拉曼光譜在檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用分析
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拉曼光譜（Ramanspectra）屬于散射光譜范疇，是光與物質(zhì)相互作用而產(chǎn)生的［1］。在20世紀(jì)20年代由印度科學(xué)家C．V．拉曼首次發(fā)現(xiàn)并命名。單色光入射到某一介質(zhì)后產(chǎn)生的散射光大部分只發(fā)生方向的改變，其頻率與入射光保持一致，稱為瑞利散射；另有極少數(shù)散射光，其傳播方向及光波頻率均發(fā)生改變，這樣的散射就稱為拉曼散射［2］。拉曼首次提出分子可以改變?nèi)肷涔忸l率的理論，且改變量與散射層面分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)相關(guān)聯(lián)。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)散射層面的分子結(jié)構(gòu)、分子基團(tuán)以及電子化環(huán)境均會(huì)對(duì)散射光頻率產(chǎn)生影響，而這些影響是根據(jù)材料特定的，從而可以通過散射光特點(diǎn)對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析［3］。由于拉曼光譜技術(shù)及由拉曼光譜術(shù)衍生出的亞技術(shù)在物質(zhì)檢測(cè)方面具有高效、簡(jiǎn)便、無破壞性、成本低、非接觸性、樣本量少、樣本無需特殊制備、可重復(fù)性高、穩(wěn)定且不會(huì)對(duì)被試樣本造成物理和化學(xué)分解破壞等特點(diǎn)已被廣泛應(yīng)用于化工、刑偵、生物制藥、醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)等領(lǐng)域，并取得了多項(xiàng)進(jìn)展，是目前無損分析檢測(cè)領(lǐng)域的關(guān)注焦點(diǎn)［4－6］。近年來利用拉曼光譜技術(shù)開展的各項(xiàng)病變組織的檢測(cè)和疾病診斷分析引起了醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注，也為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)敞開了新的大門，促進(jìn)了疾病診斷技術(shù)的發(fā)展［7］。本文就拉曼光譜在檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用展開綜述。
1拉曼光譜在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用
1．1在病原微生物檢測(cè)中的應(yīng)用
微生物細(xì)胞膜表面有大量已知的生化成分可以看作是微生物的特征性標(biāo)志，因而可以作為菌種快速識(shí)別和鑒定的判斷標(biāo)準(zhǔn)。利用拉曼光譜可以在不依賴培養(yǎng)基的情況下直接對(duì)患者體內(nèi)分離下來的或?qū)嶒?yàn)室中保存的單一菌種或混合菌群進(jìn)行快速鑒別及分析［8］。美國華盛頓州的研究人員利用拉曼光譜對(duì)從臨床患者和醫(yī)院環(huán)境中分離得到的7株副溶血弧菌進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)7株菌株都有其各自不同于其他菌株的特征峰。他們還將其中2株副溶血弧菌菌株分別按照1∶2、1∶1和2∶1的比例混勻后分別利用拉曼光譜檢測(cè)，結(jié)果顯示可以通過2株細(xì)菌各自的特征峰將兩者明確區(qū)別開來，其中一株副溶血弧菌的特征峰出現(xiàn)在了1002cm－1、1177cm－1和1532cm－1處，而另一株副溶血弧菌的特征峰卻分別出現(xiàn)在了525cm－1、738cm－1、1319cm－1和1639cm－1處，證明拉曼光譜無論在單一菌種標(biāo)本還是混合菌群標(biāo)本中均具有良好的分析鑒定能力［9］。