)

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第1篇：堅(jiān)定的錫兵范文

劉某于2006年經(jīng)老鄉(xiāng)介紹來(lái)到了山西省某縣的一家煤礦公司當(dāng)了一名井下工人。雖說(shuō)下井又累又危險(xiǎn)，但每個(gè)月四五千的工資，干別的是不可能掙到的，劉某也沒(méi)啥技術(shù)，他就想趁著還有把子力氣，多攢點(diǎn)錢供孩子上學(xué)。2011年12月的一天晚上，正在井下的工作面打錨桿時(shí)，劉某的衣服不慎絞在了鉆桿上，還沒(méi)等他反應(yīng)過(guò)來(lái)，錨頭已經(jīng)重重打到了胸脯上。劉某當(dāng)時(shí)就覺(jué)得胸疼得厲害，井下的班長(zhǎng)趕緊讓其他人扶著他升井，然后送到了就近的煤礦醫(yī)院。經(jīng)診斷，劉某右側(cè)第八肋軟骨骨折。當(dāng)時(shí)公司支付了住院期間的醫(yī)療費(fèi)，劉某聽(tīng)別人說(shuō)還應(yīng)該有別的賠償，但他還想繼續(xù)在公司上班，因此沒(méi)有向公司提出賠償。劉某繼續(xù)上班后，胸部一直疼的厲害，自己買了止疼藥也沒(méi)管用，他覺(jué)得奇怪，按照醫(yī)生的說(shuō)法，他現(xiàn)在恢復(fù)的還不錯(cuò)，應(yīng)該不至于這么疼了，劉某有點(diǎn)擔(dān)心，就自己來(lái)到了醫(yī)院又做了次檢查，診斷結(jié)果為：肺大泡、肺氣腫。醫(yī)生一看檢查結(jié)果，就問(wèn)他是干什么的，得知?jiǎng)⒛骋恢痹诰鹿ぷ鳎t(yī)生就說(shuō)該病很可能是因?yàn)殚L(zhǎng)期在井下吸入有害氣體所致，如果再發(fā)展下去那就是矽肺病了。原本以為下井工作就是累點(diǎn)臟點(diǎn)，有危險(xiǎn)也是瓦斯爆炸、塌方和透水等事故，沒(méi)想到還有矽肺病。醫(yī)生說(shuō)這個(gè)病很嚴(yán)重，如果不及時(shí)治療會(huì)有生命危險(xiǎn)?；氐焦竞螅瑒⒛尘腿フ夜绢I(lǐng)導(dǎo)，提出給自己治療，卻遭到了領(lǐng)導(dǎo)的拒絕。無(wú)奈之下，劉某在工友的指點(diǎn)下，來(lái)到了農(nóng)民工工作站求助。

律師了解情況后，告訴劉某，他肋骨受傷和肺部的職業(yè)病都屬于工傷，但由于傷害的性質(zhì)不一樣，所以需要分別處理。律師首先整理好相關(guān)材料后向社會(huì)保障局提出了工傷認(rèn)定，要求認(rèn)定劉某肋骨骨折為工傷；至于職業(yè)病的工傷認(rèn)定，需要先經(jīng)過(guò)職業(yè)病診斷才行。由于劉某當(dāng)時(shí)肋骨受傷有很多工人在場(chǎng)，公司為他支付了醫(yī)療費(fèi)，對(duì)受傷的事實(shí)也不否認(rèn)，因此劉某肋骨骨折的工傷認(rèn)定很快就做出了。拿到工傷認(rèn)定書(shū)后，劉某卻一點(diǎn)也高興不起來(lái)，因?yàn)榇藭r(shí)他的肋骨骨折已經(jīng)基本痊愈，但肺部的毛病卻越來(lái)越嚴(yán)重，而此時(shí)他還不知道自己該去哪里做職業(yè)病診斷。律師四處打聽(tīng)后，得知山西省職業(yè)病醫(yī)院可以做職業(yè)病診斷，律師就幫助劉某將材料遞交給了醫(yī)院，但醫(yī)院檢查后認(rèn)為劉某缺少有關(guān)勞動(dòng)關(guān)系、工種、工作崗位等單位證明，因此拒絕為其作職業(yè)病診斷。律師提出，劉某肋骨骨折已經(jīng)確認(rèn)了工傷，工傷證上也表明了他的工作單位，勞動(dòng)關(guān)系已經(jīng)認(rèn)定，為什么不能做職業(yè)病診斷？但醫(yī)院方面認(rèn)為，除了確認(rèn)目前的勞動(dòng)關(guān)系外，用人單位必須要出具工種、工作時(shí)間等具體工作資料。劉某很失望，這些東西自己哪能拿的來(lái)?。柯蓭熆紤]后，提出一方面讓他繼續(xù)就肋骨骨折申請(qǐng)勞動(dòng)能力鑒定；另一方面，則向勞動(dòng)仲裁委提出申請(qǐng)，要求確認(rèn)他與公司的勞動(dòng)關(guān)系、工種、工作崗位及時(shí)間。很快，劉某肋骨骨折經(jīng)鑒定為九級(jí)傷殘，而仲裁委經(jīng)審理后也做出了裁決書(shū)：確認(rèn)了劉某與公司存在勞動(dòng)關(guān)系，并對(duì)其工作崗位和工作時(shí)間也做出了認(rèn)定。收到仲裁裁決書(shū)后，律師整理了材料再次遞交給了職業(yè)病醫(yī)院。醫(yī)院做出了職業(yè)病診斷，確認(rèn)劉某為煤工塵肺一期。根據(jù)這一診斷證明，社會(huì)保障局做出了工傷認(rèn)定，確認(rèn)劉某所患的職業(yè)病為工傷。原本以為沒(méi)辦法的事，在律師的幫助下柳暗花明竟然拿到了工傷證。劉某這下有信心了，在律師的幫助下討要自己應(yīng)得的賠償。

律師提醒：職業(yè)病是工傷的一種情形，但申請(qǐng)工傷認(rèn)定前，必須先經(jīng)過(guò)有資質(zhì)的醫(yī)療機(jī)構(gòu)進(jìn)行職業(yè)病診斷，而職業(yè)病診斷需要?jiǎng)趧?dòng)關(guān)系、工作崗位、工作時(shí)間等資料。農(nóng)民工朋友若認(rèn)為自己可能患職業(yè)病，就要先收集相關(guān)證據(jù)，尤其是確認(rèn)勞動(dòng)關(guān)系的證據(jù)。

摘自《農(nóng)民工法律援助中心》

第2篇：堅(jiān)定的錫兵范文

關(guān)鍵詞：專業(yè)性 科學(xué)性 嚴(yán)謹(jǐn)性

隨著人們生活水平的提升，越來(lái)越多的社會(huì)群眾開(kāi)始關(guān)注醫(yī)療事業(yè)的發(fā)展情況，但從數(shù)據(jù)上來(lái)說(shuō)，醫(yī)療糾紛發(fā)生頻率有逐年上升趨勢(shì)，其中涉及到病患死亡的醫(yī)療糾紛的社會(huì)影響比過(guò)去更加強(qiáng)烈。法醫(yī)病理鑒定能夠快速、直接地查明病患死亡原因，明確醫(yī)療糾紛中雙方責(zé)任的同時(shí)提供最有力的科學(xué)證據(jù)，對(duì)解決醫(yī)療糾紛具有重要意義。

一、法醫(yī)病理學(xué)鑒定內(nèi)容

首先，通過(guò)法醫(yī)病理學(xué)鑒定，對(duì)病患死亡原因進(jìn)行確認(rèn)。通過(guò)科學(xué)化的鑒定方法，將病患體內(nèi)多處損傷、多種外傷進(jìn)行分類，從而對(duì)致死傷進(jìn)行精確定位。

其次，對(duì)致死的傷患部位確定后，就可以進(jìn)一步對(duì)死亡原因進(jìn)行病理學(xué)上分析，進(jìn)而明確死亡原因。將死亡原因和死亡機(jī)制分析清楚，對(duì)接下來(lái)的醫(yī)患事故原因分析和醫(yī)療糾紛責(zé)任歸咎提供一定的信息支持。

此外，醫(yī)療糾紛一旦需要進(jìn)行司法鑒定，簡(jiǎn)單的死亡原因確認(rèn)和醫(yī)患事故原因分析是遠(yuǎn)不能解決糾紛的根本問(wèn)題的。而法醫(yī)病理學(xué)方面的鑒定可以將醫(yī)療過(guò)程中的某些具體細(xì)節(jié)進(jìn)行確認(rèn)，對(duì)醫(yī)患事故產(chǎn)生的原因進(jìn)行細(xì)致分析，判斷醫(yī)療單位是否存在過(guò)失、過(guò)失有多少，還是病患接受治療時(shí)間太晚而錯(cuò)失治療時(shí)機(jī)等。

二、法醫(yī)病理學(xué)鑒定的優(yōu)勢(shì)

（一）比一般醫(yī)學(xué)鑒定在程序上更具優(yōu)勢(shì)。一般的醫(yī)療糾紛發(fā)展到后期階段都會(huì)上升到民事訴訟階段，而相應(yīng)的民事訴訟中有時(shí)會(huì)有司法鑒定請(qǐng)求，這種時(shí)候由一般的醫(yī)學(xué)鑒定機(jī)構(gòu)進(jìn)行尸檢在程序上不具合法性，在結(jié)果上不具權(quán)威性，而專業(yè)的法醫(yī)病理學(xué)鑒定能夠直接參與到民事訴訟中的司法鑒定程序中，其程序上具備合理性，并且法醫(yī)尸檢的程序比一般醫(yī)學(xué)鑒定程序嚴(yán)格、內(nèi)容也更加全面，因此其鑒定結(jié)果更具專業(yè)性。

