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【關(guān)鍵詞】 鹽酸頭孢吡肟 凝膠色譜法 高分子雜質(zhì)
Abstract:Objective To establish a method for determining high molecular weight impurities in cefepime hydrochloride injection. Methods Quantification of high molecular weight impurities in cefepime hydrochloride injection was determined by Sephadex G10 column chromatography with external standard method. The mobile phase consisted of 0.1 mol／L phosphate buffer(pH7.0) and supper pure water．The flow rate was 1.0 mL／min and detection wavelength 254 nm. Results The content of high molecular weight impurities in different batches of cefepime hydrochloride injection was less than 0.5％．Conclusion This method was sensitive and accurate for determining high molecular weight impurities in cefepime hydrochloride injection.
Key words: cefepime hydrochloride; sephadex G-10; high molecular weight impurities
注射用鹽酸頭孢吡肟（cefepime hydrochloride）是20世紀90年代上市的第四代頭孢菌素，本品抗菌譜廣，藥效強。實驗研究表明，控制產(chǎn)品中高分子雜質(zhì)是減少β-內(nèi)酰胺類抗生素過敏反應(yīng)的重要途徑之一 ［1］。《中國藥典》2005年版采用凝膠色譜自身對照外標法定量測定β內(nèi)酰胺類抗生素中的聚合物，而鹽酸頭孢吡肟不能完全締合，無法采用“自身”對照外標法定量，根據(jù)《中國藥典》2005年版二部阿莫西林聚合物檢驗方法，可以用結(jié)構(gòu)與研制產(chǎn)品類似，且能夠完全締合的其他藥物制備對照品，進行自身對照外標法定量［2-3］。本文用與頭孢吡肟結(jié)構(gòu)及分子量相近的頭孢噻肟作對照品，建立了測定注射用鹽酸頭孢吡肟中高分子雜質(zhì)(頭孢吡肟聚合物)的方法。
1 儀器與試藥
1.1 儀器
DHLA電腦恒流泵(上海瀘西分析儀器廠)，UVD6802紫外檢測儀(上海金達生化儀器廠)，HW2000色譜工作站(南京色譜軟件有限公司)。
1.2 試藥
頭孢噻肟對照品(批號130483-200102，中國藥品生物制品檢定所)；注射用鹽酸頭孢吡肟(批號060330、060731、060830，廣州白云山天心藥業(yè)股份有限公司)。
磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸、氫氧化鈉均為分析純；水為二次重蒸餾水；葡聚糖凝膠(Sephadex)G10和藍色葡聚糖2000為Amersham Bioscience公司產(chǎn)品。
2 方法與結(jié)果
2.1 色譜條件
色譜柱為玻璃色譜柱（40 m×1.5 cm），內(nèi)填Sephadex G10凝膠；流動相A為pH7.0的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(取磷酸氫二鈉21.85 g和磷酸二氫鈉6.08 g，加水1 000 mL，調(diào)pH值為7.0)，流動相B為超純水；流速為1.0 mL/min；檢測波長為254 nm。
2.2 系統(tǒng)適用性試驗［4］
分別以流動相A、B為流動相，取0.1 mg/mL藍色葡聚糖2000溶液200 μL注入色譜儀，理論塔板數(shù)按藍色葡聚糖2000峰計算分別為1 968、1 639，拖尾因子分別為1.7、1.1，在兩種流動相系統(tǒng)中藍色葡聚糖2000保留時間的比值為1.01，對照溶液主峰和供試品溶液中聚合物與相應(yīng)色譜系統(tǒng)中藍色葡聚糖2000峰的保留時間的比值都在0.93～1.07之間，另以流動相B為流動相，精密量取對照溶液200 μL，連續(xù)進樣5次，峰面積的相對標準偏差為0.35％。
2.3 標準曲線繪制
取頭孢噻肟對照品約0.25 g置50 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取該溶液0.5、2.0、4.0、6.0、8.0 mL分別置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。分別取上述溶液各200 μL，記錄色譜圖，以質(zhì)量濃度(ρ)為橫坐標， 峰面積（A）為縱坐標進行線性回歸，回歸方程為：ρ=8.714×106A+31788(n=5，r=0.9998)。實驗表明，在0.025～0.4 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。
2.4 精密度和穩(wěn)定性試驗
配制每1 mL含100 μg的頭孢噻肟對照溶液，精密量取200 μL注入色譜儀，連續(xù)進樣5次，計算峰面積的RSD為0.35％。將測定溶液放置1、2、4 h，分別測定峰面積，計算峰面積的RSD為0.27％。
2.5 檢測靈敏度試驗
取頭孢噻肟對照品適量，精密稱定，用水稀釋制成一系列濃度的溶液，精密量取上述溶液200 μL注入色譜儀，以流動相B為流動相進行測定，記錄色譜圖。最小檢測限(S/N＝3)為0.025 mg/mL，最小定量限(S/N＝10)為0.076 mg/mL。
2.6 重復(fù)性試驗
取同一批號樣品依法重復(fù)測定6次，得高分子雜質(zhì)含量分別為0.09％，0.1％，0.1％，0.1％，0.1％，0.1％，RSD為4.15％。實驗表明方法的重復(fù)性良好。
2.7 樣品的測定
取頭孢噻肟對照品適量，精密稱定，加水溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含0.2 mg的對照溶液。取供試品適量約相當于頭孢吡肟0.2 g ，精密稱定，置10 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，立即精密量取200 μL注入色譜儀，以流動相A為流動相進行測定，記錄色譜圖，見圖1。另精密量取對照溶液200 μL注入色譜儀，以流動相B為流動相，同法測定。按外標法以峰面積計算，含頭孢吡肟聚合物以頭孢吡肟計算(頭孢噻肟:頭孢吡肟＝1.0∶0.94)，3個批號（060330、060731、060830）的樣品測定結(jié)果分別為0.3%、0.2%和0.1%。
圖1 注射用鹽酸頭孢吡肟高分子雜質(zhì)檢查圖譜（略）
Fig.1 Chromatograms of high molecular weight impurities in cefepime hydrochloride injection
3 討論
高分子雜質(zhì)會隨樣品放置時間的延長而增加，而高分子雜質(zhì)是引起β內(nèi)酰胺類抗生素過敏反應(yīng)的主要原因之一，故有必要對其進行檢測?！吨袊幍洹?005年版標準增強了對高分子雜質(zhì)檢測的要求。本方法按照《中國藥典》2005年版標準要求進行研究檢測，經(jīng)試驗結(jié)果表明，本方法靈敏、準確、簡便，可用于注射用鹽酸頭孢吡肟的質(zhì)量控制。
