干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)精選(九篇)
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第1篇：干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)范文
【摘要】
目的 建立Wistar大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）分離、培養(yǎng)的方法，并進(jìn)行鑒定、標(biāo)記。方法 采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)大鼠的MSCs。采用相差顯微鏡觀察MSCs的形態(tài)學(xué)特征；流式細(xì)胞儀檢測(cè)第3代細(xì)胞表面標(biāo)志抗原CD29、CD44、CD34和CD45的表達(dá)率；電鏡檢查第3代MSCs超微結(jié)構(gòu)。DAPI標(biāo)記MSCs為下一步進(jìn)行體內(nèi)細(xì)胞移植示蹤。結(jié)果 原代培養(yǎng)的MSCs于6～8 h后貼壁，6 d左右形成集落，14 d 左右可達(dá)到80%～90%融合。第3代細(xì)胞表面標(biāo)記物CD29，CD44，CD34和CD45的陽性率分別為98.6 %，78.2%，0.0%，0.3%。超微結(jié)構(gòu)清晰，可見細(xì)胞器，如線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體，細(xì)胞核呈圓形或不規(guī)則，可見較多微絨毛。DAPI可良好標(biāo)記MSCs細(xì)胞核，呈藍(lán)色熒光。結(jié)論 采用全骨髓貼壁培養(yǎng)的方法能夠成功分離和培養(yǎng)大鼠的MSCs，在第3代可獲得高純度MSCs。DAPI可以作為一種示蹤劑標(biāo)記MSCs。
【關(guān)鍵詞】 細(xì)胞培養(yǎng)；間充質(zhì)干細(xì)胞；種子細(xì)胞；示蹤劑
【Abstract】 Objective To establish a method for isolation and culture of bone marrow mesenchymal stem cells(MSCs) from Wistar rats in vitro，and to identify characteristic of the cells and to label them after culture expansion.Methods MSCs were isolated and cultivated from the bone marrow of Wistar rats by adherent method.The morphology of MSCs was observed under phase contrast microscope.The expression of CD29 ， CD44 ， CD34 and CD45 of the third generation cells were analyzed by flow cytometry. Electron microscopic features were also observed and MSCs were labeled by DAPI. Results After 6 to 8 h primary culture ， MSCs adhered to plastic surface of the culture dish. About 6 d later ， the cells proliferated in colonies.Primary MSCs reached 80%～90%of confluence in 14 d approximately.The positive rates of CD29 ， CD44 ， CD34 ， and CD45 in MSCs at third generation were 98.6% ，78.2% ，0.0% ， and 0.3% respectively. Under the electron microscope MSCs had plentiful cytoplasm with mitochondria rough endoplasmic reticula and Golgi complexes.Their nuclei were round or irregular and there were plenty of microvilli on the surface. All of the MSCs after labeling by DAPI showed blue fluorescence by fluoroscope.Conclusions Mesenchymal stem cells can be successfully isolated and cultivated by adherent method.And higher purity MSCs can be picked up after culture expansion at P3. DAPI can be an effective tracer agent to label MSCs.
【Key words】 Cell culture;Mesenchymal stem cells;Seed cells; Tracer agent
骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一類具有自我更新和多向分化潛能的非造血干細(xì)胞，可以向骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、干細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞以及心肌細(xì)胞分化〔1，2〕，具有高度可塑性，易于體外擴(kuò)增，因其來源充足、取材方便，體外增殖能力相對(duì)較強(qiáng)，而且在異體移植中排斥反應(yīng)小，被認(rèn)為是組織工程和基因工程的理想種子細(xì)胞，為心血管疾病、神經(jīng)疾病和骨關(guān)節(jié)疾病的治療提供了一條全新的治療方案。本文在總結(jié)貼壁分離法培養(yǎng)MSCs的基礎(chǔ)上，優(yōu)化MSCs純化、鑒定、標(biāo)記的方法，以獲得穩(wěn)定的培養(yǎng)體系，為應(yīng)用組織工程技術(shù)提供大量的種子細(xì)胞。
1 材料與方法
1.1 動(dòng)物
清潔級(jí)雄性Wistar大鼠(3周鼠齡，60～70 g)，吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。
1.2 主要試劑和藥品
低糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，特級(jí)胎牛血清(Gibco公司)，胰酶(Sigma公司)，亞美尼亞倉(cāng)鼠抗大鼠CD29Alexa Fluor (Biolegend公司)，小鼠抗大鼠CD45過氧化物酶（FITC）(Biolegend公司)，小鼠抗大鼠CD44PE (Santa Cruz 公司)，小鼠抗大鼠CD34FITC(Santa Cruz公司)，46二脒基2苯基吲哚（DAPI）儲(chǔ)存液(Sigma 公司)。
1.3 分離和培養(yǎng)
Wistar大鼠麻醉后處死，浸泡酒精15 min，無菌條件下分離股骨、脛骨，無血清DMEM沖洗骨髓腔，取混懸液，1 000 r/min離心10 min，棄上清液，沉淀含10%胎牛血清的DMEM混懸，將獲得的細(xì)胞接種在100 ml培養(yǎng)瓶中，5% CO2，37℃下培養(yǎng)24～48 h，換液，去除未貼壁細(xì)胞，2～3 d更換一次培養(yǎng)基，光鏡觀察細(xì)胞融合情況，細(xì)胞80%融合后傳代，0.25%胰酶消化，用血球計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)細(xì)胞、傳代，培養(yǎng)3～5代細(xì)胞。
1.4 透射電鏡樣品制備
將培養(yǎng)3代10 cm2培養(yǎng)皿中約2×106個(gè)細(xì)胞以磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3 次，再以3 %戊二醛4℃固定1 h，送電鏡室，脫水包埋并制作超薄切片，行透射電鏡觀察并拍照。
1.5 MSCs表面標(biāo)記物檢測(cè)