（二）比一般醫(yī)學(xué)鑒定的結(jié)果更具針對(duì)性且更加準(zhǔn)確。法醫(yī)鑒定人員都進(jìn)行過(guò)專業(yè)的病理學(xué)學(xué)習(xí)，并且法醫(yī)鑒定人員學(xué)習(xí)的醫(yī)學(xué)鑒定技術(shù)更具專業(yè)指向，是專門為司法鑒定進(jìn)行證據(jù)服務(wù)的鑒定。且法醫(yī)比一般醫(yī)科人員接觸尸體的時(shí)間更多，因此比一般醫(yī)科人員更加了解尸體的一些特征、特性和變化規(guī)律，因此尸檢結(jié)果更具準(zhǔn)確性。

（三）比一般醫(yī)學(xué)鑒定更加嚴(yán)格。這里的嚴(yán)格指的是人員上的嚴(yán)格和結(jié)果上的責(zé)任概念。法醫(yī)鑒定人員是專職人員，法醫(yī)人員接受過(guò)專業(yè)化培訓(xùn)，具備更高的職業(yè)素質(zhì)，并且專門的管理部門，只在有法醫(yī)鑒定需求時(shí)參與尸體鑒定。因此不容易受到社會(huì)勢(shì)力或是輿論方面的干擾，并且鑒定條件要求、流程要求更加嚴(yán)格，從而能夠?qū)κw鑒定結(jié)果做到負(fù)責(zé)。

三、法醫(yī)病理學(xué)鑒定的重要性

（一）解決醫(yī)療糾紛的要求

很多醫(yī)療糾紛由一般醫(yī)學(xué)鑒定組織來(lái)進(jìn)行尸體鑒定的相關(guān)操作，其結(jié)果很難達(dá)到“服眾”的效果，反而可能使醫(yī)院或進(jìn)行鑒定的醫(yī)療組織陷入輿論危機(jī)、信譽(yù)危機(jī)等。而能夠進(jìn)行法醫(yī)鑒定的病理學(xué)組織的成員都是經(jīng)過(guò)專業(yè)化訓(xùn)練，受專門部門管理，其團(tuán)隊(duì)的的專業(yè)性和個(gè)人素質(zhì)并非一般病理學(xué)組織可以相比。因此由法醫(yī)組織對(duì)尸體進(jìn)行病理學(xué)鑒定不僅能夠在結(jié)果上更加精確，而且更具權(quán)威，能夠在醫(yī)療糾紛的司法鑒定過(guò)程中通過(guò)責(zé)任的明確，過(guò)失程度的確認(rèn)的方式對(duì)醫(yī)療糾紛的決絕起到?jīng)Q定性的作用。

（二）醫(yī)學(xué)自身的要求

首先，醫(yī)學(xué)發(fā)展需要對(duì)各種各樣的致死原因、死亡機(jī)制就行嚴(yán)格準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)、信息統(tǒng)計(jì)，進(jìn)而可以對(duì)這些致死原因、死亡機(jī)制進(jìn)行研究，了解人類死亡過(guò)程中的一些醫(yī)學(xué)學(xué)理上、病理學(xué)上的變化過(guò)程，這是醫(yī)學(xué)發(fā)展的需求。

其次，醫(yī)學(xué)本身具備嚴(yán)謹(jǐn)性的要求，而醫(yī)療糾紛中責(zé)任混亂，明確尸體死亡原因、機(jī)制，弄清楚尸體生前的各種病理現(xiàn)象和原因是醫(yī)學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)性的要求之一，此外分清醫(yī)療責(zé)任是醫(yī)學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)性的另一要求。

（三）醫(yī)學(xué)發(fā)展的要求

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的進(jìn)步發(fā)展，相應(yīng)的科教文衛(wèi)事業(yè)也要相應(yīng)發(fā)展，其中群眾對(duì)衛(wèi)生事業(yè)的發(fā)展需求增長(zhǎng)速度最快。

法醫(yī)病理學(xué)的尸體鑒定能夠?qū)σ恍┮呻y情況下產(chǎn)生的醫(yī)療糾紛原因有一個(gè)理性的鑒定結(jié)果，還原尸體還處于活體狀態(tài)時(shí)的身體狀態(tài)的具體情況，進(jìn)而產(chǎn)生與尸體相關(guān)的病理學(xué)認(rèn)識(shí)，為以后的醫(yī)學(xué)實(shí)踐和醫(yī)學(xué)發(fā)展進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)的積累，進(jìn)而促進(jìn)相關(guān)的醫(yī)療事業(yè)的發(fā)展和醫(yī)用器械、醫(yī)療科學(xué)的進(jìn)步和發(fā)展。

（四）司法鑒定程序的要求

大多數(shù)涉及到民事賠償責(zé)任的醫(yī)療糾紛都會(huì)進(jìn)行司法鑒定程序，而司法鑒定程序需要由一支專業(yè)素質(zhì)較強(qiáng)、責(zé)任感出眾的病理學(xué)鑒定團(tuán)隊(duì)來(lái)執(zhí)行。如果由一般的病理學(xué)醫(yī)學(xué)組織來(lái)進(jìn)行相關(guān)的尸體鑒定，科學(xué)性和結(jié)果的準(zhǔn)確性就難以保證。而準(zhǔn)確性不足的尸檢結(jié)果對(duì)司法仲裁來(lái)說(shuō)是不足以成為證據(jù)，甚至?xí)蔀樽璧K司法審判的錯(cuò)誤信息，從而影響審判公平原則，極不利于建立法律權(quán)威。長(zhǎng)久以往將會(huì)阻礙我國(guó)法制社會(huì)建設(shè)進(jìn)程。

四、結(jié)語(yǔ)

法醫(yī)病理學(xué)的尸檢對(duì)還原尸體病理現(xiàn)象，致死原因、死亡機(jī)制的病理學(xué)變化有重要意義，是促進(jìn)醫(yī)學(xué)、病理學(xué)發(fā)展的重要內(nèi)容和環(huán)節(jié)。并且，法醫(yī)病理學(xué)尸檢還對(duì)司法審判有重要意義，司法審判中很多賠償責(zé)任的確定都需要法醫(yī)病理學(xué)尸檢結(jié)果提供信息和證據(jù)支持。綜合來(lái)說(shuō)，我國(guó)的法醫(yī)病理學(xué)正處于發(fā)展階段，在未來(lái)的時(shí)間內(nèi)，法醫(yī)病理學(xué)的發(fā)展方向應(yīng)當(dāng)更加大眾化更加普及。

參考文獻(xiàn)：

[1]宋國(guó)建，范少罡.當(dāng)法醫(yī)病理鑒定遭遇穆斯林風(fēng)俗習(xí)慣時(shí)[J].中國(guó)司法鑒定，2012，（06）.

[2]陳曉峰.法醫(yī)病理鑒定參與醫(yī)療糾紛尸檢的重要性及常見(jiàn)問(wèn)題防范[J].中國(guó)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)管理，2015，（26）.

[3]李良賢，張建軍.老年人肺動(dòng)脈栓塞猝死病例栓塞形成的高危因素及法醫(yī)病理鑒定特點(diǎn)[J].法制博覽，2015，（25）.

第3篇：堅(jiān)定的錫兵范文

的依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 乙型肝炎病毒；DNA定量檢測(cè)；關(guān)系

為了探討乙型肝炎病毒 DNA的定量檢測(cè)和臨床的關(guān)系 ， 本次研究選取 2010年 6月 ～2012年 6月期間來(lái)河南省宜陽(yáng)縣人民醫(yī)院肝病專科就診的 128例患者的臨床資料進(jìn)行回顧性分析 ， 所選取的患者均通過(guò) ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) ）來(lái)檢測(cè)乙型肝炎的病毒血清標(biāo)志物 ， FQ-PCR（熒光定量聚合酶連反應(yīng) ）來(lái)檢測(cè) HBV-DNA的含量?，F(xiàn)將大致研究結(jié)果報(bào)告如下。 1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取 2010年 6月至 2012年 6月期間來(lái)本院肝病?？凭驮\的128例患者， 其中男73例， 女55例， 年齡在 12～76歲之間 ， 平均 （34.8±14.5）歲 ， 所選取的患者都符合病毒性肝炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)。且各類型的肝炎患者之間的資料沒(méi)有明顯的差異， 結(jié)果具有可比性。

1. 2 檢測(cè)的儀器和試劑 HBV血清檢測(cè)標(biāo)志物檢測(cè)試劑盒和 HBV核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)試劑盒；熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）分析儀均產(chǎn)自上海科華生物技術(shù)公司。

1. 3 方法 在患者晨起空腹時(shí)抽取 5 ml靜脈血 ， 將血清離心分裝在 -20℃下保存?zhèn)溆?。然后通過(guò) ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) ）來(lái)檢測(cè)乙型肝炎的病毒血清標(biāo)志物 ， 操作步驟按照試劑盒的規(guī)定進(jìn)行。通過(guò) FQ-PCR（熒光定量聚合酶連反應(yīng) ）來(lái)檢測(cè) HBV-DNA的含量 ， 每一次檢驗(yàn)都設(shè)立強(qiáng)陽(yáng)性、弱陽(yáng)性以及陰性作為內(nèi)標(biāo) ， 將四個(gè)已經(jīng)通過(guò)的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品作為外標(biāo)。在進(jìn)行檢測(cè)時(shí)做好室內(nèi)的質(zhì)控。

1. 4 觀測(cè)的指標(biāo) 觀測(cè)患者血清學(xué)的診斷指標(biāo)和 HBV?DNA的陽(yáng)性率以及定量檢測(cè)的結(jié)果情況；血清學(xué)的診斷分組：第一組為HBcAb、HBeAg、HBsAg， 第二組為HBcAb、HBeAg、HBsAg， 第三組為HBeAg、HBsAg， 第四組為HBcAb、HBsAg， 第五組為HBeAb、HBcAb、HBsAb， 第六組為HBcAb、HBeAb， 第七組為 HBsAb以及全陰。