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關(guān)鍵詞溴系阻燃劑；氣相色譜負化學(xué)源質(zhì)譜；高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；乳制品；固相萃取
1引言
自20世紀70年代以來，溴系阻燃劑（BFRs）被廣泛應(yīng)用于各類產(chǎn)品中，但其在生產(chǎn)、使用和產(chǎn)品廢棄過程中不斷釋放到周圍環(huán)境中，并通過食物鏈富集放大，由此帶來的環(huán)境污染和人群健康危害已成為熱點問題[1，2＼]。多溴聯(lián)苯醚（PBDEs）、四溴雙酚A（TBBPA）和六溴環(huán)十二烷（HBCD）是當前產(chǎn)量最大及使用時間最長的3種溴系阻燃劑。在2009年《關(guān)于持久性有機污染物的斯德哥爾摩公約》締約方大會已明確將多溴聯(lián)苯醚中的五溴和八溴聯(lián)苯醚列為持久性有機污染物并建議禁用。TBBPA已被歐盟列入優(yōu)先控制化學(xué)品名單，我國則由于TBBPA產(chǎn)量和消費量巨大，已成為TBBPA污染最嚴重的國家[3＼]。HBCD于2013年被確定為持久性有機污染物，我國目前也是HBCD的主要生產(chǎn)和使用[4＼]。
隨著傳統(tǒng)阻燃劑陸續(xù)禁限用，新型溴系阻燃劑（NovelBFRs，NBFRs）逐步推廣。例如十溴二苯乙烷（DBDPE）作為十溴二苯醚替代品，自2005年在我國投產(chǎn)以來，年均增幅達80%[5＼]。其它NBFRs（如五溴甲苯（PBT））也逐漸推廣。在大氣、河流底泥、生物體等多基質(zhì)中均已發(fā)現(xiàn)NBFRs殘留[6＼]，甚至在青藏高原和極地地區(qū)也發(fā)現(xiàn)了BTBPE等NBFRs，表明部分NBFRs也具有持久性有機污染物的特征[7＼]。
乳制品是當前消費量快速增長的一大類食品，尤其是嬰幼兒配方乳消費量巨大，因此乳制品中環(huán)境污染物的污染水平需持續(xù)監(jiān)控?，F(xiàn)有研究多針對PBDEs和HBCD等傳統(tǒng)BFRs，極少涉及乳制品中NBFRs的監(jiān)測[8＼]。本研究采用凝膠滲透色譜結(jié)合固相萃取技術(shù)建立乳制品中多種BFRs的同時前處理技術(shù)，并采用色譜質(zhì)譜技術(shù)建立儀器分析方法，本方法穩(wěn)定可靠，適用于乳制品中BFRs的多殘留檢測，也可用于母乳或其它富含脂肪的食品樣本的檢測。
2實驗部分
2.1儀器與試劑
Agilent7890B5977A氣相色譜質(zhì)譜儀、Agilent12006410高效液相色譜三重四級桿質(zhì)譜儀（美國安捷倫公司）；AccuPrepMPS全自動凝膠滲透凈化系統(tǒng)（美國J2Scientific公司）。
農(nóng)殘級或色譜級正己烷、甲醇、二氯甲烷、丙酮、環(huán)己烷、乙酸乙酯（美國J&T.Baker公司或迪馬公司）；硅膠（德國默克公司），使用前經(jīng)500℃烘烤5h后加入98%濃H2SO4制成44%酸化硅膠；優(yōu)級純濃H2SO4（98%）、無水Na2SO4（北京化工廠）。LCSi固相萃取柱（500mg，3mL，美國Supelco公司）。PBDEs混合標準樣品（BDECM）包括美國環(huán)境保護署1614草案中列出的環(huán)境中優(yōu)先關(guān)注的8種PBDEs單體：BDE28，47，99，100，153，154，183和209；新型溴系阻燃劑單體，五溴甲苯（PBT）、五溴乙苯（PBEB）、六溴苯（HBB）、2，3二溴丙基2，4，6三溴苯基醚（DPTE）、1，2雙（2，4，6三溴苯氧基）乙烷（BTBPE）和十溴二苯乙烷（DBDPE）；內(nèi)標：3，3′，4，4′，四溴聯(lián)苯醚（BDE77）和2，2′，3，3′，4，4′，六溴聯(lián)苯醚（BDE128），上述標準品均購于美國AccuStandard公司。αHBCD，βHBCD，γHBCD和TBBPA及同位素內(nèi)標13C12BDE209，13C12αHBCD，13C12βHBCD，13C12γHBCD和13C12TBBPA均購自美國WellingtonLaboratories公司。
2.2樣品處理
提取：純牛奶、酸奶、奶粉等奶制品或母乳樣品，根據(jù)脂肪含量取3～15g（確保脂肪含量約1g），經(jīng)冷凍干燥機凍干后，于研缽中研碎后置于纖維素提取套筒中，加入內(nèi)標BDE77、BDE128各1ng，13C12BDE209、13C12TBBPA與13C12α，β，γHBCD各10ng，加標實驗時需再加入不同濃度的待測物混合標準液，隨后以正己烷/丙酮（1KG-3∶KG-51，V/V）索氏提取16h以上。
自動凝膠色譜凈化：索氏提取后蒸去溶劑，以重量法計算脂肪含量，加入乙酸乙酯/環(huán)己烷（1KG-3∶KG-51，V/V）復(fù)溶至6mL。自動凝膠凈化系統(tǒng)采用低壓填充柱，填料為50gBioBeadsSX3，柱規(guī)格50cm×2cmi.d.；紫外檢測器檢測波長240nm；流動相為乙酸乙酯/環(huán)己烷（1KG-3∶KG-51，V/V），流速5mL/min，進樣量5mL，收集20～45min流出組分并減壓蒸發(fā)至近干，加2mL正己烷復(fù)溶，待下一步凈化。
酸化硅膠凈化：采用自制酸化硅膠凈化柱，于20cm×1cm玻璃柱中自下而上依次裝填1cm高無水Na2SO4，5g酸化硅膠，1cm高無水Na2SO4。酸化硅膠柱經(jīng)10mL正己烷淋洗后上樣，先用30mL正己烷，再用10mL二氯甲烷洗脫待測物，洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加2mL正己烷復(fù)溶，待固相萃取柱分離。
方法的檢測限（LOD）實驗以牛奶為加標基質(zhì)，測定最低加標水平的響應(yīng)，計算信噪比（S/N），以S/N=3和S/N=10時對應(yīng)的濃度為檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。各化合物的保留時間、線性方程、相關(guān)系數(shù)（R2）、LOD和LOQ結(jié)果見表1。各待測物的標準曲線的相關(guān)系數(shù)R2為0.9989～0.9998，表明標準曲線線性良好。
3.3.2加標回收實驗以經(jīng)檢測無待測物殘留的某品牌純牛奶為空白基質(zhì)進行加標回收實驗，取樣量10g，加標水平如表2所示，每個加標水平按本方法平行測定5次，加標回收率及RSD列于表2。BTBPE回收率普遍偏低且RSD值較高，說明BTBPE在前處理過程中不穩(wěn)定且有較高損失，其余待測物平均回收率在80.1%～114.7%之g，RSD在0.87%～14.9%之間。
3.3.3基質(zhì)效應(yīng)采用提取后添加法考察HPLCMS/MS分析中的基質(zhì)效應(yīng)，即比較兩組溶液的待測物信號峰面積，其中組1為標準品溶液，組2為某空白純牛奶樣提取液中添加標準品所得溶液，則基質(zhì)效應(yīng)（ME）=基質(zhì)溶液中待測物峰面積/純?nèi)軇┲写郎y物峰面積。通過對0.1，1.0和10ng/g3個濃度水平的測定，發(fā)現(xiàn)乳制品測定時存在基質(zhì)抑制效應(yīng)，HBCD和的基質(zhì)效應(yīng)比TBBPA更加明顯。TBBPA的ME在0.84～0.95之間，αHBCD的ME為0.71～0.93，βHBCD和γHBCD的ME比較接近，均在0.6～0.8之間。為降低基質(zhì)效應(yīng)的影響，除了對樣品前處理方法和檢測條件進行優(yōu)化之外，采用穩(wěn)定性核素標記物（13C12HBCD和13C12TBBPA）作為內(nèi)標是必不可少的。
3.4實際樣品測定