0.25%胰酶消化收獲第3代細(xì)胞，收集1×106個(gè)細(xì)胞，洗滌1次，0～4℃預(yù)冷的70%乙醇1 ml邊加入邊搖勻，混勻后置于4℃冰箱待進(jìn)行細(xì)胞表面標(biāo)記物檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)以1 ml PBS洗滌2次，加含10%山羊血清的 PBS常溫孵育10 min，1 000 r/min離心5 min去上清，與飽和濃度的CD29Alexa Fluor、CD34FITC、CD44PE、CD45FITC單克隆抗體及其同型對(duì)照混勻，室溫下閉光反應(yīng)30 min，PBS 洗滌細(xì)胞，置于冰上，行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
1.6 MSCs標(biāo)記
將無菌的DAPI 儲(chǔ)存液加入培養(yǎng)的MSCs爬片上清中，至終濃度為50 mg/L ，37 ℃孵育染色至少30 min。細(xì)胞至少用Hanks 平衡鹽溶液沖洗6 遍以除去未結(jié)合的DAPI。熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞爬片。
2 結(jié) 果
2.1 MSCs相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)
骨髓細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶后，約6～8 h可見MSCs細(xì)胞貼壁，呈圓形或多角形，換液后，貼壁細(xì)胞清晰可見，2～3 d后可見少量短梭形、星形細(xì)胞分散貼壁生長(zhǎng)，伸出偽足呈逗點(diǎn)狀或短棒狀；6 d左右可見放射狀排列的細(xì)胞集落，伸出長(zhǎng)短不一、粗細(xì)不均的突起、胞核大、核仁清晰。約14 d細(xì)胞融合80%～90%，呈漩渦狀。傳代細(xì)胞比原代細(xì)胞貼壁快，24 h內(nèi)已全部貼壁、伸展，增殖迅速，均勻分布生長(zhǎng)，3～4 d可見長(zhǎng)梭形細(xì)胞80%～90%鋪滿培養(yǎng)皿形成單層。見圖1。
2.3 MSCs的鑒定及標(biāo)記
第3代細(xì)胞表面標(biāo)記物CD29、CD44、CD34和CD45的陽性率分別為98.6 %、78.2%、0.0%、0.3%。見圖3。細(xì)胞經(jīng)DAPI標(biāo)記后，細(xì)胞核呈藍(lán)色。見圖4。
3 討 論
由于骨髓的細(xì)胞組成復(fù)雜，細(xì)胞功能各異，其中MSCs含量很低，約為骨髓低密度組分中有核細(xì)胞的0.001%～0.01%〔3〕，故分離高純度的MSCs是原代培養(yǎng)關(guān)鍵性技術(shù)。目前，獲得MSCs的方法主要有貼壁篩選法、密度梯度離心法、流式細(xì)胞儀分離法、免疫磁珠分選法〔4〕。而骨髓貼壁法操作步驟簡(jiǎn)單，既降低了離心對(duì)細(xì)胞的損害，又減少了污染機(jī)會(huì)，且分離的MSCs貼壁時(shí)間短，增殖快，細(xì)胞數(shù)量多，經(jīng)傳代后能夠純化，提示全骨髓貼壁法是一種更加簡(jiǎn)單有效的MSCs分離方法。
一般認(rèn)為，間充質(zhì)干細(xì)胞沒有特異性表面抗原，整合素家族成員CD29、黏附分子CD44、CD166、CD105等是MSCs的重要標(biāo)志物〔5〕，而MSCs不表達(dá)造血細(xì)胞表面抗原，如造血前體細(xì)胞標(biāo)志抗原CD34、成熟造血細(xì)胞標(biāo)志抗原CD38、白細(xì)胞標(biāo)志抗原CD45、淋巴細(xì)胞表面抗原CD11a和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞表面抗原CD14。因此，實(shí)驗(yàn)選取MSCs表達(dá)陽性的指標(biāo)CD29、CD44，以及表達(dá)陰性的指標(biāo)CD34和CD45作為鑒定參考指標(biāo)〔2，6〕。本研究選擇了CD29、CD34、CD44和CD45進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明培養(yǎng)的細(xì)胞CD29和CD44陽性，CD34和CD45陰性，符合MSCs的特點(diǎn)，經(jīng)過傳代，第三代可獲得較高純度的MSCs，可以作為穩(wěn)定的種子細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)研究。
DAPI是一種能夠與DNA強(qiáng)力結(jié)合的熒光染料，常用于熒光顯微鏡觀測(cè)。DAPI對(duì)活細(xì)胞無毒性，不改變細(xì)胞器的超微結(jié)構(gòu)，熒光保持時(shí)間較長(zhǎng)。移植細(xì)胞的標(biāo)記是研究其在體內(nèi)的定位不可缺少的，目前常用的標(biāo)記法有DAPI標(biāo)記法、溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）標(biāo)記法、染色體標(biāo)記法、基因標(biāo)記法。BrdU法存在只能標(biāo)記增殖期細(xì)胞，且標(biāo)記細(xì)胞不能直接觀察等不足。染色體標(biāo)記主要將雄性供體動(dòng)物細(xì)胞移植到雌性動(dòng)物體內(nèi)，通過Y染色體雜交區(qū)別確認(rèn)移植細(xì)胞。其優(yōu)點(diǎn)在于可以終生標(biāo)記，但也存在操作繁瑣，無法觀察活細(xì)胞等不足。基因標(biāo)記法通過基因轉(zhuǎn)染或直接從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物取材，使被標(biāo)記細(xì)胞攜帶綠色熒光蛋白（GFP）暼報(bào)告基因。但目前，實(shí)現(xiàn)報(bào)告基因在目的細(xì)胞中高效穩(wěn)定表達(dá)仍然存在程序繁瑣、實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、成功率低等困難，而從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物取材又因?yàn)閯?dòng)物來源困難，在國(guó)內(nèi)較少開展〔7〕。本研究表明，DAPI起初標(biāo)記率很高(接近100%)，1 w內(nèi)可維持80%～90%標(biāo)記率。但隨著標(biāo)記時(shí)間的延長(zhǎng)，其標(biāo)記效率迅速下降，3 w以后絕大多數(shù)細(xì)胞失去標(biāo)記。
本實(shí)驗(yàn)完善貼壁法建立Wistar大鼠MSCs培養(yǎng)體系，經(jīng)鑒定細(xì)胞純度高，可以為體內(nèi)移植提供大量的種子細(xì)胞。采用DAPI 進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記后，熒光顯微鏡下見所有MSCs 均已被標(biāo)記藍(lán)色熒光，提示DAPI 標(biāo)記法敏感性好，標(biāo)記效率高，可應(yīng)用進(jìn)行體內(nèi)細(xì)胞移植的良好標(biāo)記。
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第2篇：干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)范文
【摘要】 目的研究柴胡皂苷-d（SS-d）對(duì)乙醇損傷大鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞保護(hù)的作用和機(jī)制。方法采用胰蛋白酶消化、分離大鼠肝細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，乙醇體外誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷，以不同濃度的SS-d對(duì)肝細(xì)胞保護(hù)，檢測(cè)培養(yǎng)液中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）活性和肝細(xì)胞內(nèi)丙二醛（MDA）含量、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）的活性，MTT法檢測(cè)肝細(xì)胞存活率。結(jié)果SS-d（1.0，2.0，3.0mg·L－1）明顯改善肝細(xì)胞存活率，抑制乙醇引起的ALT活性的升高，對(duì)肝細(xì)胞中MDA含量升高和GSH-px活性降低均有明顯的抑制作用。結(jié)論SS-d對(duì)乙醇損傷大鼠肝細(xì)胞有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與SS-d清除自由基、抑制質(zhì)脂過氧化作用有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】 乙醇 肝細(xì)胞 原代培養(yǎng) 柴胡皂苷-d 保護(hù)作用 機(jī)制