1. 5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理， 以 P

2 結(jié)果

128例患者血清學(xué)的診斷指標(biāo)和 HBV-DNA的陽(yáng)性率以及定量檢測(cè)的結(jié)果情況， 詳見(jiàn)表1。

3 討論

近幾年 ，發(fā)展了多種準(zhǔn)確的、敏感的、先進(jìn)的用于 HBV?DNA定量檢測(cè)的方法 ， 根據(jù)其原理主要有酶標(biāo)記探針 PCR技術(shù)和熒光標(biāo)記探針的 PCR技術(shù)。后者省時(shí) ， 自動(dòng)化的程度高 ， 而且可以免除 PCR后處理的步驟 ， 減少了 PCR產(chǎn)物對(duì)環(huán)境的污染， 現(xiàn)在已經(jīng)成為了 HBV-DNA定量檢測(cè)的主要方法。采用該方法對(duì) HBV-DNA進(jìn)行定量檢測(cè)的范圍為 3～8， 如果檢測(cè)的值比最低的檢測(cè)水平 -3低 ， 將結(jié)果判斷為陰性。在進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)時(shí) ， 將陰性的結(jié)果忽略不計(jì)或者計(jì)算為 0， 而求得 HBV-DNA對(duì)數(shù)的平均值的計(jì)算結(jié)果 ， 這種方法是不合理的。如果要合理的反映不同類型的乙型肝炎病毒患者體內(nèi)的HBV-DNA的含量 ， 應(yīng)該采用中位數(shù)的差異 H來(lái)進(jìn)行 HBV?DNA的含量比較。

我國(guó)現(xiàn)在屬于乙型肝炎大國(guó) ， 發(fā)病率在全世界排在前幾位。有研究表明 ， HBsAg的流行率大約為 9.75%， 當(dāng)人體感染了乙型肝炎病毒之后會(huì)出現(xiàn)不同的癥狀以及臨床表現(xiàn)。HBeAg呈陽(yáng)性表示患者體內(nèi)的乙型肝炎病毒在活躍的復(fù)制 ， 表明其具有很強(qiáng)的傳染性[2]。HBcAb、HBeAg、HBsAg的HBV-DNA的陽(yáng)性率為 98.6%， ， HBeAg、HBsAg為 100%， 說(shuō)明本組患者的 HBeAg陽(yáng)性血清指標(biāo)的模式組主要為第一組和第三組 ， 而且其 HBV-DNA的陽(yáng)性率以及 HBV-DNA的定量都比其他各組要高， 說(shuō)明 HBeAg有可能與 HBV-DNA的含量之間存在一定的正相關(guān)性[3]。HBcAb、HBeAg、HBsAg為

25.2%， HBV-DNA 的對(duì)數(shù)的平均值為 （5.03±1.86）， HBcAb、HBsAg為20%， HBV-DNA 的對(duì)數(shù)的平均值為（6.28±0.48）， 說(shuō)明當(dāng) e系統(tǒng)的抗原陰轉(zhuǎn)時(shí) ， HBV-DNA還是有可能被檢測(cè)到 ， 雖然其含量比第一組和第三組低。HBeAb、HBcAb、HBsAb為 14.5%， HBV-DNA 的對(duì)數(shù)的平均值為 （3.54±0.45）， 說(shuō)明HBsAb是一種保護(hù)性的抗體。

綜上所述 ， 各種類型的乙型肝炎患者都有一定程度HBV-DNA復(fù)制 ， HBeAg的陽(yáng)性患者其 HBV-DNA的水平最高 ， 將 HBV-DNA和 HBeAg定量聯(lián)合進(jìn)行診斷 ， 可以為早期的乙型肝炎篩查以及治療提供可靠的依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]李金明 . 乙型肝炎病毒血清標(biāo)志物測(cè)定及結(jié)果解釋的若干問(wèn)題 .中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志 ， 2006，29（5）：385.

第4篇：堅(jiān)定的錫兵范文

目前，生產(chǎn)上對(duì)黃瓜白粉病的防治以化學(xué)藥劑（唑類殺菌劑）為主，但隨著化學(xué)藥劑的長(zhǎng)期大量使用，白粉病菌對(duì)化學(xué)藥劑的抗性逐年增強(qiáng)1，并且化學(xué)藥劑在瓜條內(nèi)的農(nóng)藥殘留直接威脅著人類健康。國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究表明生防微生物對(duì)黃瓜白粉病菌也具有較好的抑制作用，但相關(guān)研究正處于實(shí)驗(yàn)室研究階段。本研究旨在從土壤中分離篩選出對(duì)黃瓜白粉病具有明顯防效的生防菌株，為黃瓜白粉病的安全防治提供優(yōu)良的生物資源，服務(wù)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。 

1材料與方法 

1.1材料 

土樣：采自天津西青、靜海、武清黃瓜溫室根際土壤，共28份。 

病原菌：黃瓜白粉病菌（Erysiphe cucurbitacearum）、黃瓜灰霉病菌（Botrytis cinerea）。 

1.2拮抗細(xì)菌的分離與室內(nèi)篩選 

土壤細(xì)菌的分離：稱量土壤樣品10 g，加入到裝有100 mL水的三角瓶中，搖床振蕩培養(yǎng)（160 r/min）30 min。將土壤懸浮液系列稀釋至10-1～10-6，取稀釋濃度為10-4和10-5各100 μL涂至LB平板上，37℃培養(yǎng)24 h。 挑取不同形狀的單菌落于LB斜面上，37℃培養(yǎng)24 h后4℃冰箱保存。 

拮抗細(xì)菌的室內(nèi)篩選：采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法測(cè)定分離出的細(xì)菌菌株對(duì)黃瓜灰霉病菌的抑制作用。待對(duì)照長(zhǎng)滿平皿時(shí)測(cè)量菌落生長(zhǎng)直徑，計(jì)算菌株的拮抗率。將拮抗率60%以上的菌株保存于20%甘油的凍存管中。 

1.3溫室盆栽防治試驗(yàn) 

拮抗細(xì)菌發(fā)酵液的制備：將拮抗性良好的菌株轉(zhuǎn)接在LB平板上活化24 h后接種至LB液體培養(yǎng)基中，恒溫?fù)u床培養(yǎng)48 h（28℃，160 r/min），制成菌體含量為108 cfu/mL的菌體發(fā)酵液原液。 

盆栽防治試驗(yàn)：營(yíng)養(yǎng)缽中播種黃瓜（品種為津優(yōu)3號(hào)），黃瓜白粉病發(fā)病初期將拮抗細(xì)菌發(fā)酵原液2倍稀釋液均勻噴灑在黃瓜葉片上，間隔1周后噴施第二次。每處理10株幼苗，重復(fù)3次，以噴灑清水處理為對(duì)照。第二次噴藥1周后分級(jí)調(diào)查黃瓜白粉病的發(fā)病情況2，計(jì)算拮抗細(xì)菌的防治效果。 

1.4拮抗菌株鑒定 

1.4.1形態(tài)鑒定觀察菌落的形態(tài)、顏色、邊緣、透明度、凹凸度等，革蘭氏染色觀察菌體形態(tài)。 

1.4.2生理生化鑒定細(xì)菌的生理生化特性（革蘭氏染色、芽孢染色、檸檬酸鹽的利用等）分析參照植物病原細(xì)菌鑒定試驗(yàn)指導(dǎo)（第三版）3～6。 

1.4.316s rDNA分子鑒定采用Lysis方法提取防效好的菌株基因組DNA，以原核生物16S rDNA保守序列通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（50 μL）為：模板DNA 1 μL，Taq Buffer 25 μL，引物P0和P1各1 μL，用雙蒸水補(bǔ)足至50 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 5 min；94℃ 30 s，51℃ 30 s，72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后，通過(guò)Blast程序?qū)υ撔蛄泻虶enBank中已登錄的16S rDNA序列進(jìn)行同源性比較。 

2結(jié)果與分析 

2.1拮抗細(xì)菌的分離與篩選 

第5篇：堅(jiān)定的錫兵范文

關(guān)鍵詞：南酸棗；內(nèi)生細(xì)菌；芒果炭疽病菌；防治效果

中圖分類號(hào)：Q939.95文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：0439-8114（2014）10-2398-03

Identification of Choerospondias axillaris Endophytic Bacterial Strain WYG5 and Its Effects on Preservating Postharvest Mango

WU Jia-fei，LI Xiao-yu，F(xiàn)AN Yong-mei，LIU Zhi-qiang

（College of Environment and Plant Protection，Hainan University，Haikou 570228，China）

Abstract：Strain WYG4，isolated from Choerospondias axi11aris（Roxb1） Burttet Hill，had higher antagonistic effects against Colletotrichum gloeosporioides， with antagonistic activity of 32% in plate. According to its morphological，physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence，the strain WYG5 was identified as Bacillus megaterium. Its fermentation broth and fermentation filtrate had obvious effects on preservating postharvest mango. After 9 d and 12 d treatment，the controlling effects were up to 60.76%， 59.50% and 43.59%，34.19%， respectively.