應(yīng)用所建立方法檢測8份市售奶制品樣本以ZH（及從某婦幼保健院采集的2份母乳樣本，結(jié)果見表3。在PBDEs、TBBPA和HBCD3種傳統(tǒng)阻燃劑中，BDE28，47和99檢出率較高，但BDE209污染水平較高，TBBPA和HBCD在母乳中的污染水平比乳制品要高，因為BFRs多具有生物蓄積性，因此處在食物鏈高端的人類體內(nèi)BFRs含量普遍高于處在食物鏈低端的食草類動物。HBCD的3個異構(gòu)體中，由于代謝速度差異和體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致βHBCD和γHBCD在生物體內(nèi)含量普遍低于αHBCD，本研究中αHBCD檢出率較高而βHBCD和γHBCD均未檢出，與文獻＼[13＼]結(jié)果類似。在NBFRs中，DBDPE可能由于檢出限較高的關(guān)系均未檢出。PBT在所有樣本中均可檢出，HBB，DBTE和BTBPE檢出率也較高，說明隨著NBFRs的迅速推廣應(yīng)用，食品中NBFRs的污染水平也可能隨之升高，需持續(xù)關(guān)注。ZH）
3.5小結(jié)
以索氏提取、凝膠色譜和固相萃取為前處理方法，GCNCI/MS和HPLCMS/MS為儀器分析方法，建立了乳制品中18種溴系阻燃劑的檢測方法，并實現(xiàn)了18種溴系阻燃劑的同時提取與凈化。本方法穩(wěn)定可靠，可用于食品及生物樣品中溴系阻燃劑的多殘留分析。
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關(guān)鍵詞： 凝膠色譜法；凝膠電泳法； 血紅蛋白
G633.91
DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)包括DNA的粗提取與鑒定、PCR技術(shù)和血紅蛋白的提取和分離等，是開展分子生物學(xué)研究的基本技術(shù)。蛋白質(zhì)是生命活動不可或缺的物質(zhì)。血紅蛋白是人和其他脊椎動物紅細胞的主要組成成分，負責血液中的氧氣和二氧化碳的運輸。
一、 血紅蛋白蛋白質(zhì)提取和分離的原理
血紅蛋白蛋白質(zhì)提取和分離的原理是根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)和對其他分子的親和力等，可以分離不同種類的蛋白質(zhì)。
二、 血紅蛋白蛋白質(zhì)提取和分離技術(shù)方法有凝膠色譜法和電泳法。
凝膠色譜法是根據(jù)分子量的大小來分離蛋白質(zhì)的，而電泳法是根據(jù)各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身形狀、大小的不同來把蛋白質(zhì)分離開的。
1. 凝膠色譜法
凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理：在多孔球體的凝膠內(nèi)，蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的大小不同，大分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動快；小分子通過凝膠顆粒的內(nèi)部，路程長，流動慢。相對分子質(zhì)量的不同蛋白質(zhì)因此得以分離。凝膠材料是微小的多孔性球體，如葡聚糖或瓊脂糖。
2.凝膠電泳法
電泳法是帶電顆粒在電場中向電荷相反的電極移動的現(xiàn)象。凝膠電泳法原理是：不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)（正電荷或負電荷）、電量、形狀和大小不同，在電場中受到的作用力大小、方向和阻力不同，導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)在電場中的運動方向和運動速度不同，因而可聚集形成不同的條帶，因而達到分離的目的。影響蛋白質(zhì)分子運動速度的因素中，蛋白質(zhì)的電荷性質(zhì)決定蛋白質(zhì)運動方向，蛋白質(zhì)帶電荷量的多少決定電場作用力的大小，分子形狀和大小形成阻力大小，蛋白質(zhì)的運動速率由電荷量、分子形狀和分子大小共同決定。
實驗探究 蛋白質(zhì)為什么帶有帶電荷？
蛋白質(zhì)是由氨基酸組成的，還有一個羧基和一個氨基，在一定的PH下，蛋白質(zhì)可解離的基因會帶上電荷。
三、實驗操作步驟
蛋白質(zhì)的提取和操作一般分為五個階段：材料的選擇和預(yù)處理、粗分離（細胞的破碎）、提取、純化（包括鹽析，層析，有機溶劑提取，有機溶劑沉淀等）和濃縮干燥及保存。我們?nèi)〔溉閯游锛t細胞（豬的新鮮血液）為材料，來進行血紅蛋白的分離方法。
1.樣品處理及粗分離
⑴ 樣品前處理 包括細胞的破碎有機械方法、物理方法和化學(xué)及生物化學(xué)方法。
⑵ 細胞器的分離 從樣品水溶液中提取、用有機溶劑提取、利用表面活性劑提取和對提取物進行保護。
①樣品分離器材：離心機，0.9%的NaCl溶液和20mmol/L的磷酸緩沖液。
②步驟包括：紅細胞的洗滌、血紅蛋白的釋放、分離血紅蛋白溶液和透析。采集的血樣要及時分離紅細胞，分離時采用低速短時間離心（500r/min離心2min），然后用膠頭吸管吸上層透明的黃色血漿，將下層暗紅色的紅細胞液體倒入燒杯，再加入五倍體積的0.9%的NaCl溶液，緩慢攪拌10min，低速短時離心，如此重復(fù)洗滌三次，直至上清液不再呈現(xiàn)黃色為止。將洗滌好的紅細胞倒入燒杯中，加蒸餾水到原血液的體積，再加40%體積的甲苯，置于磁力攪拌器上充分攪拌10min。然后轉(zhuǎn)移到離心管中，以2000r/min的速度離心10min，就可以明顯看到試管中溶液分四層，從上往下數(shù)，第一層為無色透明的甲苯層，第二層為白色波層固體，是脂溶性物質(zhì)沉淀層，第三層是紅色透明液體，這是血紅蛋白的水溶液，第四層是其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物。將試管中的分層液體用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，靜置后分出下層的紅色透明液體。取1mL血紅蛋白溶液裝入透析袋子中，將透析袋放入盛有300mL的物質(zhì)的量濃度20%mmol/L的磷酸緩沖液中（PH為7.0），透析12h即可。
⒉ 凝膠色譜操作
⑴凝膠色譜柱的制作 取長40cm，內(nèi)徑為1.6cm的玻璃管，兩端磨平。玻璃管兩端色上合適的橡皮塞，中間打孔，孔徑為0.5mL插入移液管，在色V柱下端用移液管頭部作出口部位，連接一細的尼龍管，用螺旋塞控制尼龍管的打開與關(guān)閉，尼龍管的另一端放入收集色譜液的收集器內(nèi)。
⑵ 凝膠色譜柱的裝填凝膠用蒸餾水充分溶脹后，配成配成凝膠懸浮液，在于下端連接的
尼龍管打開的情況下，一次性緩慢倒入色譜柱內(nèi)，輕輕敲動色譜柱使凝膠裝填均勻。并立即用20mmol/L的磷酸緩沖液充分洗滌，使凝膠裝填緊密。
⑶血紅蛋白樣品的加入和洗脫 加樣前，打開色譜柱下端的流出口，使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液下降到與凝膠面平，關(guān)閉出口。用吸管小心地將透析后的樣品加到色譜柱的頂端，并打開下端出口，是樣品滲入凝膠床內(nèi)。等樣品完全進入凝膠層后，關(guān)閉下端出口，并加入20mmol/L的磷酸緩沖液到適當?shù)母叨龋B接洗脫瓶，打開下邊出口，進行洗脫。待紅譜柱接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，連續(xù)收集。
⒊ SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳
⑴原理 蛋白質(zhì)在十二烷基硫酸鈉（SDS）和巰基乙醇的作用下，分子中的二硫鍵還原，氫鍵等打開，形成按1.4gSDS/1g蛋白質(zhì)比例的SDS-蛋白質(zhì)多肽復(fù)合物，該復(fù)合物帶負電，故可在聚丙烯酰胺凝膠電泳中向正極遷移，且主要由于凝膠的分子篩作用，遷移速率與蛋白質(zhì)的分子量大小有關(guān)，因此可以濃縮和分離蛋白質(zhì)多肽。