隨著人們生活水平的提高和飲酒量的增加，酒精對(duì)肝臟的損害日漸突出。了解酒精對(duì)肝損傷的機(jī)制，篩選有效預(yù)防和治療酒精性肝損傷的藥物應(yīng)用于臨床，是亟待解決的重要課題。目前，中藥復(fù)方對(duì)酒精性肝損傷的實(shí)驗(yàn)研究和報(bào)道比較多，單味制劑報(bào)道較少。柴胡皂苷（saikosaponins SS）是中藥柴胡的有效成分，根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)不同可分為柴胡皂苷a、柴胡皂苷b、柴胡皂苷c和柴胡皂苷d等，以柴胡皂苷d(SS-d)藥理活性作用最強(qiáng)。整體水平研究表明柴胡皂苷對(duì)酒精性肝損傷有預(yù)防作用［1］。本文建立體外乙醇損傷肝細(xì)胞模型，在細(xì)胞水平上進(jìn)一步研究柴胡有效成分SS-d對(duì)乙醇損傷肝細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制。
1 器材與方法
1.1 藥品與試劑 SS-d（純度98%），昆明長(zhǎng)春花科技有限公司提供，臨用前以蒸餾水配制；Hanks液高壓滅菌，4℃保存；1.0 g·L－1胰蛋白酶，用Hanks液溶解，過濾除菌，調(diào)pH 7.2，分裝，-30℃保存；基礎(chǔ)培養(yǎng)液，RPMI1640培養(yǎng)基10.0 g，用超凈水900 ml溶解，5.6%NaHCO3調(diào)pH至7.2，定溶到1 000 ml，過濾除菌，臨用前每80 ml，加入新生小牛血清20 ml，青霉素100 U·ml－1，鏈霉素100 μg·ml－1，胰島素5 μg·ml－1；MTT：SIGMA公司；ALT，MDA，GSH-px測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所。
1.2 動(dòng)物 SD大鼠，2～4 d齡乳鼠，雌雄不限，清潔級(jí)，承德醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心提供。
1.3 儀器 CO2培養(yǎng)箱（Taibai LNA-122D 日本），MD-100半自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)Bayer公司），721W微機(jī)型分光光度計(jì)（上海光學(xué)儀器五廠），離心機(jī)（TGL.16G 上海）。
1.4 肝細(xì)胞分離培養(yǎng)［2］取新生2～4 d大鼠30只，75%乙醇浸洗后斷頭放血，無菌分離肝臟，去除肝臟外膜及其周圍結(jié)締組織，置Hanks液中，灌注沖洗肝臟至灰白色，將肝臟剪成1 mm×1 mm×1 mm左右的組織塊，用Hanks沖洗數(shù)次，除去血細(xì)胞，加入0.8g·L－1胰蛋白酶10 ml，37℃孵育12 min，加入數(shù)滴血清終止消化，用滴管輕吹打成細(xì)胞懸液，經(jīng)200尼龍篩網(wǎng)過濾后用培養(yǎng)液洗2次，1 000 r離心5 min，收集肝細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)活細(xì)胞計(jì)數(shù)>85%，按1 ×109個(gè)·L-1接種于鋪有鼠尾膠原的24孔和96孔板中，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)液去除血細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。
1.5 乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷模型的建立將含肝細(xì)胞培養(yǎng)液的96孔板，設(shè)正常對(duì)照組及乙醇25，50，75，100 mmol ·L－14個(gè)劑量組，肝細(xì)胞懸液與不同濃度乙醇繼續(xù)培養(yǎng)12 h，取培養(yǎng)液按賴氏法測(cè)定ALT活性，MTT法測(cè)定肝細(xì)胞存活率。
1．6 MTT法選擇SS-d的實(shí)驗(yàn)濃度 SS-d初濃度為5 mg/L，采用細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋，依次為5.0 ，4.0，3.0 ，2.0 ，1.0 ，0.5 mg·L－1。將肝細(xì)胞接種于96孔板培養(yǎng)72 h更換培養(yǎng)液，換用SS-d稀釋液培養(yǎng)，另設(shè)空白對(duì)照組，12 h后吸出培養(yǎng)液，各孔加入0.05%MTT200 μL，37℃孵育4 h，去上清液，各孔加入二甲基亞砜200 μl，混勻以溶解被還原的MTT結(jié)晶，檢測(cè)波長(zhǎng)為492 nm的光密度值，計(jì)算藥物不同稀釋濃度下細(xì)胞的存活率。
1.7 SS-d對(duì)乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用取培養(yǎng)72 h肝細(xì)胞，設(shè)乙醇損傷模型組、SS-d(1 .0，2 .0，3.0mg·L－1)3個(gè)劑量保護(hù)組、正常對(duì)照組，每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔。模型組和SS-d組加入乙醇100 mmol·L－1，同時(shí)SS-d組加入不同濃度的SS-d，正常對(duì)照組加不含血清的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，收集培養(yǎng)上清液檢測(cè)ALT活性，收集肝細(xì)胞檢測(cè)MDA含量和GSH-px的活性，MTT法測(cè)定肝細(xì)胞的存活率。
1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)以 表示，用SPSS計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析， 組間比較采用t檢驗(yàn)，P
2 結(jié)果
2.1 乙醇對(duì)原代培養(yǎng)肝細(xì)胞的損傷不同濃度的乙醇作用于肝細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞有劑量依賴性的損傷作用，25 mmol·L－1作用不明顯，光鏡下細(xì)胞形態(tài)基本正常，隨著濃度的增大，肝細(xì)胞存活率呈進(jìn)行性降低，反映肝細(xì)胞損傷的酶ALT逐漸升高；鏡下觀察肝細(xì)胞損傷明顯，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清，核融解和核膜破裂，其中100 mmol ·L－1乙醇作用最明顯，我們選擇乙醇濃度為100 mmol ·L－1制備肝細(xì)胞損傷模型。見表1。表1 不同濃度乙醇對(duì)肝細(xì)胞ALT水平及細(xì)胞存活率的影響 與空白對(duì)照組比較#P＜0.05，##P＜0.01；n=6
2.2 SS-d 實(shí)驗(yàn)濃度的選擇SS-d不同濃度時(shí)細(xì)胞存活率見表2，為避免藥物濃度過大所致的細(xì)胞毒性作用，應(yīng)選擇對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無明顯影響即肝細(xì)胞存活率在90%以上的濃度(1.0 ，2.0 ，3.0 mg·L-1)作為實(shí)驗(yàn)所用藥物濃度。見表2。表2 不同濃度SS-d對(duì)肝細(xì)胞存活率的影響與空白對(duì)照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；n=6