Key words：Choerospondias axillaris； endophytic bacteria； Colletotrichum gloeosporioides； control effect

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31160377）；國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAK01B05）

南酸棗（Choerospondias axillaris）為漆樹(shù)科南酸棗屬落葉大喬木，多年生，又名五眼果、酸棗樹(shù)、山棗子等，主要分布于云南、廣東、廣西、湖南、湖北、江西、福建、浙江、貴州等地區(qū)[1]，其樹(shù)皮和果實(shí)可以入藥，樹(shù)皮主治瘡瘍、湯火傷、陰囊濕疹；鮮果則消食滯，治食滯腹痛；果核醒酒解毒，治風(fēng)毒起疙瘩成瘡或瘍癰[2]。

植物內(nèi)生菌是指在其生活史的一定階段生活在活體植物組織內(nèi)，而不引起植物明顯病害的微生物[3]。許多研究表明植物中的內(nèi)生細(xì)菌對(duì)宿主具有抗病促生的能力，作為生物菌劑在生物防治方面和促進(jìn)植物生長(zhǎng)方面有著重要的應(yīng)用價(jià)值[4，5]。試驗(yàn)從南酸棗體內(nèi)分離出一株內(nèi)生細(xì)菌WYG5，發(fā)現(xiàn)其對(duì)芒果炭疽病菌具有較好的拮抗效果，利用常規(guī)方法結(jié)合16S rDNA序列分析對(duì)該菌株進(jìn)行了鑒定，并測(cè)定了其對(duì)采后芒果的保鮮防病效果，為其今后應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試材料南酸棗采自海南大學(xué)儋州校區(qū)，內(nèi)生細(xì)菌WYG5從南酸棗中經(jīng)組織表面消毒分離獲得。芒果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides Penz）由海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院提供，芒果品種為臺(tái)農(nóng)l號(hào)。

1.1.2培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母粉 5 g，NaCl 10 g，去離子水1 L；PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 20 g，去離子水1 L。

1.2方法

1.2.1菌株培養(yǎng)菌株WYG5經(jīng)活化后接入LB培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)2 d，收集發(fā)酵液，12 000 r/min離心5 min，將上清液利用0.22 μm的濾膜除菌過(guò)濾，得到發(fā)酵濾液。

1.2.2 菌株WYG5的鑒定采用常規(guī)鑒定方法進(jìn)行[6]。菌株基因組DNA利用Bacterial DNA Kit（50）試劑盒提取，利用16S rDNA通用引物（5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′，5′-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進(jìn)行基因擴(kuò)增，由上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，將所測(cè)序列在GenBank中進(jìn)行Blast分析，根據(jù)Blast結(jié)果利用MEGA 5.0軟件以鄰近相接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.3菌株WYG5皿內(nèi)拮抗活性測(cè)定 在直徑9 cm的PDA平板中央接種1塊直徑為5 mm芒果炭疽病菌的菌餅，菌絲面朝下，同時(shí)在菌餅兩側(cè)2 cm處各接入一環(huán)內(nèi)生細(xì)菌WYG5，以不接內(nèi)生細(xì)菌為對(duì)照，每處理3次重復(fù)，28 ℃培養(yǎng)2～3 d，十字交叉法計(jì)算皿內(nèi)拮抗活性。

1.2.4菌株WYG5對(duì)芒果的防病效果取健康無(wú)病、大小均一、約八成熟芒果果實(shí)，用75%酒精表面消毒后，自然晾干備用。處理液包括發(fā)酵液、10倍稀釋發(fā)酵液、發(fā)酵濾液、10倍稀釋發(fā)酵濾液，以去離子水處理為對(duì)照。處理時(shí)將果實(shí)分別于各處理液中浸泡10 min，晾干后裝入保鮮盒中放置，在處理后第6、9、12 天共調(diào)查3次，逐次記錄并累加炭疽病病果數(shù)和病級(jí)，計(jì)算病指和防效，并對(duì)防效進(jìn)行方差分析。具體方法參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 17980.98-2004進(jìn)行。

果實(shí)發(fā)病程度分級(jí)方法如下，0 級(jí)：無(wú)??；1 級(jí)：病斑面積占果實(shí)面積的5%以下；3 級(jí)：病斑面積占果實(shí)面積的 6%～15%；5 級(jí)：病斑面積占果實(shí)面積的 16%～25%；7 級(jí)：病斑面積占果實(shí)面積的 26%～50%；9 級(jí)：病斑面積占果實(shí)面積的 50%以上。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS處理，進(jìn)行差異顯著性分析。

病情指數(shù)= [∑（各級(jí)病果數(shù)×相對(duì)級(jí)數(shù)）/（調(diào)查總果數(shù)×9）]×100

防效=[（對(duì)照區(qū)病情指數(shù)-處理區(qū)病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)]×100%。

2結(jié)果與分析

2.1菌株WYG5的鑒定

菌株WYG5在培養(yǎng)基上菌落呈圓形，淺黃色，邊緣整齊，表面有凸?fàn)盥∑?，干燥，不透明，革蘭氏染色陽(yáng)性，芽孢染色陽(yáng)性，菌體桿狀，周生鞭毛。菌株WYG5 的形態(tài)和生理生化特征與東秀珠等[6]描述的巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）特征相同。對(duì)菌株WYG5的16S rDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)純化后測(cè)序，得到 1 515 bp的堿基序列。將16S rDNA 序列進(jìn)行BLAST分析，發(fā)現(xiàn)它與多株巨大芽孢桿菌菌株的同源性均在99%以上。選取GenBank中的8株芽孢桿菌屬的細(xì)菌與菌株WYG5一起，利用軟件MEGA 5.0構(gòu)建出基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖1）。由圖1可以看出，菌株WYG5與巨大芽孢桿菌的同源性最高，結(jié)合形態(tài)觀察和生理生化特征分析，確定菌株WYG5為巨大芽孢桿菌。

2.2菌株WYG5皿內(nèi)拮抗活性的測(cè)定

采用十字交叉法測(cè)定菌株WYG5對(duì)芒果炭疽病菌的皿內(nèi)拮抗活性，結(jié)果表明，該內(nèi)生細(xì)菌對(duì)芒果炭疽病菌有明顯的拮抗作用，能夠有效抑制該病原菌菌絲在PDA培養(yǎng)基中的擴(kuò)展，抑制率達(dá)到32%。

2.3菌株WYG5對(duì)芒果的防病效果

內(nèi)生細(xì)菌WYG5的不同處理液對(duì)采后芒果的保鮮防病效果見(jiàn)表1。6 d相對(duì)于芒果保鮮來(lái)說(shuō)時(shí)間較短，6 d時(shí)對(duì)照組病情指數(shù)僅為7.04，處理防效雖高但意義不大，故重點(diǎn)討論了9 d和12 d的防效。其中菌株發(fā)酵液及發(fā)酵濾液處理9 d時(shí)的防效分別為60.76%和59.50%，不存在顯著差異；12 d時(shí)的防效分別為43.59%和34.19%，存在極顯著差異，發(fā)酵液的保鮮防病效果明顯優(yōu)于發(fā)酵濾液。稀釋10倍發(fā)酵液處理9 d時(shí)的防效為54.43%，與發(fā)酵液處理不存在顯著差異，而處理12 d時(shí)兩處理防效差異極顯著。稀釋10倍發(fā)酵濾液處理9 d和12 d時(shí)的防效均極顯著低于發(fā)酵濾液的防效。

3結(jié)論與討論

巨大芽孢桿菌作為植物內(nèi)生細(xì)菌已有報(bào)道，如農(nóng)倩等[7]從水稻體內(nèi)分離到一株巨大芽孢桿菌B196，對(duì)水稻紋枯病菌的生長(zhǎng)具有較強(qiáng)的抑制作用，盆栽和田間防效分別為64.29%和55.13%；林天興等[8]從苦豆子中分離出48株對(duì)棉花枯萎病菌和黃萎病菌有較強(qiáng)拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌，并對(duì)其遺傳多樣性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)這些菌株分別屬于Bacillus atrophaeus、Bacillus subtilis、Bacillus cereus、Bacillus megaterium、Bacillus pumilus、Serratia marcescens；張?chǎng)蔚萚9]從無(wú)紋紫背苔葉片中分離出一株內(nèi)生菌z12，鑒定為巨大芽孢桿菌，發(fā)現(xiàn)其對(duì)金黃色葡萄球菌、白色念珠菌及水稻紋枯病菌均有較強(qiáng)的抑制作用；林娜等[10]從山蒼子的根、莖、葉和果中分離出內(nèi)生細(xì)菌52株，其中一株對(duì)辣椒疫霉病的防治效果較好，且可促進(jìn)辣椒植株生長(zhǎng)。試驗(yàn)從南酸棗中分離到一株對(duì)芒果炭疽病菌拮抗作用較強(qiáng)的菌株WYG5，通過(guò)形態(tài)觀察、生理生化測(cè)定及16S rDNA序列分析，鑒定將該菌株為巨大芽孢桿菌，經(jīng)測(cè)定該菌株發(fā)酵液及發(fā)酵濾液對(duì)采后芒果均有明顯的保鮮防病效果，處理9 d后防效分別為 60.76%和 59.50%，12 d后的防效分別為43.59%和34.19%，有關(guān)該菌的抗病機(jī)理及抑菌活性物質(zhì)還有待進(jìn)一步研究。

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[4] 盧鎮(zhèn)岳，楊新芳，馮永君.植物內(nèi)生細(xì)菌的分離、分類、定殖與應(yīng)用[J].生命科學(xué)，2006，18（1）： 90-94.

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[6] 東秀珠，蔡妙英.常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M].北京： 科學(xué)出版社，2001.

[7] 農(nóng)倩，陳雪鳳，黎起秦，等.水稻內(nèi)生細(xì)菌B196的鑒定及其對(duì)水稻紋枯病的防治作用[J].中國(guó)生物防治學(xué)報(bào)，2011，27（1）：99-103.

[8] 林天興，李超，龔明福.拮抗性苦豆子內(nèi)生細(xì)菌的遺傳多樣性[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（24）： 14673-14675.