聚丙烯酰凝膠電泳分離蛋白質(zhì)多數(shù)采用一種不連續(xù)的緩沖系統(tǒng)，主要分為較低濃度的成層膠和較高濃度的分離膠，配制凝膠的緩沖液，其pH值和離子強度也相應(yīng)不同，故電泳時，樣品中的SDS-多肽復(fù)合物沿移動的界面移動，在分離膠表面形成了一個極薄的層面，大大濃縮了樣品的體積，即SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的濃縮效應(yīng)。
⑵具體操作包括：①紅細胞的洗滌 ；②色譜柱填料的處理；③凝膠色譜柱的裝填；④蛋白質(zhì)的分離。
關(guān)鍵詞 超高效液相色譜；番茄醬；蘇丹紅染料；檢測
中圖分類號 O657.7+1 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2013）09-0279-02
蘇丹紅染料是非生物合成的親脂性偶氮化合物，一般不溶于水，易溶于有機溶劑，常用于汽油、機油、鞋油和汽車蠟等工業(yè)產(chǎn)品的著色[1]。近年來蘇丹紅染料被部分違法商家添加到食品表面著色以改善感官度[2]。據(jù)世界衛(wèi)生組織的國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）1995年確定，蘇丹紅屬第三類致癌物質(zhì)，它能夠使老鼠和兔子患癌癥。如果長期大劑量攝入會增加人體致癌的危險性。歐盟國家已在1995年禁止其作為食用色素，我國在《食品添加劑使用衛(wèi)生標準》中也禁止將蘇丹紅作為食品添加劑使用[3]。在全國范圍對食品中蘇丹紅染料進行了大規(guī)模的檢測，并將其納入了相關(guān)產(chǎn)品的必檢指標[2]。
番茄醬是西餐中的一種重要調(diào)味品，是增色、添酸、助鮮、郁香的調(diào)味佳品。被大量用于意大利粉中，也可蘸炸雞、炸魚和薯條。國內(nèi)對辣椒醬中蘇丹紅染料的檢測有較多報道[2-4]，但番茄醬較少。而國內(nèi)已有文獻報道檢測蘇丹紅染料殘留方法均為高效液相色譜法（HPLC）[1-2，4]，但是方法普遍存在樣品分析時間長、檢出限高等缺點。而UPLC由于采用了1.7 μm的小粒子填充柱，柱效提高，有更好的分離效率，縮短了檢測時間。超高效液相色譜快速檢測蘇丹紅染料的方法具有簡單、靈敏度高和穩(wěn)定性好等特點，能夠滿足批量樣品檢測的工作要求。
1 材料與方法
1.1 試驗材料與儀器
1.1.1 番茄醬樣品。來自于市場上購買的若干份各種品牌的番茄醬。
1.1.2 試劑。蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ對照品（購自Dr.Ehrenstorfer GmbH）。乙腈（德國Merck公司，色譜純）；乙腈、丙酮、正己烷、無水硫酸鈉（廣州化學(xué)試劑廠，AR）；中性氧化鋁（上海五四化學(xué)試劑有限公司，層析用）。
1.1.3 儀器與設(shè)備。電子天平（Precisa公司）；旋渦混合器（上海精科實業(yè)有限公司 XW-80A）；離心機（Sigma公司 3-30k）；高速勻漿機（IKA公司T-18 basic）；振蕩器（IKA公司 Ks501digital）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI公司 Rotavapor R-210）；氮吹儀（天津恒奧 HGC-24A）；Waters超高效液相色譜儀（帶紫外檢測器）；規(guī)格為20 mm×150 mm的玻璃層析柱、鐵架臺。
1.2 試驗方法
1.2.1 樣品的提取。稱取10 g（精確到0.01 g）番茄醬于100 mL離心管中，加入20 mL乙腈∶丙酮（v/v）=9∶1，勻漿，加入5 g無水硫酸鈉振蕩，5 000 r/min離心5 min，上清液移入雞心瓶，殘渣用15 mL乙腈∶丙酮（v/v）=9∶1重復(fù)提取1次，5 000 r/min離心5 min，合并上清液于雞心瓶，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干。用5 mL正己烷溶解殘渣，備用。
1.2.2 凈化。向?qū)游鲋尤? cm高的中性氧化鋁粉，用5 mL正己烷預(yù)洗，不收集。備用液直接過柱，用10 mL丙酮∶正己烷（v/v）=5∶95洗脫，收集。50 ℃氮吹至近干，用1 mL流動相溶解定容，過0.22 μm濾膜，上機。
1.2.3 色譜條件。色譜柱：ACQUITY UPLCTM BEH C18柱（2.1 mm×50.0 mm，1.7 μm）；流動相：乙腈∶水（v/v）=88∶12，等度洗脫；流速0.3 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量10 μL；檢測波長為510 nm。
2 結(jié)果與分析
2.1 提取溶劑的選擇
食品中蘇丹紅染料檢測的相關(guān)報道中提取溶劑通常有乙腈和正己烷，這2種溶劑對蘇丹紅染料的溶解度相對較好。但正己烷提取所需的溶劑量相對較多，且對蘇丹紅有干擾峰，而用乙腈作為提取液時未見有干擾峰[3]。本方法通過對乙腈、正己烷、正己烷∶丙酮（v/v）=3∶1和乙腈∶丙酮（v/v）=9∶1等4種提取溶劑對比，回收率都在75%以上。但在乙腈中加入一定量的丙酮有助于更好地溶解提取，回收率可達到83%以上。綜合考慮，選擇乙腈∶丙酮（v/v）=9∶1為提取蘇丹紅染料的提取溶劑。
2.2 凈化條件的選擇
國內(nèi)文獻報道蘇丹紅染料前處理有2種方式[1，5]。一種是樣品提取液未經(jīng)凈化就直接過濾膜上機分析。這樣簡化了樣品前處理過程，大大縮短了樣品整體檢測時間。但由于番茄醬中基質(zhì)比較復(fù)雜，樣品經(jīng)乙腈∶丙酮（v/v）=9∶1提取后存在大量的干擾物質(zhì)，影響目標物質(zhì)的定量。本方法采用的UPLC色譜柱只有1.7 μm，大量基質(zhì)干擾物質(zhì)會沉積在色譜柱進樣口和柱頭中，導(dǎo)致色譜分離能力降低，影響色譜柱壽命。另一種是使用凝膠滲透色譜（GPC）進行凈化，GPC是利用多孔凝膠對樣品組份按照分子體積大小進行分離的一種色譜方法。用GPC對樣品進行蘇丹紅染料凈化時，天然色素和食用油類等大分子物質(zhì)先流出，隨后是小分子。宋 歡等[6]就用凝膠滲透色譜法測定辣椒及其制品中蘇丹紅含量，凈化效果好，樣品潔凈無雜峰干擾，儀器實現(xiàn)了自動化連續(xù)處理，減少了工作量。但GPC價格昂貴又需要專人維護，不易普及。
本試驗分別比較了某品牌商品化的3、6、12 mL中性氧化鋁固相萃取小柱及手動填充中性氧化鋁粉玻璃層析柱的凈化效果。通過加標回收比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3、6 mL柱的回收率都低于40%，12 mL柱的回收率高于60%，但平行測試中結(jié)果偏差較大，用商品化的中性氧化鋁不太適合于蘇丹紅染料的前處理凈化。綜合考慮，本試驗采用手動填充中性氧化鋁玻璃層析柱進行凈化，減少了檢測成本，4種蘇丹紅染料在3 min內(nèi)完全分離出峰，測試的結(jié)果符合相關(guān)要求（圖1）。
2.3 方法標準曲線、檢出限及定量限
取4種蘇丹紅染料標準品，分別配制成質(zhì)量濃度為100、200、400、600、800、1 000 μg/L的系列標準溶液。在1.2.3的色譜條件下，以峰面積為y值，標準溶液的濃度為x值進行線性回歸分析，求得相關(guān)的線性方程。按本方法測定結(jié)果，以3倍信噪比（S/N）確定分析物的檢出限，10倍信噪比（S/N）為定量限?；貧w方程、相關(guān)系數(shù)以及定量的限詳見表1。
2.4 回收率與精密度
以不含4種蘇丹紅染料的番茄醬作為空白基質(zhì)添加一定量的混合標準品，做添加回收試驗，每個添加濃度重復(fù)測定6次，同時做空白試驗[7-11]。結(jié)果表明，4種蘇丹紅染料添加回收率在83.1%～90.1%，相對標準偏差（RSD）為5.6%～7.2%（表2）。說明該方法具有較好的精密度和回收率，可以滿足痕量分析要求。
3 結(jié)論
通過優(yōu)化提取溶劑、樣品凈化等前處理建立了超高效液相色譜，同時測定番茄醬中4種蘇丹紅染料的殘留量。本方法采用超高效液相色譜法實現(xiàn)了蘇丹紅染料殘留量快速高效的分離，大大節(jié)約了試劑，并降低了有機溶劑對環(huán)境的污染，較好的靈敏度和精密度滿足實際樣品檢測的需要，加回收率在83.1%～90.1%，相對標準偏差（RSD）為5.6%～7.2%，適用于番茄醬中蘇丹紅Ⅰ、蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅲ和蘇丹紅Ⅳ染料的殘留檢測。