2.3 SS-d對(duì)乙醇損傷肝細(xì)胞的保護(hù)作用 100 mmol·L－1乙醇作用肝細(xì)胞后，肝細(xì)胞損傷明顯，大量細(xì)胞壞死，細(xì)胞內(nèi)ALT釋放量明顯升高，細(xì)胞內(nèi)MDA含量明顯增高，GSH-px活性明顯下降；而給予SS-d保護(hù)后， 培養(yǎng)液中ALT水平明顯降低；肝細(xì)胞MDA含量明顯降低，GSH-px活性明顯升高；并且肝細(xì)胞存活率明顯升高。具有明顯的劑量依賴性(P＜0.05，P＜0.01)。表明：SS-d能夠保護(hù)肝細(xì)胞、穩(wěn)定肝細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，其保護(hù)作用可能與抗脂質(zhì)過氧化作用有關(guān)。見表3。表3 SS-d對(duì)乙醇損傷肝細(xì)胞ALT，MDA，GSH-px水平與對(duì)照組比較，*P＜0.01，與模型組比較#P＜0.05，##P＜0.01；n=6
3 討論
大量研究表明，乙醇對(duì)肝細(xì)胞損傷是通過自由基介導(dǎo)脂質(zhì)過氧化作用進(jìn)行的［3～5］。乙醇在肝臟代謝時(shí)產(chǎn)生大量自由基，自由基除直接損傷肝細(xì)胞外，可引起肝細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，使細(xì)胞膜和細(xì)胞器結(jié)構(gòu)破壞，膜流動(dòng)性失常，大量肝內(nèi)酶（ALT，AST）釋放入血，并可抑制抗氧化劑谷胱甘肽的合成，減弱抗氧化酶（GSH-px）的抗氧化能力，使肝細(xì)胞代謝紊亂，肝功能異常，肝細(xì)胞廣泛脂肪樣和空泡樣變性，最終導(dǎo)致細(xì)胞腫脹死亡［6］。因此，清除自由基抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，才能保護(hù)肝細(xì)胞，恢復(fù)肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性。
SS是柴胡的主要成分，研究表明，SS對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝損傷具有明顯的保護(hù)作用［7，8］。但對(duì)單體SS－d保肝作用研究報(bào)道較少。因此，我們利用乙醇制備體外肝細(xì)胞損傷模型，在細(xì)胞水平上對(duì)SS-d保肝作用機(jī)制進(jìn)行探討。本研究顯示，模型組肝細(xì)胞培養(yǎng)液中ALT活性明顯升高，肝細(xì)胞脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)物MDA含量增加，GSH-px活性降低，細(xì)胞存活率明顯下降，表明乙醇可引起肝細(xì)胞氧化損傷；給予SS－d保護(hù)后，和模型組比較，肝細(xì)胞培養(yǎng)液中ALT活性明顯較低，MDA含量明顯降低，GSH-px活性明顯升高，肝細(xì)胞存活率亦有明顯升高。提示，SS-d對(duì)乙醇損傷肝細(xì)胞有明顯保護(hù)作用，其機(jī)制可能是：①SS-d能增強(qiáng)機(jī)體內(nèi)抗氧化防御能力，抑制自由基的產(chǎn)生；②穩(wěn)定肝細(xì)胞膜系統(tǒng)，提高膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，促進(jìn)肝細(xì)胞增殖，防止肝細(xì)胞損傷和壞死。
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第3篇：干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)范文
近日，英國(guó)倫敦帝國(guó)學(xué)院（Imperial College London）的科學(xué)家成功地利用人類胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)出了軟骨細(xì)胞，這為在將來某一天進(jìn)行軟骨移植提供了很好的契機(jī)。
研究結(jié)果發(fā)表在《組織工程》雜志中，文章詳細(xì)闡述了帝國(guó)學(xué)院研究小組將胚胎干細(xì)胞變成軟骨細(xì)胞的過程。這樣，醫(yī)生將可培養(yǎng)軟骨細(xì)胞并將其移植到許多受損或患病的組織中，即使因運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的損傷也可用新的軟骨取而代之，甚至是進(jìn)行整容手術(shù)。
軟骨（Cartilage）是骨間非常密集的結(jié)締組織，允許關(guān)節(jié)之間進(jìn)行平滑的移動(dòng)。
文章的第一作者Archana Vats博士說：“利用干細(xì)胞培養(yǎng)軟骨的技術(shù)在臨床研究中具有巨大的應(yīng)用價(jià)值。目前英國(guó)的老齡化問題越來越嚴(yán)重，長(zhǎng)壽不可避免地成為備受關(guān)注的話題。在此之前，醫(yī)生也能進(jìn)行關(guān)節(jié)移植，卻不能移植軟骨。而更換軟骨后就可以避免再對(duì)關(guān)節(jié)進(jìn)行移植。”
研究人員在特定系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室的有蓋培養(yǎng)皿中培養(yǎng)人類胚胎干細(xì)胞，進(jìn)而促使其變成軟骨細(xì)胞。與生長(zhǎng)中的胚胎干細(xì)胞相比，在干細(xì)胞與軟骨的混合物中存在較高含量的膠原質(zhì)和軟骨蛋白。
科研人員將這些胚胎干細(xì)胞移植到老鼠體內(nèi)的特定生物活性部位，之后進(jìn)行了35的觀察。當(dāng)干細(xì)胞脫離活性部位后，研究人員發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞形成了新的軟骨，研究結(jié)果顯示這些軟骨還可以被成功移植到活體組織中去。
第4篇：干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)范文
【關(guān)鍵詞】 膠質(zhì)瘤；細(xì)胞培養(yǎng)；應(yīng)用
據(jù)統(tǒng)計(jì)大約9%的人類腫瘤是腦腫瘤，而腦腫瘤中90%是膠質(zhì)瘤［1］。腦膠質(zhì)瘤是來源于神經(jīng)上皮的腫瘤。在成人致命原發(fā)腦腫瘤中，高級(jí)別惡性膠質(zhì)瘤最常見，確診后中位生存期為9~12個(gè)月［2］，而且這些患者是經(jīng)過積極治療的，包括外科切除、放療、化療等。這些治療的失敗部分歸咎于膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲性生長(zhǎng)以及與周圍正常腦組織交錯(cuò)，因而外科手術(shù)難以完全切除［3］；同時(shí)由于其異常的生物學(xué)特性，對(duì)放、化療的抗拒，導(dǎo)致術(shù)后放、化療失??；而且經(jīng)常以同級(jí)別或高級(jí)別復(fù)發(fā)［4］。因此需要開辟新的治療方法如生物治療以及開發(fā)新的治療藥物，這些新的治療方法及新藥研制都需要以實(shí)驗(yàn)為依據(jù)。目前關(guān)于膠質(zhì)瘤的常用研究方法有臨床實(shí)驗(yàn)和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)。其中常用的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)是基礎(chǔ)，是利用培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，從細(xì)胞水平、分子水平揭示膠質(zhì)瘤的細(xì)胞特性。它具有許多優(yōu)點(diǎn)：可以長(zhǎng)時(shí)間直接觀察細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生命活動(dòng)［5］；研究的條件可以人為控制；研究的樣本比較均一；研究的內(nèi)容便于觀察、檢測(cè)和記錄；可以用于許多領(lǐng)域的研究；相對(duì)而言比較經(jīng)濟(jì)。
1 膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)的歷史