第6篇：堅(jiān)定的錫兵范文

［摘要］目的 探討不同位點(diǎn)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）和雜合性缺失（LOH）與慢性粒細(xì)胞白血?。–ML）各期的關(guān)系。方法 應(yīng)用多重PCR技術(shù)檢測(cè)CML病人不同時(shí)期8、9、17號(hào)染色體上5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的MSI和LOH。結(jié)果 在D8S555位點(diǎn)，CML加速、急變期（AP+BC）病人的MSI發(fā)生率明顯高于慢性期（CP）病人，差異有顯著意義（ P =0.009）;8號(hào)染色體上D8S555、D8S559位點(diǎn)MSI發(fā)生率明顯高于9、17號(hào)染色體上D9S67、TP53A1/A2、AFMa127xg9位點(diǎn) ，AFMa127xg9位點(diǎn)LOH發(fā)生率明顯高于其他4個(gè)位點(diǎn)，差異有顯著性（ χ 2 =1.858～9.946，P < 0.05、0.01）。結(jié)論 微衛(wèi)星遺傳不穩(wěn)定性是CML發(fā)生和轉(zhuǎn)化過(guò)程中的常見(jiàn)事件;不同位點(diǎn)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性在CML病情演變中所起作用不同;AFMa127xg9位點(diǎn)附近可能存在與CML發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的新抑癌基因。

［關(guān)鍵詞］ 染色體不穩(wěn)定性;雜合性缺失;微衛(wèi)星重復(fù);白血病，髓樣，慢性

［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the relationship between the frequency of microsatellite instability （MSI） on differ-ent chromosome and chronic myeloid leukemia （CML） at different stages. MethodsUsing multiplex-PCR，the MSI and loss of heterozegosity （LOH） on 5 microsatellite loci of chromosome 8， 9 and 17 in chronic myeloid leukemia were detected. Results The frequency of MSI at D8s555 locus in patients with CML at chronic， accelerated， blastic stages was significant differences （ P =0.009）. CML patients showed higher frequency of MSI on D8S555 and D8S559 loci than that of at D9S67 and AFMa127xg9 loci （ χ2 =5.680， 8.096; P

［KEY WORDS］chromosomal instability; loss of heterozygosity; microsatellite repeats; leukemia， myeloid， chronic

微衛(wèi)星（MS）是廣泛存在于原核及真核細(xì)胞基因組中的簡(jiǎn)單串聯(lián)重復(fù)的DNA序列，約占人類基因組的10%［1］。由于微衛(wèi)星DNA具有豐富的多態(tài)性、高度的雜合性以及較低的重組率等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于人類基因組計(jì)劃中的基因制圖、遺傳病診斷、法醫(yī)學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域。近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星在惡性腫瘤及相關(guān)疾病中可表現(xiàn)出不穩(wěn)定性（MSI）和雜合性缺失（LOH），因而對(duì)微衛(wèi)星的監(jiān)測(cè)成為尋找和定位抑癌基因、探討腫瘤發(fā)生機(jī)制的一個(gè)重要方法［2，3］。慢性粒細(xì)胞白血病（CML）是一種造血干細(xì)胞起源的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，其病程發(fā)展經(jīng)歷慢性期、加速期和急變期。對(duì)于慢性期轉(zhuǎn)變?yōu)榧铀倨诘臋C(jī)制 尚未研究清楚。本文用多重PCR技術(shù)檢測(cè)CML不同時(shí)期的多個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的MSI和（或）LOH，以期探索其與CML發(fā)生及病情進(jìn)展的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 CML病人37例，來(lái)自青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，包括慢性期（CP）27例，加速期和急變期（AP+BC）10例;男20例，女17例;年齡12～70歲，中位年齡47.1歲。診斷依據(jù)文獻(xiàn)［4］標(biāo)準(zhǔn)。選擇同期5例健康查體志愿者作為正常對(duì)照組。

1.2 方法

1.2.1標(biāo)本制備 收集CML病人的骨髓標(biāo)本，正常對(duì)照組外周血，同時(shí)刮取口腔黏膜標(biāo)本做自身對(duì)照，參考本室常規(guī)方法分別提取骨髓、外周血與口腔黏膜標(biāo)本DNA備用。

1.2.2引物合成 選取與CML病人不同時(shí)期染色體改變密切相關(guān)的8、9、17號(hào)染色體上5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn):D8S555、D8S559、D9S67、TP53A1/A2、 AFMa127xg9 ，從基因庫(kù)中查出其引物序列，由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成所需引物，引物序列見(jiàn)表1。

表1 第8、9、17號(hào)染色體5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)引物序列 （略）

1.2.3PCR擴(kuò)增 將引物分成兩組，用多重PCR方法同時(shí)擴(kuò)增病人的骨髓（或正常對(duì)照組的外周血）和口腔黏膜DNA。

1.2.4產(chǎn)物分析 將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染，用凝膠成像分析儀分析是否存在MSI和（或）LOH。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用卡方檢驗(yàn)（包括校正檢驗(yàn)和精確檢驗(yàn)法）。

2 結(jié)果

2.1 各期CML病人MSI和（或）LOH發(fā)生率比較 27例CP病人中14例發(fā)生MSI和（或）LOH，10例AP+BC病人中8例發(fā)生了MSI和（或）LOH，二者比較，差異無(wú)顯著性（ P =0.152）。

2.2 不同微衛(wèi)星位點(diǎn)MSI和（或）LOH的發(fā)生率及其比較 在D8S555位點(diǎn)，CML CP病人的MSI發(fā)生率為7.4%，AP+BC為40.0%，但未見(jiàn)LOH。進(jìn)展期（AP+BC）病人的MSI發(fā)生率明顯高于CP病人，差異有顯著性（ P =0.009）。同時(shí)出現(xiàn)兩個(gè)和兩個(gè)以上位點(diǎn)改變者10例，其中CP病人6例，AP+BC病人4例，二者差異無(wú)顯著性（ P =0.407）。8號(hào)染色體的D8S555、D8S559位點(diǎn)MSI的發(fā)生率明顯高于9、17號(hào)染色體的3個(gè)位點(diǎn)，差異均有顯著意義（ χ2 = 5.680、8.096，P

表2 CML病人各期不同微衛(wèi)星位點(diǎn)的MSI、LOH發(fā)生情況（略）

2.3 正常對(duì)照組的MSI和（或）LOH發(fā)生情況 正常對(duì)照組5例外周血細(xì)胞與口腔黏膜細(xì)胞DNA電泳、銀染后得到的條帶都完全相同，未見(jiàn)到MSI和（或）LOH。

3 討論

慢性白血病是一種克隆性、多能造血干細(xì)胞疾病，發(fā)病率為1/100 000，發(fā)病高峰在50～60歲之間。其臨床特征為:髓系增生，白細(xì)胞增多伴嗜堿粒細(xì)胞增多，脾大。病情發(fā)展最終由慢性期進(jìn)展到加速期，最后到致命的急變期。特征性的染色體異常t（9，22）（q34:q11）導(dǎo)致bcr-abl融合基因的形成，其產(chǎn)物bcr/abl酪氨酸激酶的活性比野生型abl酪氨酸激酶的活性更強(qiáng)，這在CML的發(fā)病中起重要作用［5］。一般認(rèn)為，CML急變時(shí)70%的病人可以出現(xiàn)額外的染色體異常，這種變化的出現(xiàn)比血液學(xué)和臨床表現(xiàn)的惡化要早幾個(gè)月，可作為估計(jì)預(yù)后的有價(jià)值的指標(biāo)［6］。分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展對(duì)CML的發(fā)病機(jī)制及病程演變的研究起了進(jìn)一步推動(dòng)的作用。PCR技術(shù)檢測(cè)微衛(wèi)星的不穩(wěn)定性在研究CML發(fā)生發(fā)展機(jī)制中被廣泛應(yīng)用。WADA等［7］檢測(cè)了19例CML進(jìn)展期和20例慢性期病人的5個(gè)不同微衛(wèi)星位點(diǎn)的MSI，結(jié)果顯示，進(jìn)展期有10例病人檢測(cè)到至少2個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的MSI，而20例慢性期病人中沒(méi)有1例檢測(cè)出同樣位點(diǎn)的MSI，認(rèn)為由于復(fù)制和修復(fù)機(jī)制缺陷導(dǎo)致微衛(wèi)星不穩(wěn)定性這一頻繁事件的發(fā)生同CML進(jìn)展關(guān)系密切。OHYASHIKI等［8］用熒光技術(shù)對(duì)73例不同類型白血病的7個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行連續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，在CML慢性期沒(méi)有微衛(wèi)星不穩(wěn)定性，而急變期時(shí)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性出現(xiàn)的頻率明顯升高，達(dá)25%，且出現(xiàn)多個(gè)位點(diǎn)不穩(wěn)定性者占50%以上，因此認(rèn)為，多個(gè)基因位點(diǎn)的不穩(wěn)定性與CML的急變有關(guān)聯(lián)。李戈等［9］檢測(cè)17例CML加速期和急變期病人的2個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)有8例出現(xiàn)MSI或LOH，表明慢性白血病在加速期和急變期檢出微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的頻率明顯高于慢性期。本文結(jié)果顯示，進(jìn)展期病人D8S555位點(diǎn)處的MSI發(fā)生率明顯高于慢性期病人，與文獻(xiàn)報(bào)道相符;同時(shí)也觀察到所選的其他4個(gè)位點(diǎn)上，加速期和急變期病人發(fā)生一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)的MSI和（或）LOH的頻率與慢性期病人無(wú)顯著性差異;8號(hào)染色體的2個(gè)位點(diǎn)D8S555、D8S559的MSI發(fā)生率明顯高于9、17號(hào)染色體的3個(gè)位點(diǎn)，而17號(hào)染色體的AFMa127xg9位點(diǎn)LOH發(fā)生率明顯高于其他4個(gè)位點(diǎn)，在9q34上的D9S67位點(diǎn)和17號(hào)染色體的TP53A1/A2位點(diǎn)上MSI和（或）LOH發(fā)生率都較低，且只發(fā)生在慢性期，這說(shuō)明CML的演變是一個(gè)遺傳學(xué)改變高度異質(zhì)性的過(guò)程，微衛(wèi)星遺傳不穩(wěn)定性廣泛存在于疾病全過(guò)程，不同微衛(wèi)星的改變?cè)谶@一過(guò)程中發(fā)揮的作用也不同。MORI等［10］對(duì)17例處于由慢性期向急變期進(jìn)展的CML病人的10個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行研究，也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)MSI，認(rèn)為這些微衛(wèi)星區(qū)域改變沒(méi)有參與CML的進(jìn)展。另外，MEZA等［11］研究發(fā)現(xiàn)，CML出現(xiàn)額外染色體異常如+8、i（17q）的頻率具有地區(qū)民族差異。所以，我們分析不同文獻(xiàn)結(jié)果不同的原因除與所選擇的微衛(wèi)星位點(diǎn)不同有關(guān)外，可能還與人種、地域等因素造成的微衛(wèi)星多態(tài)性有關(guān)。如何科學(xué)選擇微衛(wèi)星位點(diǎn)檢測(cè)慢性白血病不同時(shí)期的MSI和LOH的臨床意義還有待于更多、更進(jìn)一步的研究。