4 參考文獻
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關(guān)鍵詞：HPLC法；阿昔洛韋；眼用凝膠；含量
單純皰疹病毒性角膜炎又稱單皰角膜炎，是由單純皰疹病毒誘發(fā)的角膜感染引起的一類眼科疾病，是目前世界上危害最為嚴重的眼科疾病之一[1]，阿昔洛韋（aciclovior）因其選擇性高、副作用小、藥物耐受好且為高特異性抗單純皰疹病毒藥物，成為目前單皰角膜炎最佳治療藥物。早期眼部用藥治療多采用眼膏或滴眼劑，因使用方便、患者接受性好等特點，被廣泛應(yīng)用，但近期研究發(fā)現(xiàn)，由于滴眼劑在眼內(nèi)停留時間較多，且容易被體內(nèi)吸收，藥物生物利用率低，重復(fù)多次應(yīng)用又可能引發(fā)較多副作用[2]。凝膠型眼用制劑的出現(xiàn)，有效解決了上述問題。阿昔洛韋凝膠劑可有效解決單皰角膜炎治療需反復(fù)用藥、生物利用率低等問題。如何快速測定此類眼用凝膠中主成分含量，有效監(jiān)測此類藥物質(zhì)量，成為眾多藥學(xué)所關(guān)注的問題。
1 材料與方法
1.1儀器與試藥 島津LC-20A型高效液相色譜儀；離心機（北京醫(yī)用離心機廠）；甲醇、冰醋酸均由國藥集團化學(xué)試劑有限公司提供，均為色譜醇；阿昔洛韋對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：150913-151102）；阿昔洛韋凝膠（江蘇圣寶羅藥業(yè)有限公司，國藥準字H19991377，批號為：140911、150212、150622）。
1.2方法
1.2.1方法學(xué)驗證
1.2.1.1色譜條件 色譜柱：ZorbaxExtendC18不銹鋼柱（250 mm×4 mm，5 μm），流動相：水-甲醇-冰醋酸（90∶10∶0.1），檢測波長：252nm，進樣量10 μl，1.0 mL/min流速，柱溫為室溫（25℃）。
1.2.1.2溶液的制備
1.2.1.2.1供試品溶液的制備 精密稱取0.3 g阿昔洛韋凝膠，加入流動相25 ml稀釋，充分混勻后，于3000 r/min，離心5 min，取上清液，0.2 um微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液做供試液。
1.2.1.2.2對照溶液的制備 精密量取阿昔洛韋對照品15 mg，置于100 ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻即得。
1.2.1.3系統(tǒng)適用性試驗
1.2.1.3.1空白對照結(jié)果 試驗中的空白溶劑選擇為流動相，取流動相適量，除不加樣品外其余操作同“1.2.1.2.1”制備空白對照，取10 ul進液相252 nm掃描，未見任何雜質(zhì)峰，對測定不會造成影響，可考慮作為空白溶劑。
1.2.1.3.2精密度試驗 精密量取20 μL對照品溶液，重復(fù)進樣6次，分別測定峰面積，并計算其相對標準偏差RSD=1.2%（
1.2.1.3.3重復(fù)性試驗 精密稱取同批號阿昔洛韋凝膠6份，根據(jù)供試品“1.2.1.2.1”項操作制備溶液，取10 μL溶液注入液相色譜儀，記錄色譜圖，可得到6份供試品溶液的相對標準偏差RSD=0.9%（
1.2.1.3.4穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液與對照品溶液，分別在0 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h精密量取10 μL注入液相色譜儀，進樣測定，對照品溶液峰面積的RSD為1.16%（
1.2.1.3.5回收率考察 分別精密稱取約10 mg同一批次的阿昔洛韋凝膠，保存至3個錐形瓶內(nèi)，依次加阿昔洛韋對照品2.23 mg、5.17和10.31 mg，根據(jù)制作“1.2.1.2.1”項步驟，取續(xù)濾液10 ul進針，對峰面積進行測定，分別計算回收率為101.23%、101.18%和99.79%，平均回收率為100.67%，RSD為1.32%，與藥典標準相符。
1.2.1.4線性關(guān)系考察 精密稱取阿昔洛韋對照品13.4 mg置于100 ml量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，再分別精密量取0.05 ml、0.10 ml、0.20 ml、0.40 ml、0.80 ml、1 ml、2 ml、5 ml、6 ml置于10 ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即得系列標準溶液，分別取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，并以峰面積對其濃度進行線性回歸，得線性方程為：Y=633417X-52341，（r=0.9996），結(jié)果表明，阿昔洛韋濃度在0.12～1.44 ug/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。
1.2.2樣品中阿昔洛韋含量測定 在同一色譜條件下分別測定阿昔洛韋對照品溶液與3批阿昔洛韋凝膠供試品溶液（取供試品0.2 g），采用峰面積歸一化法和自身對照法（不加校正因子），對供試品內(nèi)含有的阿昔洛韋含量進行測定。
2 結(jié)果
結(jié)果顯示，通過上述色譜條件測定阿昔洛韋凝膠中阿昔洛韋含量，與標識量比較結(jié)果顯示，三個批次的樣本含量分別為101.23%、100.49%、100.37%，RSD
3 討論
阿昔洛韋（C8H11N5O3）屬嘌呤類抗病毒藥物[3]，本文首先通過對其進行全波段掃描，確定252 nm作為其檢測波長，因此時吸收最大；前期試驗及文獻調(diào)查顯示，凝膠中存在大分子物質(zhì)，可能導(dǎo)致色譜柱堵塞，進而影響測定，經(jīng)試驗分析在酸性流動相處理后，對應(yīng)高聚物配合離心可有效去除，故考慮先對樣品稀釋后離心，排除干擾；在色譜條件選擇上，本文參考了早期[4]的文獻報道，結(jié)合本實驗室條件優(yōu)選所得。
經(jīng)方法學(xué)考察可知，本次實驗所選方法準確性高、精密度好、重現(xiàn)性和相關(guān)性均符合相關(guān)要求，且比較自身對照法和面積歸一化法，發(fā)現(xiàn)兩組結(jié)果基本一致，提示二者均可用于其含量計算。
參考文獻：
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關(guān)鍵詞：氣相色譜;氣質(zhì)聯(lián)用;農(nóng)藥殘留分析
目前,農(nóng)藥殘留分析方法很多,其中以色譜技術(shù)為主。常見色譜方法有氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法,新興色譜技術(shù)如免疫親合色譜法、凝膠滲透色譜法等。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)既具有氣相色譜高分離效能,又具有質(zhì)譜準確鑒定化合物結(jié)構(gòu)的特點[1],可同時、準確、快速測定微量的多種農(nóng)藥殘留。
1農(nóng)藥殘留的現(xiàn)狀及危害
20世紀50年代以來,化學(xué)合成農(nóng)藥在全世界的廣泛應(yīng)用,無疑在防治病蟲害、鏟除雜草、增加農(nóng)業(yè)產(chǎn)量方面發(fā)揮了舉足輕重的作用,對人類社會進步和生產(chǎn)力發(fā)展起到了巨大的促進和推動作用。但是農(nóng)藥是一類有毒化學(xué)物質(zhì),而且是人們主動投放到環(huán)境中的[2],長期大量使用,對環(huán)境生物安全和人體健康產(chǎn)生了較大的不利影響。近年來因農(nóng)藥污染造成人和牲畜中毒的事件屢見報道,特別是蔬菜、水果類食品的中毒。目前,農(nóng)藥已成為世界上主要的污染源之一,田間噴灑的農(nóng)藥只有10%～30%粘附在作物上,其他大部分通過各種方式散播出去,污染大氣、土壤和水等[3]。