1925年，F(xiàn)ish培養(yǎng)人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞獲得成功，開創(chuàng)了體外研究膠質(zhì)瘤的先河。Manuelidis 于1959年建立的世界上第1個(gè)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株TC178，使體外長(zhǎng)期連續(xù)動(dòng)態(tài)觀察膠質(zhì)瘤細(xì)胞成為可能。 20世紀(jì)70年代以來，隨著基礎(chǔ)培養(yǎng)技術(shù)的迅猛發(fā)展，膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體外培養(yǎng)和克隆技術(shù)日趨成熟。近年來更是探索出許多新的培養(yǎng)方法，并應(yīng)用于各項(xiàng)研究。
目前膠質(zhì)瘤的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)比較成熟，已經(jīng)建立了許多膠質(zhì)瘤品系，如國(guó)內(nèi)的人腦惡性膠質(zhì)瘤體外細(xì)胞系SHG-44，是1980年取材于額葉星形細(xì)胞瘤的組織塊經(jīng)胰酶消化，單層靜止培養(yǎng)而成的；細(xì)胞形態(tài)有星形、梭形；流式細(xì)胞光度儀測(cè)定，此細(xì)胞以四倍體為主，G1期占54.57%、S期占15.17%、G2/M期占30.25%；免疫組化提示本細(xì)胞中存在S-100和GFAP；存于蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室。已經(jīng)明確的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系（株）有許多，有人型、鼠型等，如U251、U87、U118、T98、TJ899、TJ905、D54、NT325、CHG5、BT325、9L、C6等，而且今后還會(huì)不斷建立新的品系。
2 目前常用培養(yǎng)方法及應(yīng)用
現(xiàn)有的膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)形式主要有：?jiǎn)螌蛹?xì)胞培養(yǎng)、三維/立體培養(yǎng)及聯(lián)合培養(yǎng)等。
2.1 單層細(xì)胞培養(yǎng)及應(yīng)用 傳統(tǒng)意義上的單層細(xì)胞培養(yǎng)可以分為原代培養(yǎng)以及傳代培養(yǎng)兩類。前者是從供體獲得組織后的初次培養(yǎng)，后者一般為利用現(xiàn)有的細(xì)胞系（株）。
兩種培養(yǎng)方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，而且都已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用。目前國(guó)內(nèi)研究膠質(zhì)瘤的實(shí)驗(yàn)多采用細(xì)胞系，這主要是因?yàn)閲?guó)內(nèi)已經(jīng)有許多膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，品系明確、易于培養(yǎng)；但連續(xù)性細(xì)胞系由于連續(xù)傳代，細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能發(fā)生了一定的變化，傳代代數(shù)越多，發(fā)生的變化也越大，因而對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定的影響。原代培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù)相對(duì)要復(fù)雜得多，而且培養(yǎng)成功率較低，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，因此不為許多研究者選用；但原代細(xì)胞剛離體，在形狀、結(jié)構(gòu)、功能等方面與體內(nèi)細(xì)胞更接近，相對(duì)能更好地代表其來源組織的細(xì)胞類型及組織特異性，更好地保留膠質(zhì)瘤的生物學(xué)特性，更接近也更能反映體內(nèi)生長(zhǎng)特性，所以原代培養(yǎng)出的細(xì)胞更適合做藥物敏感實(shí)驗(yàn)、放射敏感實(shí)驗(yàn)等基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究。
原代單層細(xì)胞培養(yǎng)常用的方法有：組織塊原代培養(yǎng)以及單細(xì)胞懸液法培養(yǎng)。前者是將膠質(zhì)瘤組織塊貼附在培養(yǎng)瓶（板）上，一般1~2天就會(huì)有細(xì)胞從組織塊邊緣游出，利用游出的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)；后者是將組織塊通過機(jī)械分離或酶消化法或者二者結(jié)合的方法分離成單細(xì)胞懸液，再接種于培養(yǎng)瓶（板）進(jìn)行培養(yǎng)的方法［6，7 ］。
傳代單層細(xì)胞培養(yǎng)的方法相對(duì)簡(jiǎn)單一些，只需將需要傳代的細(xì)胞用胰蛋白酶消化吹打后，按需要接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，補(bǔ)足培養(yǎng)液即可。
以上為傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)方法，在此基礎(chǔ)上又發(fā)展出一些培養(yǎng)方法，如：?jiǎn)渭?xì)胞分離培養(yǎng)法、加支持物培養(yǎng)法、球體細(xì)胞培養(yǎng)法、懸浮培養(yǎng)法等。單細(xì)胞分離培養(yǎng)也就是克隆培養(yǎng)，國(guó)內(nèi)孫立軍、黃強(qiáng)等［8］已經(jīng)通過對(duì)SHG-44細(xì)胞系單克隆化，建立了具有低、中、高3種不同分化程度的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株。加支持物培養(yǎng)法是為了實(shí)驗(yàn)研究或便于觀察而預(yù)先向培養(yǎng)瓶/板內(nèi)加入支持物；如為了做細(xì)胞免疫組化，預(yù)先在培養(yǎng)板內(nèi)放入小玻片，再培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)在玻片上，取出固定、染色，也稱為爬片。球體細(xì)胞培養(yǎng)是將長(zhǎng)成片的細(xì)胞移入不易貼附的底物上，則細(xì)胞片能卷聚生長(zhǎng)成球形。懸浮培養(yǎng)法，顧名思義就是讓原本貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)。李茗初等［9］運(yùn)用無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，從中分離出該細(xì)胞系的干細(xì)胞。
單層細(xì)胞培養(yǎng)是目前最常用的一種培養(yǎng)方式，已廣泛應(yīng)用于各項(xiàng)基礎(chǔ)研究。
2.1.1 在放射治療研究中的應(yīng)用 目前膠質(zhì)瘤細(xì)胞系眾多，不同細(xì)胞系有各自不同的特點(diǎn)，如MO54對(duì)輻射敏感，而T98則對(duì)輻射抵抗［10］；U373、U251、U118MGT-98G表達(dá)突變型p53，而U87、D54、A172、CCF-STTG1細(xì)胞表達(dá)野生型p53。針對(duì)不同細(xì)胞系的特點(diǎn)，在實(shí)驗(yàn)研究時(shí)可以根據(jù)需要而加以選擇。Ostruszka等［11］在研究細(xì)胞周期進(jìn)程中由2，2-二氟脫氧胞嘧啶核苷(2′， 2′-difluoro-2′-deoxycytidine; dFdCyd)引起的放射敏感性的作用中運(yùn)用了2種人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251和D54，并且發(fā)現(xiàn)U251對(duì)dFdCyd的細(xì)胞毒性更敏感，dFdCyd也是U251的放射增敏劑，這種差異在于U251表達(dá)突變型p53，而D54細(xì)胞表達(dá)野生型p53，在D54細(xì)胞聯(lián)合dFdCyd和電離輻射后，突出表現(xiàn)在G1期阻滯。Chen等［12］在研究DB-67作為一種新型DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶具有靶向輻射增敏劑的研究中也運(yùn)用了表達(dá)野生型p53和突變型p53的D54-MG和T-98G膠質(zhì)瘤細(xì)胞系。Shono等［13］采用將腺病毒載體-p53(Ad-p53)導(dǎo)入表達(dá)突變型p53的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251、U373和表達(dá)野生型p53的U87、D54細(xì)胞系，Ad-p53能通過增加表達(dá)野生型p53膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡趨勢(shì)來提高它們的放射敏感性，并進(jìn)一步揭示Ad-p53轉(zhuǎn)染的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞所誘導(dǎo)的凋亡和磷酸化區(qū)域特異性的位點(diǎn)相關(guān)。