［參考文獻(xiàn)］

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第7篇：堅(jiān)定的錫兵范文

【關(guān)鍵詞】高脂血癥；載脂蛋白；動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)

載脂蛋白（apo）是脂蛋白（Lp）顆粒外層的蛋白質(zhì)部分，是脂蛋白組成中的關(guān)鍵物質(zhì)，已經(jīng)闡明各種載脂蛋白與脂代謝的關(guān)系非常密切，其主要功能是維持脂蛋白結(jié)構(gòu)與脂類運(yùn)輸，調(diào)控脂代謝存在酶的活力，以及作為細(xì)胞表面Lp受體的配體，而參與脂蛋白代謝，從人和動(dòng)物血漿和淋巴液中分離的多種apo中明確存在于人血漿中的有APOA-Ⅰ、AⅡ、AⅣ、B-100、B-48。CⅠ、CⅡ、CⅢ、D（即AⅢ）、E、F、G及apo（a）等用于動(dòng)脈粥樣硬化（AS）風(fēng)險(xiǎn)度估計(jì)的指標(biāo)是APOA-Ⅰ、APOB-100[1]。

APOA-Ⅰ是高密度脂蛋白的主要蛋白質(zhì)，它的血清濃度代表HDL水平，正常情況下APOB占低密度脂蛋白（LDL）中蛋白質(zhì)的97%及低密度脂蛋白（VLDL）中蛋白質(zhì)的37%左右，所以APOB水平主要反應(yīng)LDL水平，但VLDL多時(shí)，APOB也會(huì)有所增高，通常認(rèn)為HDL是動(dòng)脈粥樣硬化的防御因素，而LDL是致病因素，所以血清APOA-Ⅰ減少及APOB升高，提示動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的危險(xiǎn)性增加，APOA-Ⅰ/APOB-100比值，被稱為動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)[2]。

1標(biāo)本來(lái)源與方法

住院患者空腹靜脈血，同時(shí)用生化分析儀做膽固醇、甘油三脂、其中一項(xiàng)或兩項(xiàng)均高者，再用聯(lián)合免疫電泳去測(cè)其血清中APOA-1，與APOB-100的含量。

3討論

從表1可以看出，隨著年齡的增加，其APOA-Ⅰ的水平在下降，APOB-100的水平相對(duì)增高，膽固醇的含量也隨著年齡的增加而增高，A/B比值，隨著年齡的增加而減少，甘油三脂的含量隨著年齡的增加而增高，通過(guò)P值可以看出，各年齡組的測(cè)定結(jié)果有顯著性差異。

從表2可以看出，高血脂病人當(dāng)中63.3%患者血清APOA-Ⅰ與APOB-100的含量仍維持在正常水平。

其二者的比值也在正常水平，其平均比值為1.5。說(shuō)明高血脂人群中，有少數(shù)人載脂蛋白含量未發(fā)生改變，而大多數(shù)病人已發(fā)生改變，根據(jù)有關(guān)資料報(bào)道，A/B的正常參考值為1.3±0.56比值小于1.3就預(yù)示著疾病的存在，比值越小，疾病嚴(yán)重程度越深。

從表3可以看到高血脂病人當(dāng)中，48.9%患者血清APOA-Ⅰ的含量仍維持在正常水平，其A/B的平均比值為1.36，51.1%的患者血清APOA-Ⅰ的含量下降，其A/B的平均值為0.9。

從表4可以看到高血脂病人當(dāng)中，88.9%患者血清APOB-100的含量明顯增高，其A/B的平均比值為1.11，而11.1%的患者血清APOB-100仍維持在正常水平，其A/B的平均比值為1.35。

綜上所述，用聯(lián)合免疫電泳測(cè)人血清APOA-Ⅰ，APOB-100方法簡(jiǎn)易，準(zhǔn)確性高，在冠心病危險(xiǎn)的預(yù)測(cè)上APOB的測(cè)定，可能比總膽固醇測(cè)定更好、更有意義。

參考文獻(xiàn)

[1]李健齋.血清載脂蛋白免疫測(cè)定及其標(biāo)準(zhǔn)化問(wèn)題.中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，1992，15（1）：47.

[2]吳希云.載脂蛋白A1和載脂蛋白B的測(cè)定在肝病中的意義.全國(guó)肝病實(shí)驗(yàn)室診斷論文匯編，74-75.

第8篇：堅(jiān)定的錫兵范文

【摘要】 目的： 構(gòu)建攜帶人白細(xì)胞介素10(hIL10)和人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hHGF)雙基因的重組腺病毒載體。方法： 分別以pDC316hIL10EGFP和pCDNA3hHGF重組質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增獲得hIL10和hHGF基因片段，與pIRES連接成為hIL10IREShHGF，測(cè)序正確后酶切，與pDC315連接，獲得穿梭質(zhì)粒pDC315hIL10IREShHGF，與腺病毒包裝系統(tǒng)轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，包裝產(chǎn)生重組腺病毒hIL10hHGF，PCR鑒定后，擴(kuò)增病毒，并測(cè)定病毒滴度。用重組腺病毒轉(zhuǎn)染BEL7402和WRL68細(xì)胞，ELISA法檢測(cè)上清液中hIL10和hHGF的含量。結(jié)果： 成功構(gòu)建了重組腺病毒hIL10hHGF，擴(kuò)增純化后測(cè)得重組腺病毒滴度為1×109 pfu/ml，轉(zhuǎn)染BEL7402和WRL68細(xì)胞72 h后，表達(dá)hIL10的量分別為(6 271.7±5.2) pg/ml和(350.6±12.4) pg/ml，表達(dá)hHGF的量分別為(20 827.1±345.5) pg/ml和(201.6±10.1) pg/ml。結(jié)論： 本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究AdhIL10hHGF在動(dòng)物體內(nèi)抗肝炎、肝纖維化作用奠定了基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】 白細(xì)胞介素10; 肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子; 腺病毒載體

[Abstract] Objective: To construct the recombinant adenovirus vector carrying human interlerkin10(hIL10) and human hepatocyte growth factor(hHGF).Methods： We amplified hIL10 and hHGF genes by PCR with plasmids pDC316hIL10EGFP and pCDNA3hHGF， respectively， and subcloned into pIRES to generate hIL10IREShHGF. Confirmed by sequence analysis， the hIL10IREShHGF genes were inserted into the vector pDC315， then the shuttle plasmid pDC315hIL10IREShHGF was constructed， which was cotransfected with the adenovirus skeleton plasmid into 293 cells to obtain the recombinant adenovirus vector hIL10hHGF. After identified the target genes by PCR， the recombinant adenovirus was propagated and the viral titer was determined. hIL10 and hHGF proteins in the virusinfected BEL7402 and WRL68 cells were measured by ELISA. Results： We obtained recombinant adenovirus vector of hIL10hHGF successfully. After propagation， the titer of the recombinant adenovirus was 1×109 pfu/ml. The recombinant adenovirus could express hIL10 and hHGF in BEL7402 and WRL68 cells effectively. The concentrations of hIL10 were(6 271.7±5.2) pg/ml and(350.6±12.4) pg/ml respectively， and the concentrations of hHGF were(20 827.1±345.5) pg/ml and(201.6±10.1) pg/ml respectively. Conclusion： The recombinant adenovirus vector hIL10hHGF seted the foundation for the gene therapy of hepatitis and cirrhosis in animals.