2農(nóng)藥殘留分析技術(shù)
農(nóng)藥殘留分析是對復(fù)雜混合物中痕量農(nóng)藥的母體化合物、有毒代謝物、降解產(chǎn)物和農(nóng)藥雜質(zhì)進行的分析,是一種需要精細的微量操作手段和高靈敏度的痕量檢測技術(shù)[2]。隨著人們對食品、環(huán)境安全的日益關(guān)注以及新的、更高要求的農(nóng)藥殘留限量標準的出臺,農(nóng)藥殘留分析技術(shù)發(fā)展迅速?，F(xiàn)代農(nóng)藥殘留分析技術(shù)通常包括樣品前處理和測定兩部分。
2.1樣品前處理技術(shù)
目前,已報道或已取得廣泛應(yīng)用的新技術(shù)主要有:固相萃取(SPE)、固相微萃取(SPME)、超臨界流體提取(SFE)、加速溶劑萃取(ASE)、微波輔助萃取(MAE)等[4]。
2.1.1固相萃取(SPE)。固相萃取是液固萃取和液相色譜柱技術(shù)相結(jié)合的發(fā)展,其基本原理是利用固體吸附劑對液體樣品中目標化合物或雜質(zhì)的吸附,選用合適強度的洗脫溶劑,使目標化合物選擇性地洗脫或保留在柱上,與樣品基體和干擾物分離,從而達到分離和富集的目的。固相萃取節(jié)省時間,可減少雜質(zhì)引入,對操作者安全,重現(xiàn)性好,同時對農(nóng)藥殘留物能夠快速富集。
2.1.2固相微萃取(SPME)。固相微萃取是一種新型的無溶劑化樣品前處理技術(shù),由Pawliszyn在1989年首次報道。固相微萃取以特定的固體(一般為纖維狀萃取材料)作為固相提取器將其浸入樣品溶液或頂空提取,然后直接進行GC、HPLC等分析[5]。該技術(shù)集采樣、萃取、濃縮、進樣于一體,靈敏度高、成本低、所需樣品量少,重現(xiàn)性及線性好,操作簡單、方便快捷。它通過吸附/脫吸附技術(shù),富集樣品中的揮發(fā)性和半揮發(fā)性成分,克服了一些傳統(tǒng)樣品處理技術(shù)的缺點,已經(jīng)廣泛應(yīng)用于水、食品、環(huán)境以及生物樣品分析。SPME技術(shù)在食品分析中的應(yīng)用很廣泛,如酒、果汁、蔬菜、肉、蛋等。還用于食品中其他一些有害殘留組分的分析上,如牛奶中的磺胺類和四環(huán)素類抗生素殘留;熏制火腿中的致癌物N-亞硝胺;谷物中丙烯酞胺殘留以及人乳中多氯聯(lián)苯及其他含氯有機化合物的分析等[6]。
2.1.3超臨界流體提取(SFE)。超臨界流體(SCF)是臨界溫度(Tc)和臨界壓力(Pc)狀態(tài)下的高密度流體。超臨界流體既具有液體對溶質(zhì)有較大溶解度,又具有氣體易于擴散和運動的特點。由于超臨界流體的粘度、密度、擴散系數(shù)、溶劑化能力等性質(zhì)隨溫度和壓力變化很大[7],因此對選擇性的分離非常敏感。早在1879年,Hannay等就發(fā)現(xiàn)超臨界乙醇流體對無機鹽固體具有顯著的溶解能力,但超臨界萃取技術(shù)(SFE)卻是在近30年才迅速發(fā)展起來的一種新型物質(zhì)分離、精致技術(shù)[8]。付玉杰等[9]用SCF-CO2技術(shù)萃取甘草中甘草次酸,并與索氏提取法、超聲法進行了比較,提取率是索氏提取法的13倍、超聲法的5倍,且溶劑用量小,周期短。目前,SFE已應(yīng)用于植物樣品、動物組織、土壤、水等樣品中多種殺蟲劑、殺菌劑和除草劑的萃取。
2.1.4凝膠滲透色譜(GPC)。凝膠滲透色譜是一種快速凈化技術(shù),它是基于體積排阻的分離機理,通過具有分子篩性質(zhì)的固定相,用來分離相對分子質(zhì)量較小的物質(zhì),并且可以分析不同分子體積、具有相同化學(xué)性質(zhì)的高分子同系物。GPC現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥殘留分析中脂類提取物與農(nóng)藥的分離,是含脂類食物樣品農(nóng)藥殘留分析的主要凈化手段[10]。陸繼偉等[11]經(jīng)冰浴超聲提取,GPC凈化,測定了靈芝中24種有機磷農(nóng)藥的殘留量,回收率在75.28%~117.18%,RSD在3.19%~15.57%,效果較好。
2.1.5加速溶劑萃取(ASE)。加速溶劑萃取是在提高溫度(50～200℃)和壓力(1 000~3 000Pa)下用溶劑萃取固體或半固體樣品的新型樣品前處理方法。相比于其他萃取方法,ASE法具有快速、溶劑用量少、萃取效率高、安全等優(yōu)點[12],已被美國EPA收錄為處理固體樣品的標準方法之一。ASE現(xiàn)已在環(huán)境、藥物、食品等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用,特別是在殘留檢測方面,被用于土壤、動植物組織、蔬菜和水果等樣品中的PCB、多環(huán)芳烴、有機磷殺蟲劑、苯氧基除草劑等有害物質(zhì)的萃取。
2.1.6微波輔助萃取(MAE)。微波輔助萃取是微波和傳統(tǒng)的溶劑萃取法相結(jié)合后形成的一種新萃取方法。它是利用微波能來提高萃取速率的一種最新發(fā)展起來的技術(shù)。微波萃取具有設(shè)備簡單、萃取效率高、重現(xiàn)性好、快速、節(jié)省試劑、污染小等優(yōu)點,有較大的推廣價值。Onuska等[13]用多種溶劑從泥渣中微波提取有機氯農(nóng)藥殘留,實驗僅用3.5min就獲取了索氏萃取法6h的結(jié)果。Lopez-Avila等[14]以乙烷-丙酮(體積比為1∶1)為溶劑,在115℃下從土壤中提取有機物,萃取15min,45種有機氯農(nóng)藥中的38種回收率在80%~120%,并證明用微波萃取法所得的有機氯農(nóng)藥的回收率比索氏萃取或超聲波萃取法至少提高7%。
2.2GC及GC-MS在樣品測定中的應(yīng)用
>> 銅仁市碧江區(qū)珍珠花生中10種農(nóng)藥殘留測定 甘薯中5種有機磷農(nóng)藥殘留的快速測定方法 直接提取法檢測有機氯農(nóng)藥殘留方法探尋 大米中7種有機磷農(nóng)藥的殘留分析方法研究 氣相色譜法測定土豆中8種有機氯農(nóng)藥殘留 我國土壤中殘留有機氯農(nóng)藥的研究 蔬菜和水果中有機氯類，擬除蟲菊酯類農(nóng)藥多殘留檢測方法 GC法測定30種黔產(chǎn)中藥材中11種有機氯農(nóng)藥殘留 氣相色譜法測定草莓中9種有機磷農(nóng)藥殘留方法研究 探究有機磷殘留農(nóng)藥在蔬菜中的檢測方法 土壤中有機氯農(nóng)藥分析方法研究 徐州養(yǎng)牛帶生鮮奶中有機氯農(nóng)藥殘留水平研究 基于QuEChERS凈化―氣相色譜法檢測蔬菜中16種有機磷農(nóng)藥殘留 蔬菜中有機磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的檢測方法研究 氣相色譜―電子捕獲檢測器測定黃瓜中多種有機氯農(nóng)藥和除草劑殘留 基質(zhì)分散固相萃取―氣相色譜法測定茶葉中13種有機氯和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留 蔬菜中有機磷農(nóng)藥殘留的快速檢測方法分析 果蔬中有機磷農(nóng)藥殘留檢測方法 產(chǎn)婦體內(nèi)有機氯農(nóng)藥殘留對血中4種生殖激素水平的影響 傳感器技術(shù)在有機磷農(nóng)藥殘留檢測中的應(yīng)用 常見問題解答 當前所在位置：l.
[2] 農(nóng)業(yè)標準出版研究中心.蔬菜和水果中有機磷、有機氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥多殘留的測定：NYT 761-2008[S].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2010.