2.1.2 在化療藥物研究中的應(yīng)用 膠質(zhì)瘤化療效果差，這主要與缺乏有效的化療藥、全身化療時(shí)化療藥難以通過血腦屏障以及腫瘤耐藥有關(guān)。因此膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)廣泛應(yīng)用于新藥開發(fā)。
Das等［14］用U87-MG研究地塞米松能夠通過維持Bax:Bcl比率來保護(hù)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87-MG免于遭受替莫唑胺誘導(dǎo)的凋亡，提示膠質(zhì)瘤患者接受替莫唑胺化療之前如果用地塞米松將會(huì)產(chǎn)生非預(yù)期效果，為指導(dǎo)臨床治療打下基礎(chǔ)。Landen等［15］在研究那可丁通過血腦屏障及抑制膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)時(shí)利用鼠C6細(xì)胞系，證明那可丁可以抑制C6細(xì)胞增殖，并測(cè)定那可丁通過一層培養(yǎng)的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞比率，并且與已知的滲透劑和非滲透劑相比較，來作為體外測(cè)定那可丁通過血腦屏障的方法。
2.1.3 在生物和基因治療研究中的應(yīng)用 生物治療主要是通過調(diào)動(dòng)宿主天然防衛(wèi)機(jī)制或給予機(jī)體某些物質(zhì)來取得抗腫瘤效應(yīng)。對(duì)抗腫瘤防御機(jī)制的基礎(chǔ)理論的深入了解以及生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑（BRMs）的不斷發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用使得生物治療前景廣闊。BRMs大致有以下幾類：天然或基因重組細(xì)胞因子、抗腫瘤的各類體細(xì)胞和輔的造血干細(xì)胞、抗體、基因治療、腫瘤疫苗、抗血管生成藥、細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑、某些菌類及其有效成分、植物藥包括中藥的有效成分、有機(jī)酸及小分子合成劑、其他類型。
隨著生物治療研究的不斷升溫，膠質(zhì)瘤的細(xì)胞培養(yǎng)已廣泛應(yīng)用于膠質(zhì)瘤生物治療的許多方面，如：Friese等［16］利用人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系和鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞系GL261 和SMA-560研究NKG2D，腫瘤細(xì)胞表達(dá)的配體激活免疫受體NKG2D 刺激由NK、γδT和CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤免疫。人膠質(zhì)瘤細(xì)胞表達(dá)NKG2D的配體MICA、MICB和一些UL16-結(jié)合蛋白家族，然而膠質(zhì)瘤細(xì)胞因?yàn)楦弑磉_(dá)Ⅰ型MHC抗原而抵抗NK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，體外實(shí)驗(yàn)中質(zhì)粒介導(dǎo)或腺病毒介導(dǎo)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞過表達(dá)的MICA可提高它們對(duì)NK和T細(xì)胞的應(yīng)答。
腫瘤疫苗也是當(dāng)今研究熱點(diǎn)之一，制備以及測(cè)試抗膠質(zhì)瘤疫苗都需要膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)。如利用膠質(zhì)瘤細(xì)胞致敏樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）制備膠質(zhì)瘤疫苗。Driessens等［17］發(fā)現(xiàn)被γ射線或化療藥（順鉑和絲裂霉素）作用后凋亡的膠質(zhì)瘤9L細(xì)胞聯(lián)合鼠來源的成熟DCs分泌GM-CSF顯示較好的治療腫瘤潛能。Giezeman-Smits等［18］發(fā)現(xiàn)用白介素-4(IL-4)轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤9L細(xì)胞制備的腫瘤疫苗能夠誘導(dǎo)親代腫瘤發(fā)生特異的、有保護(hù)性的免疫應(yīng)答。
針對(duì)膠質(zhì)瘤基因治療的研究也越來越多，如單純皰疹病毒胸腺激酶(HSV-TK)基因/丙氧鳥苷(GCV)系統(tǒng)、大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶(Ec-CD)基因/5 氟胞嘧啶(5-FC)系統(tǒng)；早期生長(zhǎng)反應(yīng)基因-1啟動(dòng)子（pEgr-1）；CEA-啟動(dòng)子等［19~ 22］。
2.1.4 在動(dòng)物模型研究中的應(yīng)用 培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞還可以用于建立動(dòng)物模型，為研究膠質(zhì)瘤發(fā)病機(jī)理以及治療提供良好的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。如利用鼠類細(xì)胞系立體定向注射于大鼠顱內(nèi)建立鼠膠質(zhì)瘤模型等。Prins等［23］通過向C57BL/6 (H-2b)雌鼠的腹側(cè)皮下注射GL26膠質(zhì)瘤細(xì)胞以及將GL26膠質(zhì)瘤細(xì)胞立體定向注射于大鼠顱內(nèi)建立鼠膠質(zhì)瘤模型，用于研究黑色素瘤相關(guān)抗原（MMAs）的靶向免疫治療。
2.1.5 在其他方面研究中的應(yīng)用 膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)除用于上述研究外，還廣泛應(yīng)用于其他研究方面，如探討膠質(zhì)瘤細(xì)胞與正常星型細(xì)胞之間的作用機(jī)制；膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制以及侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制等。Zhang等［6］在研究惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞和星型細(xì)胞之間的直接縫隙連接的交流中采用了原代培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞和原代培養(yǎng)的星型細(xì)胞。Joy等［3］利用SF767 和T98G膠質(zhì)瘤細(xì)胞系研究發(fā)現(xiàn)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞激活P13-K途徑并且表現(xiàn)降低凋亡的敏感性。Yamamoto等［24］利用SNB-19、D-54MGU、87 MG、U-373 MG、U-118 MG和SW1088研究N-glycan在調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤遷移和侵襲中的作用。