[Key words] interlukin10; heptocyte growth factor; adenovirus vector 肝炎、肝炎后肝硬化嚴(yán)重危害人類健康，通過(guò)基因治療手段來(lái)預(yù)防和減輕肝損傷是近年來(lái)人們研究的一個(gè)新方向。IL10是一個(gè)多效性細(xì)胞因子， 具有廣泛的生物學(xué)作用。研究表明內(nèi)源性IL10 對(duì)肝細(xì)胞具有保護(hù)作用，而且給予外源性IL10 也顯示了明顯的抗肝細(xì)胞損傷作用[1，2]。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor， HGF)被認(rèn)為是最強(qiáng)的肝再生促進(jìn)劑，是一種具有多功能的生物大分子，它有強(qiáng)效的抗肝炎、促肝再生作用[3，4]。本研究擬構(gòu)建人IL10和HGF雙表達(dá)的重組腺病毒hIL10-HGF，為腺病毒介導(dǎo)IL10及HGF基因治療肝炎、預(yù)防肝損傷建立實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 質(zhì)粒和菌株 含HGF基因的質(zhì)粒pCDNA3HGF由江蘇省人民醫(yī)院血液科惠贈(zèng)，含hIL10基因的質(zhì)粒pDC316EGFPhIL10，pIRES，pDC315，pDC312，大腸埃希菌菌株Top10、腺病毒骨架質(zhì)粒、腺病毒包裝細(xì)胞HEK293細(xì)胞和肝癌BEL7402、正常肝臟WRL68細(xì)胞均由南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.1.2 酶類和主要試劑 限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、Taq DNA聚合酶、Pyrobest DNA，DNA 標(biāo)準(zhǔn)參照物、蛋白酶K購(gòu)自Takara公司;DMEM購(gòu)自Gibco BRL公司;DMSO為Amresco公司產(chǎn)品;胎牛血清購(gòu)自杭州四季清公司，56℃滅活30 min;轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen公司;0.22 μm無(wú)菌濾器及濾膜購(gòu)自Millipore公司;膠回收純化試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自AXYGEN公司，引物由上海生工公司合成。

1.2 方 法

1.2.1 PCR法擴(kuò)增目的基因 以pDC316hIL10EGFP和pCDNA3hHGF為模板，hIL10上下游引物5′端分別引入NheI和EcoRI的位點(diǎn)，上游引物P1：5′CGGCTAGCACCATGCACAGCTCAGCACTGC3′;下游引物P2：5′GAGAATTCTCAGTTTCGTATCTTC3′;HGF上下游引物5′端分別引入XbaⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)，P3：5′GCTCTAGAACCATGTGGGTGACCAAACTC3′;下游引物P4：5′GAGTCGACCTATGACTGTGGTAC 3′; 94℃預(yù)變性5 min，然后94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，72℃連續(xù)延伸7 min。擴(kuò)增完畢后進(jìn)行膠回收獲得目的片段。

1.2.2 測(cè)序質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 NheⅠ，EcoRⅠ和XbaⅠ，SalⅠ分別酶切pIRES及目的片段，割膠回收純化，用T4 DNA連接酶與hIL10，hHGF連接，片段∶載體=3∶1(摩爾比)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)，涂布于含50 mg/L氨芐西林的LB瓊脂平板，37℃，220 r/min恒溫?fù)u床振搖16 h。抽提質(zhì)粒，30 μl ddH2O溶解。取10 μl抽提質(zhì)粒和載體pDC312分別用NheⅠ，SalⅠ酶切，產(chǎn)物電泳，割膠回收hIL10IREShHGF片段和線性化載體pDC312，T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化，抽提質(zhì)粒，酶切鑒定。取鑒定陽(yáng)性的質(zhì)粒1～2 μl送上海生工公司測(cè)序，測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pDC312hIL10IREShHGF。

1.2.3 重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 NheⅠ、SalⅠ酶切pDC312hIL10IREShHGF，0.8%瓊脂糖凝膠電泳，回收產(chǎn)物，30 μl ddH2O溶解，T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)，與含50 mg/L氨芐西林的LB瓊脂平板篩選，挑取20個(gè)最小克隆接種至2 ml LBAmp+(50 μg/ml)液體培養(yǎng)基，37℃，220 r/min恒溫?fù)u床振搖過(guò)夜，取菌液進(jìn)行菌液電泳，選出可疑陽(yáng)性的菌株進(jìn)行PCR鑒定，確定含2 200 bp和540 bp條帶后，選兩個(gè)陽(yáng)性菌株進(jìn)行大量擴(kuò)增，采用堿裂解法抽提質(zhì)粒，獲得pDC315hIL10IREShHGF。

1.2.4 腺病毒的包裝、鑒定及擴(kuò)增 2 μg質(zhì)粒和2 μg腺病毒骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，37℃ 5%CO2培養(yǎng)5～7 d，細(xì)胞病變，-80℃、37℃水浴凍融5次收集病毒，再次感染HEK293細(xì)胞，最終收集的PBS重懸病毒上清，PCR鑒定，分別以含目的基因的重組穿梭質(zhì)粒、重組腺病毒及不含目的基因的重組腺病毒為模板進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件同“1.2.1”，鑒定后-80℃分裝保存。重組腺病毒命名為AdhIL10hHGF。

1.2.5 TCID50法滴定重組腺病毒效價(jià) 10%的培養(yǎng)液調(diào)整HEK293細(xì)胞為1×105個(gè)/ml，接種至96孔板，100 μl/孔，培養(yǎng)24 h;分別加入10-1～10-12濃度的病毒，留最后兩孔加入無(wú)血清培養(yǎng)基作為對(duì)照孔，每組設(shè)8孔，培養(yǎng)10 d，每天觀察細(xì)胞病變效應(yīng)情況。

1.2.6 重組腺病毒載體在BEL7402和WRL68中的表達(dá) 取BEL7402和WRL68細(xì)胞傳于6孔板，貼壁后24 h吸棄培養(yǎng)液，滅菌PBS(1×)洗2～3遍，加入MOI=20的AdhIL10hHGF轉(zhuǎn)染液，45 min搖勻1次，90 min后棄去轉(zhuǎn)染液，加入含5%胎牛血清的DMEM，培養(yǎng)72 h，顯微鏡下觀察細(xì)胞有無(wú)變圓和蝕斑現(xiàn)象，ELISA檢測(cè)上清液中hIL10和hHGF的含量。

2 結(jié) 果

2.1 目的片段PCR擴(kuò)增結(jié)果

以pDC316EGFPhIL10和pCDNA3hHGF為模板，PCR擴(kuò)增出預(yù)期片段，約540 bp的hIL10基因片段和2 200 bp的hHGF基因片段(圖1)。

2.2 pIREShIL10hHGF和 pDC312hIL10IREShHGF的酶切鑒定結(jié)果

用NheⅠ，SalⅠ酶切pIREShIL10hHGF產(chǎn)生3 400 bp和5 400 bp的兩個(gè)片段(圖2a)，用XbaⅠ，SalⅠ酶切pDC312hIL10IREShHGF產(chǎn)生2 200 bp的hHGF和4 540 bp的兩個(gè)片段(圖2b)，證明為預(yù)期質(zhì)粒，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 pDC315hIL10IREShHGF的篩選、鑒定及擴(kuò)增結(jié)果

pDC312hIL10IREShHGF質(zhì)粒用NheⅠ和SalⅠ雙酶切，釋放3 400 bp大小的片段，與用NheⅠ和SalⅠ雙酶切的pDC315連接得到pDC315hIL10IREShHGF，進(jìn)行PCR鑒定，證實(shí)所得質(zhì)粒正確(圖3a-d)。

(a)菌液電泳篩選，M: DL15000標(biāo)準(zhǔn)參照物，1：pDC315質(zhì)粒，2、3、5、7為可能陽(yáng)性質(zhì)粒pDC315hIL10IREShHGF; (b)菌液PCR篩選pDC315hIL10IREShHGF，M: DL15000 標(biāo)準(zhǔn)參照物，1:陰性對(duì)照，2: pDC316EGFPhIL10質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照，6，10為hIL10陽(yáng)性;(c)第6，10號(hào)菌液PCR鑒定，M: DL15000標(biāo)準(zhǔn)參照物，1: pCDNA3hHGF質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照;(d)大提質(zhì)粒pDC315hIL10IREShHGF鑒定，M: DL15000標(biāo)準(zhǔn)參照物，1: pDC315質(zhì)粒，2-4: 質(zhì)粒pDC315hIL10IREShHGF

圖3 pDC315hIL10IREShHGF鑒定

Fig 3 Identification of pasmid pDC315hIL10IREShHGF

2.4 病毒滴度測(cè)定結(jié)果

重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞4～10 d可見(jiàn)細(xì)胞病理效應(yīng)，細(xì)胞形態(tài)變圓，細(xì)胞核增大，細(xì)胞貼壁性降低，有死亡漂浮的細(xì)胞等。擴(kuò)增病毒的滴度為1×109 pfu/ml。

2.5 AdhIL10hHGF的PCR鑒定結(jié)果

AdhIL10hHGF經(jīng)PCR鑒定，擴(kuò)增出2 200 bp的hHGF 和540 bp的hIL10條帶，證實(shí)所得病毒正確(圖4)。

M1: 10000 標(biāo)準(zhǔn)參照物，1，2: hHGF陽(yáng)性，3，4: hIL10陽(yáng)性，M2: DL2000 標(biāo)準(zhǔn)參照物

圖4 腺病毒擴(kuò)增后PCR鑒定

Fig 4 PCR identification of AdhIL10hHGF

2.6 AdhIL10hHGF在BEL7402和WRL68中的表達(dá)

BEL7402和WRL68細(xì)胞感染AdhIL10hHGF 72 h后，ELISA檢測(cè)上清液中hIL10和hHGF的含量，結(jié)果表達(dá)hIL10的量分別為(6 271.7±5.2) pg/ml和(350.6±12.4) pg/ml，表達(dá)hHGF的量分別為(20 827.1±345.5) pg/ml和(201.6±10.1) pg/ml 。

3 討 論

肝炎、肝炎后肝硬化和肝癌嚴(yán)重危害人類健康，盡管經(jīng)過(guò)數(shù)十年，幾代科學(xué)家的共同努力，對(duì)這些疾病的診斷及治療已取得了重要進(jìn)展，但對(duì)絕大多數(shù)晚期病例尚缺乏有效治療手段。通過(guò)基因治療手段來(lái)預(yù)防和減輕肝損傷是近年來(lái)人們研究的一個(gè)新方向。

肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子在肝臟中主要由非實(shí)質(zhì)性細(xì)胞如肝星狀細(xì)胞和血竇內(nèi)皮細(xì)胞分泌，Kupffer細(xì)胞也少量分泌，實(shí)驗(yàn)表明[5]，HGF是肝細(xì)胞生長(zhǎng)和DNA合成最強(qiáng)大的刺激劑， HGF通過(guò)旁分泌和自分泌機(jī)制啟動(dòng)肝臟再生，刺激肝細(xì)胞的生長(zhǎng)。在肝纖維化的過(guò)程中，HGF起到了抑制肝纖維化的作用，還可用來(lái)治療急慢性腎功能不全、肺炎、肺纖維化、外傷、胃潰瘍以及循環(huán)系統(tǒng)等疾病。HGF的這種廣泛而有效的藥理治療作用，促使眾多的醫(yī)藥研究者們投入到HGF的開(kāi)發(fā)研究中。用HGF治療疾病也可采取蛋白制劑給藥，但因HGF半衰期較短，因而需要大量反復(fù)應(yīng)用才能維持局部較高的藥物濃度，有時(shí)即使重復(fù)應(yīng)用也難達(dá)到有效的濃度，因此應(yīng)用蛋白制劑費(fèi)用較高，故近年來(lái)興起基因治療的方法。

人IL10 主要由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T和B淋巴細(xì)胞分泌，現(xiàn)已證實(shí)Th1和Th2細(xì)胞受刺激后均可分泌IL10，肝內(nèi)kupffer細(xì)胞也可分泌，而且是肝內(nèi)IL10 的主要來(lái)源[6]。IL10具有維持機(jī)體免疫反應(yīng)穩(wěn)定，抑制病原體引起對(duì)機(jī)體有害炎癥反應(yīng)的功能。IL10在控制局部炎癥特性上對(duì)肝臟起保護(hù)作用，并通過(guò)抑制炎癥介質(zhì)的釋放、核因子κB活性等途徑阻止肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展[7]。因此IL10具有潛在的強(qiáng)大抗肝纖維化作用，有望成為抗肝纖維化基因治療新的有效目的基因。

腺病毒載體是目前發(fā)展得較快的載體系統(tǒng)，它以遺傳毒性低、致病性小、宿主范圍廣、滴度高、感染效率高和裝載容量大等優(yōu)勢(shì)已廣泛用于基因治療，也為體內(nèi)外轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞進(jìn)行基因治療提供了有力的保證[8]。保護(hù)肝細(xì)胞的基因治療目的基因既要能快速表達(dá)，又不必長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)地表達(dá)，這也正是我們構(gòu)建攜帶人IL10基因和HGF基因的腺病毒載體進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞研究的重要出發(fā)點(diǎn)之一。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)PCR鑒定、限制性酶切分析及序列測(cè)定，均證明已正確構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pDC315hIL10IREShHGF，并在HEK293細(xì)胞中與腺病毒骨架質(zhì)粒同源重組，成功包裝重組腺病毒hIL10hHGF。本研究所構(gòu)建的AdhIL10hHGF能在體外感染肝臟細(xì)胞和肝癌細(xì)胞，并成功表達(dá)出hIL10和hHGF，為進(jìn)一步研究AdhIL10hHGF在動(dòng)物體內(nèi)抗肝炎、肝纖維化作用奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

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[3] Lindroos PM， Zarnegar R， Michalopoulos GK， et al. Hepatocyte growth factor rapidly increases in plasma before DNA synthesis and liver regeneration stimulated by partial hepatectomy and carbon tetrachloride administration[J]. Hepatology， 1991，13(4):743-750.

[4] Thatch KA， Schwartz MZ， Yoo EY， et al. Modulation of the inflammatory response and apoptosis using epidermal growth factor and hepatocyte growth factor in a liver jnjury model: a potential approach to the management and treatment of cholestatic liver disease[J]. J Pediatr Sur， 2008，43(12 ):2169-2173.

[5] Masson S， Daveau M， Francois A，et al. Upregulated expression of HGF in rat liver cells after experimental endotoxemia: a potential pathway for enhancement of liver regeneration[J]. Growth Factors， 2001，18(4): 237-250.

[6] Platzer C， Dcke W， Volk H，et al. Catecholamines trigger IL10 release in acute systemic stress reaction by direct stimulation of its promoter/enhancer activity in monocytic cells[J]. J Neuroimmunol， 2000，105(1):31-38.

第9篇：堅(jiān)定的錫兵范文

1、正確、工整地抄寫下面的漢字。(5分)

端 希 朋 從 竹

2、讀拼音，寫漢字。(24分

bì 　fēnɡ　 yǐnɡ lánɡ

水　秀 倒 　畫(huà)

yā ōu 　 　 dù 　 　 yàn

烏 海 鵑 大

yǒnɡ yǒnɡ qí 　qí

遠(yuǎn)　敢　好　下

chì chì cónɡ 　 cónɡ

腳膀　花　順

zhuān xīn 　zhì zhì tiān chánɡ rì jiǔ

3、寫出帶有下列偏旁的字。(4分)

4、填上合適的詞語(yǔ)(6分)

一( 把 )雨傘 ( 歡樂(lè) )的潑水節(jié) ( 飛快 )地前進(jìn)

一( )黑板 ( )的蝴蝶谷 ( )地爬行

一( )針 ( )的鳥(niǎo)窩 ( )地計(jì)算

5、照樣子寫詞語(yǔ)。(6分)

(1)黑乎乎綠油油

( 2 )馬馬虎虎 平平安安

6、選詞填空。(8分)

傳揚(yáng)　表?yè)P(yáng)

(1)老師常常()學(xué)習(xí)有進(jìn)步的同學(xué)。

(2)勝利的消息很快在村子里(　)開(kāi)來(lái)。

激動(dòng)　感動(dòng)

(3)仙人被沉香的孝心(　)了，送他一把神斧。沉香拿著神斧，想到就要劈開(kāi)華山，見(jiàn)到媽媽，心

里很(　)。

黃黃的　藍(lán)藍(lán)的　尖尖的　茂密的

(4)星期天，我坐在陽(yáng)臺(tái)上畫(huà)畫(huà)，我先在紙上畫(huà)了一片(　)森林。又在森林的上方畫(huà)了(　)

天空和幾朵白云，然后，我在森林中畫(huà)了幾只小鳥(niǎo)，(　)羽毛，(　)小嘴，可愛(ài)極了。最后，我給

畫(huà)兒起了一個(gè)名字：小鳥(niǎo)的家。

二、按課文內(nèi)容完成練習(xí)。(23分)

1.把詞語(yǔ)補(bǔ)充完整(6分)

來(lái) 往 烘 托 活 虎

習(xí) 武 五 顏 中 外

2.按課文內(nèi)容填空。(17分)

① 節(jié)，家家 。我一邊吃 　 　 ，一邊聽(tīng)爺爺講有關(guān)月

亮的故事。春節(jié)到了,我們一起吃 ,去 年。(5分)

②我想變 　的星星，我想變　 的新月。最后，我看見(jiàn)小

小的 　，真想變成大大的 。(4分)

③ 好雨知時(shí)節(jié)，當(dāng)春乃發(fā)生。 ， 。(4分)

④ 通過(guò)學(xué)課文，我們讀懂了許多有趣的故事：《狐假虎威》說(shuō)的是：狡猾的

借著老虎的 ，把百獸嚇跑了。《黑板跑了》講的是物理學(xué)家

的故事。他搞科學(xué)研究非常 。(4分)

三、課外閱讀(12分)

1.安徒生是( )國(guó)的童話作家，世界文學(xué)童話創(chuàng)始人，被世人公認(rèn)是 “童話”。

A.中國(guó) B.美國(guó) C.丹麥

2.《海的女兒》中的小公主最后化成了( )

A.泡沫 B.海水 C.海草 D.小精靈

3.《打火匣》中士兵用火擦打火匣，馬上出現(xiàn)了( )

A. 巫婆 B.狗 C.公主

4.《賣火柴的小女孩》中的小女孩最后在亮光中看到了( )

A.烤鵝 B.圣誕樹(shù) C.奶奶 D.糖果

5.《野天鵝》中，妹妹編織( )救了十一位哥哥。

A.披風(fēng) B.衣服 C.帽子 D.鞋子

6.《堅(jiān)定的錫兵》中，只有一只腳的錫兵，最后變成了什么?( )

A.錫塊 B.錫勺子 C.錫心 D.錫兵

四、看圖寫話。(12分)

仔細(xì)看圖，接著開(kāi)頭的話編個(gè)小故事。

花傘借給誰(shuí)?

小花貓有一把花傘。一天，下大雨了，青蛙、烏龜、小鴨、大公雞從它的門前走過(guò)。

一、識(shí)字寫字(53分)

1、端 希 朋 從 竹

2、碧、峰、影、廊 鴉、鷗、杜、雁 永、勇、奇、棋子

赤、翅、叢、從 專心致志 天長(zhǎng)日久

3、菠、蘿 朗、腿 裙、衫 松、樹(shù)

4、塊 迷人 慢慢

根 小巧 飛快

5、(1)黃燦燦 紅通通

(2)家家戶戶 高高興興

6、(1)表?yè)P(yáng) (2)傳揚(yáng) (3)感動(dòng) 激動(dòng)

(4)茂密的 藍(lán)藍(lán)的 黃黃的 尖尖的

二、按課文內(nèi)容完成練習(xí)。(23分)

1、寒暑 云月 生龍

練功 六色 古今

2、

(1)中秋 團(tuán)圓 月餅 餃子 拜

(2)眨眼 彎彎 荷塘 荷葉

(3)隨風(fēng)潛入夜，潤(rùn)物細(xì)無(wú)聲。

(4)狐貍 威風(fēng) 安培 專心

三、課外閱讀(12分)

1、C 2、A 3、B 4、C 5、A 6、A