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【摘要】 目的從玉郎傘(YLS)中分離出玉郎傘多糖，并對其化學(xué)組成進行研究。方法YLS經(jīng)醇提后的藥渣用熱水提取，乙醇沉淀，Sevag試劑脫蛋白，采用DEAE纖維素（DEAE52）柱層析分離純化，氣相色譜和薄層色譜分析其組成。結(jié)果分離得到的YLS多糖經(jīng)Sephadex75凝膠柱層析，硫酸-苯酚法以及高效凝膠滲透色譜法(HPGPC) 證實為單一多糖，紫外掃描顯示無核酸和蛋白特征吸收峰，薄層色譜和氣相色譜表明由葡萄糖和阿拉伯糖組成。結(jié)論YLS多糖首次從YLS中提取獲得，為YLS主要成分之一。
【關(guān)鍵詞】 玉郎傘 多糖 分離純化 組成玉郎傘（YLS）
原植物經(jīng)考證為蝶形花科植物疏葉崖豆Millettia pulchra Kurzvarlaxior (Dunn) Z. Wei的塊根。民間常用于高血壓病、跌打損傷和風(fēng)濕病的治療，也用于治療智力減退、消化不良、營養(yǎng)不良和病后虛弱等。藥理實驗表明，YLS多糖能明顯延長小鼠游泳時間、耐缺氧時間及耐高溫時間，顯著提高小鼠血清SOD、GSHPx活性及減少MDA含量，具有較好的抗衰老作用［1］。本實驗對YLS多糖作了分離純化并對其組成性質(zhì)進行研究。現(xiàn)報道如下。
1 材料與儀器
1.1 材料與試劑玉郎傘飲片，購于南寧醫(yī)藥公司；D木糖，生化試劑，上海伯奧生物科技有限公司，批號011130；L（＋）－鼠李糖，生化試劑，北京化學(xué)試劑公司，批號011204；阿拉伯糖，生化試劑，武漢生命技術(shù)有限公司，批號030625；葡萄糖，分析純，上海伯奧生物科技有限公司，批號030305；D（＋）半乳糖，生化試劑，sigma ，批號 B002211。DEAECellulose52， whatman 批號010410；Sephadex G75， pharmacia， 批號：279867；胰蛋白酶，美國sigma，批號030409。用于氣相色譜分析的試劑均為色譜純，其余試劑為分析純。
1.2 儀器1525 WATERS高效液相色譜儀，美國 WATERS公司；4890D氣相色譜儀，美國Agilent公司；TU1800SpC紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司。
2 方法
2.1 粗多糖的提取 玉郎傘飲片粉碎后，加70%乙醇回流提取除去脂溶性雜質(zhì)，藥渣加蒸餾水煮3次，3 h/次，合并濾液，離心分離，濃縮至適當體積，加入5倍量95%乙醇，醇析24 h，過濾，依次用95%乙醇、丙酮洗滌多次，沉淀物加蒸餾水溶解，加入適量胰蛋白酶，搖勻，37 ℃水浴保溫12 h，采用Sevage法除去蛋白［2］，藥渣用蒸餾水溶解，透析48 h，除去小分子雜質(zhì)及色素，透析后濃縮至適當體積，加5倍無水乙醇，醇析8 h，收集沉淀物，真空干燥得YLS粗多糖。
2.2 多糖純化 YLS粗多糖適量，加蒸餾水溶解，上已處理好的DEAE52纖維素（OH，400 mm×26 mm）柱層析，用蒸餾水洗脫，流速1 ml·min-1，分部收集，每管5 ml，用硫酸苯酚法顯色［3，4］，收集合并含糖洗脫液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干洗脫液，得白色YLS多糖。
2.3 多糖的純度鑒定
紫外光譜：取上述分離純化后的多糖，配成0.1%水溶液，在TU1800SpC紫外可見分光光度計對200～400 nm區(qū)間掃描。
凝膠柱層析：YLS多糖經(jīng)Sephadex G75柱層析，蒸餾水洗脫，流速0.1 ml/min，每管1 ml分部收集，苯酚硫酸顯色，以管號為橫坐標，光密度為縱坐標，根據(jù)分部收集中出現(xiàn)的峰數(shù)和形狀斷定多糖的純度。
高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)［5］：美國Waters高效液相色譜儀，2410示差折光檢測器（附加GPC軟件）。色譜柱為日本TOSOH公司TSKgel G3000 pWxl凝膠色譜柱(300 mm×7.8 mm)，流動相為0.7%硫酸鈉水溶液，流速0.6 ml·min-1，柱溫35 ℃，進樣量20 μl。
2.4 多糖的組成分析
薄層色譜分析［6，7］： 將60 mgYLS多糖加入8 ml 2 mol·l-1的硫酸中，加入N2除O2封管，105 ℃烘箱中水解8 h，水解液用飽和Ba(OH)2溶液中和，離心去除BaSO4沉淀，上清液減壓濃縮至干，得多糖水解物備用。取1%的多糖水解物于高效硅膠G薄層板（10 cm×20 cm）上點樣，以標準單糖為對照。
展開系統(tǒng)：醋酸乙酯∶異丙醇∶乙酸∶水＝11∶4∶4∶1（V/V）
顯色：10%硫酸乙醇溶液，噴霧后于105 ℃加熱10 min。
氣相色譜分析［4，6，8］：取上述水解多糖30 mg按下列步驟進行，加入30 mg鹽酸羥胺和1.0 ml吡啶于90 ℃恒溫水浴中振蕩，加熱反應(yīng)30 min，取出冷卻至室溫，加入1.0 ml醋酸酐，于90 ℃恒溫水浴中乙?；?0 min，生成具有揮發(fā)性的糖腈乙酸酯衍生物。反應(yīng)產(chǎn)物用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，殘渣用2 ml氯仿溶解，取樣，進行氣相色譜分析，以標準單糖衍生物為對照。
色譜條件：Hp Agilent 4890D氣相色譜儀。色譜柱為石英毛細管柱Hp5（0.53 mmid×15 m）；FID檢測器（氫火焰）；柱室溫度200 ℃；氣化溫度270 ℃；燃氣H2，0.22 MPa；載氣N2，0.19 MPa，空氣助燃0.30 MPa；進樣量1 μl；程序升溫，開始時，150 ℃保持1 min，接著以5 ℃·min-1升至200 ℃，并于200 ℃保持10 min。
3 結(jié)果
分離純化得到的YLS多糖呈白色粉沫，易溶于水，不溶于乙醇、丙酮等有機溶劑。
3.1 紫外光譜分析YLS多糖在250～280 nm之間無吸收，說明其中無蛋白質(zhì)、氨基酸及核酸(見圖1)。
3.2 凝膠柱層析洗脫曲線為單一洗脫峰，表明所得多糖純度較高(見圖2)。
3.3 HPGPC測定結(jié)果 在圖譜中只有單一峰，證明純度較高（見圖3）。
3.4 薄層色譜分析見圖4。在薄層板上從左至右依次為木糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖和YLS多糖水解樣品（有兩個斑點，分別表示為YLS R1和YLS R2）。結(jié)果表明，玉郎傘多糖主要由葡萄糖和阿位伯糖組成（各糖Rf值見表1）。表1 YLS多糖水解物和標準單糖的Rf
3.5 氣相色譜分析 YLS多糖水解物在氣相色譜上出現(xiàn)兩個峰，其保留時間分別為9.456 min和14.980 min，與阿拉伯糖和葡萄糖的保留時間一致(見圖5～6)，說明YLS多糖是由阿拉伯糖葡萄糖兩種糖組成，與薄層色譜的結(jié)果相符，其百分組成（面積歸一化法）見表2。表2 YLS多糖成分單糖百分組成
4 討論
本實驗利用較為常規(guī)的方法提取YLS多糖，經(jīng)DEAE52和Sephadex G75分離純化，紫外、凝膠柱層析、氣相色譜分析，證明所得多糖純度較高，并首次證實YLS多糖是由葡萄糖和阿拉伯糖組成。YLS中多糖含量多，作用廣泛，具有較高的研究和開發(fā)價值。
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關(guān)鍵詞：氣相色譜法；中藥；應(yīng)用；定性鑒別