2.2 三維（立體）培養(yǎng)及應(yīng)用 單層細(xì)胞培養(yǎng)雖然已經(jīng)得以廣泛應(yīng)用，但也有其不足之處：第一，具有遺傳不穩(wěn)定性；第二，是一個(gè)平面結(jié)構(gòu)，而人體是三維立體結(jié)構(gòu)，與人體環(huán)境相差很遠(yuǎn)。針對(duì)這些不足，許多科研工作者也嘗試用立體培養(yǎng)，因?yàn)榄h(huán)境對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)分化有著至關(guān)重要的作用。已有科研證明異位植入的胚胎細(xì)胞能轉(zhuǎn)化為惡性細(xì)胞，并引發(fā)癌癥，而相同的細(xì)胞在子宮內(nèi)則可形成正常的胚胎；相反畸胎瘤細(xì)胞植入胚胎內(nèi)可能經(jīng)歷正常的發(fā)育過程。
與傳統(tǒng)的培養(yǎng)方式相比，三維立體培養(yǎng)的細(xì)胞在細(xì)胞形狀和細(xì)胞環(huán)境更接近于活體內(nèi)狀態(tài)，而形狀和環(huán)境能決定細(xì)胞的基因表達(dá)和生物學(xué)行為。三維細(xì)胞培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)還在于具有清晰的幾何學(xué)形狀，這使其結(jié)構(gòu)與功能直接相關(guān)，從而可以進(jìn)行理論分析［25］。Joki等［26］在研究環(huán)氧化酶-2的實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用了三維培養(yǎng)系統(tǒng)，證明環(huán)氧化酶-2抑制劑NS-398對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移有抑制作用。
但是三維立體培養(yǎng)也不能完全模擬體內(nèi)環(huán)境，而且立體培養(yǎng)的模型在目前條件下難以無限生長(zhǎng)下去，主要是因?yàn)槟Ｐ烷L(zhǎng)到一定大小時(shí)，由于模型中心缺乏營(yíng)養(yǎng)或缺氧而壞死。因此如何解決這些問題，還需要進(jìn)一步努力。
2.3 其他培養(yǎng)方法及應(yīng)用 目前培養(yǎng)和應(yīng)用膠質(zhì)瘤細(xì)胞除了單獨(dú)應(yīng)用上述培養(yǎng)方法以外，還有共培養(yǎng)（coculture）方法，即將2種或2種以上的細(xì)胞一起培養(yǎng)的方法，其實(shí)質(zhì)也是單層細(xì)胞培養(yǎng)；也有嘗試2種或幾種方法聯(lián)合應(yīng)用，如同時(shí)選用單層細(xì)胞培養(yǎng)及三維立體培養(yǎng)。
Zhang等［6］將原代培養(yǎng)的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞和原代培養(yǎng)的鼠星型細(xì)胞共培養(yǎng)，并認(rèn)為2種細(xì)胞之間的縫隙連接的形成不是自然的，因?yàn)閷⒛z質(zhì)瘤細(xì)胞注射入活鼠腦內(nèi)很快就能和宿主細(xì)胞功能性耦聯(lián)在一起，而且和膠質(zhì)瘤細(xì)胞耦聯(lián)在一起的縫隙連接似乎可以調(diào)節(jié)星型細(xì)胞的表型。和膠質(zhì)瘤細(xì)胞共培養(yǎng)的星型細(xì)胞表達(dá)Cx43顯著降低并可以低水平表達(dá)GFAP。
Joki等［26］在研究環(huán)氧化酶-2的實(shí)驗(yàn)中除了運(yùn)用三維培養(yǎng)系統(tǒng)外，還運(yùn)用了單層細(xì)胞培養(yǎng)檢測(cè)NS-398抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖以及運(yùn)用共培養(yǎng)系統(tǒng)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞侵襲入正常鼠腦細(xì)胞。
3 展 望
提到膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)就不得不關(guān)注膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的研究。目前除膠質(zhì)瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)以及膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的培養(yǎng)外，還有人通過原代無血清培養(yǎng)、神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)以及CD133免疫磁珠分離等方法成功地分離、培養(yǎng)出膠質(zhì)瘤干細(xì)胞。膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及研究是目前膠質(zhì)瘤研究的熱點(diǎn)，該研究將為膠質(zhì)瘤的診斷與治療帶來新的突破與希望。
膠質(zhì)瘤血管發(fā)生、形成、血管結(jié)構(gòu)改變以及與周圍組織的關(guān)系也是當(dāng)今研究熱點(diǎn)，而這方面研究也需要細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。通過該研究有利于闡明膠質(zhì)瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移與其血管生成、結(jié)構(gòu)之間的相關(guān)性，以及化療藥物透過血腦屏障的藥代機(jī)制等。所以膠質(zhì)瘤的細(xì)胞培養(yǎng)是一項(xiàng)非常重要的基礎(chǔ)技術(shù)，相信新的培養(yǎng)技術(shù)會(huì)不斷產(chǎn)生，新的應(yīng)用領(lǐng)域會(huì)不斷發(fā)現(xiàn)。
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第5篇：干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)范文
【關(guān)鍵詞】 川芎； 胚胎干細(xì)胞； 細(xì)胞分化； 心肌細(xì)胞
【Abstract】 Objective：To explore the features of differentiation of mouse embryonic stem cells into cardiomyocytes induced by Chuanxiong containing serum，establish a simple and efficient system of ES cells differentiation cardiomyocyte.Method：The action of ES cell activity under Chuanxiong containing serum were observed，visible spontaneous and rhythmic beating embryoid bodies occurred at 3 d，reached peak at 5 d.Myocardial cell specific genes β-MHC were detected by using RT-PCR method.Result：Compared with the rat serum and fetal bovine serum group，theβ-MHC of the cells cultured by Chuanxiong containing serum expression and differentiation rate increased significantly，the differences were statistically significant（P
【Key words】 Chuanxiong； Embryonic stem cells； Cell differentiation； Cardiomyocyte
First-author’s address：Longgang Central Hospital of Shenzhen City，Shenzhen 518116，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.30.005