另有研究發(fā)現(xiàn)結(jié)合使用拉曼光譜和化學(xué)計(jì)量法可以鑒別微生物的種類及各自血清型，已有實(shí)驗(yàn)利用銀納米顆粒作為基底對(duì)綠豆芽中的李斯特菌、霍亂弧菌、金黃色葡萄球菌等6種食物源性致病菌進(jìn)行了拉曼光譜的鑒定和區(qū)分［10］。有研究報(bào)道對(duì)日常生活中主要的食物源性致病菌進(jìn)行了拉曼光譜分析，從而對(duì)細(xì)菌進(jìn)行等級(jí)劃分，第一級(jí)便是區(qū)分革蘭陽性菌和革蘭陰性菌，另外通過各自特征峰區(qū)別不同細(xì)菌菌屬，結(jié)果顯示各級(jí)的識(shí)別結(jié)果準(zhǔn)確度均在91％以上［11］。利用拉曼光譜技術(shù)與微流控芯片相結(jié)合的辦法，毛麗華等人設(shè)計(jì)并建立了拉曼光譜－微流控芯片自動(dòng)化檢測(cè)系統(tǒng)，檢測(cè)并統(tǒng)計(jì)了珠蛋白生成性障礙貧血型紅細(xì)胞與健康人紅細(xì)胞的拉曼光譜值，通過在1004cm－1、1130cm－1、1450cm－1等拉曼光譜特征峰的數(shù)據(jù)對(duì)比，發(fā)現(xiàn)了珠蛋白生成障礙性貧血型紅細(xì)胞的血紅蛋白寬度較健康人紅細(xì)胞廣，并以此發(fā)現(xiàn)了新的快速、便捷的檢測(cè)珠蛋白生成障礙性貧血的檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)技術(shù)。另有研究者也利用拉曼光譜技術(shù)與微流控芯片相結(jié)合的辦法從十多種細(xì)菌混合的菌群中對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌進(jìn)行了快速分析研究。結(jié)果表明耐甲氧西林金黃色葡萄球菌較其他細(xì)菌有其獨(dú)特的拉曼波峰，并且整個(gè)檢測(cè)過程用時(shí)只需20s時(shí)間，在檢驗(yàn)精度上也與傳統(tǒng)PCR技術(shù)、免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)所得到的結(jié)果相似［12］。該方法簡(jiǎn)便快速，安全可靠，非常適合用于衛(wèi)生稽查部門的快速檢驗(yàn)。
1．2在腫瘤檢驗(yàn)中的應(yīng)用
目前在全世界范圍內(nèi)依然沒有很好的針對(duì)腫瘤的治療手段，腫瘤的分期對(duì)預(yù)后起著決定性的影響，那么對(duì)腫瘤的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療就擺在了尤為突出的地位［13］。在腫瘤組織中，在細(xì)胞發(fā)生病理學(xué)手段可觀測(cè)到的形態(tài)惡變之前，其實(shí)已經(jīng)存在由細(xì)胞增殖分裂分化或一些信號(hào)蛋白的產(chǎn)生等引起的細(xì)胞中遺傳物質(zhì)、蛋白質(zhì)和脂類的結(jié)構(gòu)和含量改變，而這些細(xì)微的改變可以及時(shí)通過拉曼光譜檢測(cè)反映出來［14］。因而在腫瘤檢驗(yàn)中拉曼光譜技術(shù)具有傳統(tǒng)病理學(xué)檢測(cè)所無法替代的功能用途，對(duì)腫瘤的早期診斷有巨大幫助。實(shí)驗(yàn)證明拉曼光譜可用于癌變組織與正常組織的鑒別。早在1991年就有人率先對(duì)拉曼光譜的腫瘤檢驗(yàn)學(xué)價(jià)值進(jìn)行了報(bào)道。他們發(fā)現(xiàn)正常乳腺組織與腫瘤組織甚至良性腫瘤與惡性腫瘤的拉曼光譜在700～1900cm－1存在著明顯差別，且對(duì)應(yīng)的各自拉曼峰相對(duì)強(qiáng)度也存在顯著差異［15］。從此掀開了拉曼光譜應(yīng)用于早期腫瘤診斷的新時(shí)代。Gawinkowski等［16］對(duì)拉曼光譜技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)設(shè)計(jì)了快速近紅外拉曼光譜檢測(cè)系統(tǒng)，進(jìn)一步提高了檢測(cè)效率，可在5s內(nèi)快速測(cè)得活體皮膚的拉曼光譜。隨即該科研團(tuán)隊(duì)利用此系統(tǒng)對(duì)肺癌組織進(jìn)行拉曼光譜檢測(cè)，結(jié)果顯示肺癌組織的拉曼光譜特征與正常肺組織之間存在明顯差別。此后，該科研小組又成功獲得了亞洲人種皮膚黑色素組織的拉曼光譜數(shù)據(jù)。