氣相色譜是一種非常成熟的分析化學(xué)的分支，俄國植物學(xué)家茨維特1903年發(fā)現(xiàn)色譜，接著馬丁和辛格1941年提出分配色譜的概念，然后1952年又發(fā)明了氣-液色譜。而我國在1956年就對氣相色譜做了很多的研究，并且廣泛應(yīng)用在化工、石油、藥物等方面。隨著科技的不斷發(fā)展，氣相色譜也有了很大的發(fā)展，并且其應(yīng)用范圍不斷擴大。在我國，中藥的質(zhì)量研究是中藥研究和應(yīng)用的重難點，發(fā)現(xiàn)中藥中發(fā)揮藥效的物質(zhì)、有毒的物質(zhì)、藥效發(fā)揮的機理，然后控制中藥的質(zhì)量，可以有效的確保重要的安全和藥效。中藥成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，同時由于中藥的產(chǎn)地、品種、收獲期、加工和制劑的生產(chǎn)工藝不同可能會導(dǎo)致中藥的質(zhì)量發(fā)生變化。為了能夠保證中藥的安全和藥效，需要一種分析方法能夠直觀、可靠、簡單的體現(xiàn)出中藥藥效發(fā)揮作用的方法以控制中藥的質(zhì)量。所以氣相色譜可以應(yīng)用于中藥的定性分析、定量分析、中藥雜質(zhì)成分分析和有毒成分分析等方面。
1 氣相色譜法應(yīng)用于中藥的定性鑒別
控制中藥質(zhì)量的首要辦法就是鑒別中藥的品種和真?zhèn)?。如果嚴格控制原料和工藝條件就可以保證中藥制劑成分組成的穩(wěn)定。氣相色譜可以對具有揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的物質(zhì)進行分離和分析，所以氣相色譜和質(zhì)譜聯(lián)合使用時就適合研究中藥中揮發(fā)性成分的指紋圖譜。蘇薇薇等研究了烏雞白鳳丸的氣相色譜指紋特征，認為這種方法可以對烏雞白鳳丸的真?zhèn)芜M行鑒別。馮毅凡等應(yīng)用氣相色譜分析了華佗再造丸和主要藥味的指紋圖譜，根據(jù)指紋圖譜可以得到各個成分的含量，然后評價華佗再造丸的優(yōu)劣。歐陽臻等應(yīng)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對不同產(chǎn)地的17個茅蒼術(shù)樣品進行了分析，對茅蒼術(shù)揮發(fā)油的指紋圖譜進行研究，對結(jié)果進行計算以后，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的茅蒼術(shù)和道地產(chǎn)地的比較有很大的差異，為鑒別與評價茅蒼術(shù)的質(zhì)量以及區(qū)別真品和偽品提供了一定的參考依據(jù)。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)也能對復(fù)雜的糖類物質(zhì)進行定性分析，并且具備很大的優(yōu)勢。在研究白術(shù)多糖時，梁中煥分析了白術(shù)水溶性多糖（AMP），顯示單糖由Glc、Gal、Rha、Man組成，其組成比例為7.36：1.00：3.05：1.52，AMP甲基化后，水解還原乙酰化后得到甲基化糖醇乙酸酯，在進行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析，得出AMP中糖的連接方式和每種連接鍵的比例。廖遠熹等應(yīng)用靜態(tài)頂空-毛細管氣相色譜法檢測6種不同產(chǎn)地柴胡的揮發(fā)性成分，然后聯(lián)合應(yīng)用檢索和保留指數(shù)的方法定性分析檢出的揮發(fā)性成分，得出的結(jié)論是6種柴胡定性相對含量大于0.2%的揮發(fā)性成分有60個，在這些揮發(fā)性成分中脂肪醛類物質(zhì)占25%～44%，比重最大。
2 氣相色譜法應(yīng)用于中藥的定量分析
一般的中藥含量檢測主要是測定已經(jīng)知道的成分或者指標性成分，測定的成分個數(shù)很少，只有一兩個主要成分。逐漸提高的中藥質(zhì)量標準和不斷發(fā)展的質(zhì)量控制技術(shù)使測定成分的種類也在增多，特別是中藥復(fù)方，一般都要求對很多成分進行測定。氣相色譜的分離能力很強，所以經(jīng)常用于測定中藥中的揮發(fā)性成分，例如芳香醇，同時氣相色譜也可以測定中藥中發(fā)生衍生化反映的其它成分，例如生物堿。2005年版一部的《中國藥典》應(yīng)用氣相色譜測定的中藥成分的含量有47項，2010年版一部的《中國藥典》增加到了75相。劉宇等建立的應(yīng)用氣相色譜對檀香通膠囊中冰片和薄荷腦兩種組分含量進行測定，然后嚴格控制檀香通膠囊的質(zhì)量。劉云召等應(yīng)用在應(yīng)用水蒸氣蒸餾法對糙葉敗醬植物的三個不同位置的揮發(fā)油分別提取以后，在應(yīng)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對其化學(xué)成分進行分析和鑒定，在對結(jié)果進行分析以后的得出糙葉敗醬的根、根莖、莖、葉中的揮發(fā)性成分無論是在化學(xué)組成還是在成分含量上都存在著一定的差異。
3 氣相色譜法應(yīng)用于檢測中藥的雜質(zhì)成分和毒性成分
雜質(zhì)指的是在制備和貯存藥物的過程中，由于藥物本身的性質(zhì)和和合成方法很有可能產(chǎn)生一定的雜質(zhì)，一般指的是有機雜質(zhì)，主要包括殘留溶劑和手性化合物中沒有特殊毒性的對映體。他們的來源主要是最初的原料和本身具有的雜質(zhì)、生產(chǎn)過程中發(fā)生反應(yīng)時的中間產(chǎn)物以及發(fā)生副反應(yīng)的產(chǎn)物、中藥成品在貯存過程中降解產(chǎn)物等。如果中藥產(chǎn)品中含有雜質(zhì)灰度中藥的藥性和穩(wěn)定性產(chǎn)生影響，甚至?xí)：θ说慕】?。因此檢測中藥的質(zhì)量、控制中藥的純度可以有效的保證中藥產(chǎn)品的安全有效。國際人用藥品注冊和醫(yī)藥技術(shù)協(xié)會準則要求藥物中的雜質(zhì)不得超過0.1%，而毒性藥物的要求更高，如果藥物中雜質(zhì)高于這個水平就要應(yīng)用選擇性好的辦法對其進行定量分析，特別是對于高于0.1%的雜質(zhì)要對其毒性進行研究。
郭萬周等應(yīng)用毛細管氣相色譜對南陽道地藥材唐半夏的有機農(nóng)藥殘留進行測定，結(jié)果表明這種方法非常簡，分離很高效，分析很迅速，有很高的的靈敏度，可以廣泛應(yīng)用于分析有機氯農(nóng)藥方面。
雖然氣相色譜可以對物質(zhì)進行分離，可以將主要成分對微量成分的干擾排除，可是這種方法對樣品提出了可以氣化的要求，因此樣品的揮發(fā)性是限制方法使用的一個重要因素。根據(jù)有關(guān)統(tǒng)計顯示在將近300萬個有機化合物中，能夠和字節(jié)應(yīng)用氣相色譜進行分析的只有20%。所以氣相色譜的應(yīng)用有一定的限制。
綜上所述，氣相色譜方法的應(yīng)用有一定的限制，可是近期出現(xiàn)了很多新的領(lǐng)域，使其發(fā)展方向為靈敏度更高、選擇性更強、更加簡捷。氣相色譜在中藥的質(zhì)量研究中發(fā)揮的作用越來越大，它的不斷發(fā)展必將促進中藥質(zhì)量的研究水平和控制水平，就能建立一個全面有效的現(xiàn)代中藥質(zhì)量監(jiān)控體系，使中藥的發(fā)展和國際化有一定的技術(shù)基礎(chǔ)。
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