在對(duì)胃癌的在體拉曼檢測(cè)中研究人員將拉曼光譜技術(shù)與微型攝像機(jī)、圖像分光儀、雙極管激光發(fā)生器等結(jié)合建立了新型拉曼內(nèi)鏡系統(tǒng)，也推動(dòng)了內(nèi)鏡技術(shù)的發(fā)展［17］。有學(xué)者利用激光作為拉曼光譜的激發(fā)光源，對(duì)15例手術(shù)切除且經(jīng)病理確診為基底細(xì)胞癌的組織標(biāo)本進(jìn)行拉曼照射，同時(shí)與正常皮膚組織進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果顯示通過拉曼光譜檢測(cè)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)基底細(xì)胞癌的高靈敏度診斷［18］。在對(duì)鼻咽癌組織和正常鼻咽組織的拉曼光譜比較中也有相似發(fā)現(xiàn)，它們?cè)?290～1320cm－1，1420～1470cm－1和1530～1580cm－1這3處波段區(qū)間均存在明顯特征差異，可以作為鑒別要點(diǎn)。另有研究人員選用830nm波長激光對(duì)甲狀旁腺腺瘤組織標(biāo)本及增生組織標(biāo)本中的結(jié)節(jié)區(qū)域進(jìn)行拉曼照射，重復(fù)了四十多次試驗(yàn)，比較發(fā)現(xiàn)二者的拉曼光譜比較相似，但在蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等某些特定波段仍存在可區(qū)別的差異，建立線性分析的數(shù)學(xué)模型可以很好地將二者區(qū)別開來［19］。對(duì)人體多處腫瘤組織的拉曼檢測(cè)均得到了較好的鑒別指標(biāo)，預(yù)示著拉曼光譜在腫瘤學(xué)檢驗(yàn)中將有寬廣的發(fā)展空間。
1．3在藥物分析檢測(cè)中的應(yīng)用
拉曼光譜較早即應(yīng)用于藥物檢驗(yàn)領(lǐng)域。早期便有科研人員用共聚焦拉曼光譜儀對(duì)鹽酸曲馬多進(jìn)行了檢測(cè)，所獲得的拉曼譜帶顯示圖譜峰形良好，峰強(qiáng)明顯，可以較準(zhǔn)確地反映出鹽酸曲馬多的化學(xué)結(jié)構(gòu)信息［20］。研究人員分析了倍他米松磷酸鈉和地塞米松磷酸鈉這兩種差向異構(gòu)體的化學(xué)結(jié)構(gòu)差異，分別對(duì)其固態(tài)及水溶飽和態(tài)進(jìn)行了常規(guī)拉曼光譜檢測(cè)，并進(jìn)一步對(duì)以銀膠為基底的這兩種藥物進(jìn)行了增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)分析，成功建立了這兩種差向異構(gòu)體的拉曼區(qū)分系統(tǒng)，可以實(shí)現(xiàn)其快速區(qū)分鑒別的目的［21］?？蒲腥藛T采用傅里葉變換拉曼光譜法對(duì)不同產(chǎn)地且不同采集時(shí)間的野生及人工種植黃芩進(jìn)行了分析研究，結(jié)果顯示利用該方法對(duì)中藥材的質(zhì)量鑒定較傳統(tǒng)鑒別方法更快速簡(jiǎn)便且不會(huì)對(duì)受檢樣品造成破壞，值得推廣。有學(xué)者在前人基礎(chǔ)上開創(chuàng)性地將拉曼光譜技術(shù)與光纖傳感技術(shù)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了甲硝唑片的快速無損鑒別，尤其適合于藥品監(jiān)管部門對(duì)藥品快速檢驗(yàn)。
1．4在眼部疾病檢驗(yàn)中的應(yīng)用
晶狀體是一具有高濃度蛋白質(zhì)的雙凸面透明組織，其內(nèi)蛋白變化對(duì)晶狀體功能改變具有決定性作用，對(duì)人眼屈光調(diào)節(jié)也有重要意義。利用拉曼光譜對(duì)晶狀體蛋白質(zhì)的亞結(jié)構(gòu)例如：氨基酸亞基、二硫鍵、羧基、巰基等的分析可以幫助人們更好地認(rèn)識(shí)晶狀體及其調(diào)節(jié)模式。拉曼光譜技術(shù)引入眼部疾病的研究首先是測(cè)定了牛晶狀體中α、β和γ蛋白的拉曼圖譜，結(jié)果顯示α蛋白主要集中于核部而β蛋白主要集中于皮質(zhì)部［22］。Short等［23］測(cè)試了紫外線誘導(dǎo)下的兔白內(nèi)障晶狀體拉曼光譜，結(jié)果顯示氨基酸殘基中的羥基譜線強(qiáng)度顯著增加，無法與水形成氫鍵，從而科學(xué)地解釋了白內(nèi)障晶狀體中水分的缺失。與此同時(shí)，研究中發(fā)現(xiàn)了多肽水解物的組成成分鄰氨基苯甲酸，暗示著光化學(xué)反應(yīng)可以造成色氨酸殘基的下降。綜合現(xiàn)有發(fā)現(xiàn)，他們提出了紫外線誘導(dǎo)白內(nèi)障發(fā)生的熱損傷學(xué)說。研究人員測(cè)試了誘發(fā)哺乳動(dòng)物白內(nèi)障的致病性光譜，以6月齡家兔為陰性對(duì)照組，以7月齡糖尿病家兔為糖尿病組，對(duì)比發(fā)現(xiàn)在900～1700cm－1，并無明顯差異，而在800～850cm－1兩組差異明顯［24］。分析后認(rèn)為誘發(fā)晶狀體混濁的主要原因是α、β和γ晶體蛋白的不良聚合反應(yīng)。
1．5在骨科疾病檢測(cè)中的應(yīng)用
絕大部分生物樣本都有自體熒光，而熒光的強(qiáng)背景會(huì)對(duì)拉曼光譜造成很大的干擾，從而影響拉曼光譜的準(zhǔn)確性。雖然關(guān)于引起骨組織光譜背景的物質(zhì)尚不明確，但很有可能是一些有機(jī)基質(zhì)中的某些非膠原蛋白分子［25］。如果在未處理的情況下，利用拉曼光譜對(duì)骨組織的檢測(cè)很不準(zhǔn)確。隨后熊義等［26］發(fā)現(xiàn)了通過雙氧水法降低骨組織光譜背景的方法，從而為拉曼光譜在骨組織中的研究打開了大門。骨組織在發(fā)育成熟后其密度與硬度即隨生物力學(xué)環(huán)境的改變而改變，稱為骨重建。在人體整個(gè)生命進(jìn)程中，骨質(zhì)會(huì)伴隨著有所改變，利用拉曼光譜可以對(duì)這一過程進(jìn)行深入研究。一旦吸收與沉積的動(dòng)態(tài)平衡被打破，則會(huì)造成不同類型的骨科疾病。Oshokoya等［27］建立了以拉曼光譜為研究手段的外力作用下的顱縫早閉模型，研究內(nèi)容涉及顱骨成分、骨質(zhì)及基質(zhì)的相對(duì)含量和分布。顱縫早閉癥是一種由多病因造成的顱縫發(fā)育異常綜合征，在嬰幼兒屬于常見疾病，由于顱縫過早閉合，限制了顱腔的容積，不利于智力的發(fā)展。結(jié)果顯示在非軸向壓力的作用下成骨區(qū)的前端礦物含量相比無壓力的狀態(tài)下有所下降，其原因可能是礦物沉積不完全［28］。在成骨不全癥的研究中，有學(xué)者利用拉曼光譜證實(shí)了成骨不全癥小鼠在6月齡后的骨強(qiáng)度增長不是由于骨形態(tài)改變引起的，而是由于骨基質(zhì)的改進(jìn)而達(dá)成的［29］。
2展望
縱觀歷史，人們已針對(duì)各種動(dòng)物各種組織器官開展了大量的拉曼光譜研究并獲得很多突破性的進(jìn)展，發(fā)明了許多新的檢驗(yàn)技術(shù)。拉曼光譜在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的作用越來越凸顯，并且越來越多的科技報(bào)道證明拉曼光譜技術(shù)應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)與特點(diǎn)，諸如快速、準(zhǔn)確、廉價(jià)、可靠等。即使前途一片大好，拉曼光譜技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)中的應(yīng)用仍存在很多問題亟待解決，例如尚未建立不同物質(zhì)的拉曼光譜特征峰信號(hào)庫、如何建立針對(duì)具體疾病的拉曼檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)、如何建立活體組織的拉曼檢驗(yàn)系統(tǒng)、如何排除復(fù)雜組織和成分的干擾、怎樣更好地與現(xiàn)行主流檢驗(yàn)體系相融合等。目前仍留有很多關(guān)鍵性的問題亟待解決，拉曼光譜技術(shù)在檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中的大面積普及依然任重道遠(yuǎn)。
作者:郭美 魏昆 毛莉 劉曉紅 黃君富 府偉靈 審校 單位:第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院檢驗(yàn)科