心肌細(xì)胞移植在臨床中已經(jīng)廣泛使用，移植細(xì)胞包括多種，其中最適合于移植的細(xì)胞為胚胎干細(xì)胞，主要是由于其具有較強(qiáng)的分化能力和增殖能力。胚胎干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞是研究心肌細(xì)胞分化機(jī)制的良好平臺(tái)和模型[1-2]。隨著現(xiàn)代藥學(xué)的發(fā)展，人們更加重視中藥的應(yīng)用，中藥歷史悠久，很多中藥均具有較好的活性，可用于疾病的治療，其中保護(hù)心肌功能的中藥應(yīng)用也較為廣泛，具有保護(hù)心肌、改善機(jī)體免疫功能、促進(jìn)蛋白增長(zhǎng)及防治細(xì)胞凋亡等特點(diǎn)[3-4]。與傳統(tǒng)的化學(xué)藥品相比，中藥具有安全有效、價(jià)格便宜等特點(diǎn)[5-6]。本實(shí)驗(yàn)利用胚胎干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停瑢?duì)川芎含藥血清誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，現(xiàn)報(bào)道如下。
1 材料與方法
1.1 中藥川芎含藥血清的制備 選取健康未過的SD雄鼠30只[許可證編號(hào)：syxk（粵）2013-0085，廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心]，個(gè)體質(zhì)量（200±10）g，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將其隨機(jī)分為空白對(duì)照組、低劑量組及高劑量組，每組10只。給予大白鼠川芎水煎液灌胃（取一定量川芎飲片置容器中，加水沒過藥面，浸泡30 min后，煎煮3次，60 min/次，合并水煎液，過濾，濃縮至含生藥1 g/mL備用），低劑量組的劑量約為正常用量（0.8 g/kg）的5倍，為4 g/kg，2次/d，連續(xù)3 d；而高劑量組則為正常用量的30倍，為24 g/kg，
2 次/d，連續(xù)3 d，空白對(duì)照組灌生理鹽水（4 mL/kg）。人與大鼠動(dòng)物等效劑量系數(shù)由《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)》可知為6.3。每次給藥10 min后，對(duì)其進(jìn)行取血，將血液靜置2 h后離心（離心條件：3000 r/min，離心10 min），離心后取上清液56 ℃加熱30 min，過濾，保存于-20 ℃。體外含藥血清按20%計(jì)算[7-10]。
1.2 胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)
1.2.1 來源與試劑 小鼠胚胎干細(xì)胞選自中科院生化細(xì)胞研究所[11-12]；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、明膠、β-巰基乙醇（β-ME）、絲裂霉素C、非必需氨基酸（NEAA）購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司，白血病抑制因子（LIF）購(gòu)自法國(guó)Millipore公司。
1.2.2 胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化 將凍存在液氮罐中的胚胎干細(xì)胞取出，于37 ℃水浴鍋中迅速融化，將細(xì)胞立即轉(zhuǎn)移至10 mL的ep管中，加入適量的培養(yǎng)基，采用300 rcf，10 min離心，去除上清液，加入1 mL培養(yǎng)基吹打，轉(zhuǎn)移細(xì)胞并進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至70%左右時(shí)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代。培養(yǎng)液分四組，即：川芎血清低劑量組、川芎血清高劑量組、大鼠血清組、胎牛血清組，將收集到的川芎含藥血清和大鼠血清、胎牛血清，配制成10 mL備用，各組培養(yǎng)液終濃度為20%。（1）懸滴培養(yǎng)：ES細(xì)胞中加入20%川芎含藥血清（低劑量組和高劑量組）的分化培養(yǎng)液，將細(xì)胞密度設(shè)置為3.75×104/mL。細(xì)胞培養(yǎng)在6 cm培養(yǎng)皿中，取1.6 mL細(xì)胞置于10 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)蓋上，將內(nèi)蓋翻轉(zhuǎn)使其生長(zhǎng)，加入5 mL PBS，孵育1 h。（2）懸浮培養(yǎng)：細(xì)胞孵育后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行觀察，控制細(xì)胞懸滴液中細(xì)胞個(gè)數(shù)為1，第2天于倒置顯微鏡下觀察，每個(gè)懸滴內(nèi)均含有1個(gè)，吸去PBS，加入分化培養(yǎng)基，移至6 cm中培養(yǎng)，孵育2 h。（3）貼壁培養(yǎng)：細(xì)胞培養(yǎng)2 d后，觀察細(xì)胞個(gè)數(shù)，大約為10個(gè)，接種至4孔板，第3天時(shí)肉眼觀察每個(gè)培養(yǎng)皿中均可見數(shù)十個(gè)EBs。分別接種至事先用明膠包被的24孔板內(nèi)，每孔中加入2 mL分化培養(yǎng)液。
1.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)心肌細(xì)胞特異基因β-MHC的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分四組，即川芎血清低劑量組，川芎血清高劑量組，大鼠血清組和胎牛血清組，每組6孔。提取總RNA并測(cè)定濃度，分析其完整性，進(jìn)而合成cDNA，β-MHC Forward：5’-AGAGCTCATCCTTTCTGGTCAT-3’，Reverse：5’-ACCATCTGACATTCTACAGTCT-3’；GAPDH Forward：5’-ATGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3’Reverse：5’-ATGCCTGCTTCACCACCTTCT-3’[4-5]。PCR體系為：12.5 μL SYBR Green Realtime PCR MasterMix，2.5 μL樣品溶液，1.0 μL引物加水至25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃下加熱60 s，進(jìn)行預(yù)變性；95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，如此循環(huán)40次。擴(kuò)增后的產(chǎn)物主要是采用熒光檢測(cè)，用ABI 7500 Software v2.0軟件對(duì)其進(jìn)行分析，繪制曲線表，計(jì)算Ct值，對(duì)系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理后可以得出不同濃度對(duì)于細(xì)胞分化的影響。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 22.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗(yàn)，以P
2 結(jié)果
2.1 川芎誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化 細(xì)胞培養(yǎng)2 d后呈密集狀態(tài)，一般為圓形，細(xì)胞界限和形態(tài)不明顯（圖1）；體外細(xì)胞個(gè)頭小，但生長(zhǎng)速度快（圖1～2）。川芎分化液培養(yǎng)3 d的胚胎干細(xì)胞會(huì)收縮配體，導(dǎo)致培養(yǎng)時(shí)間增加，收縮越明顯，則時(shí)間越長(zhǎng)。自發(fā)節(jié)律性收縮區(qū)域較大，且細(xì)胞形態(tài)較單一（圖3～4）。于細(xì)胞培養(yǎng)的第3 d可見零星EB球發(fā)生自發(fā)性節(jié)律性跳動(dòng)，5 d時(shí)約有70%的EB球出現(xiàn)節(jié)律性跳動(dòng)，低、高劑量川芎血清組（圖3～4）EB球發(fā)生自發(fā)性節(jié)律性跳動(dòng)的細(xì)胞數(shù)量明顯多于胎牛血清（圖1）和大鼠血清組（圖2）。
2.2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)心肌細(xì)胞特異基因β-MHC的表達(dá) 川芎低、高劑量含藥血清組β-MHC表達(dá)量均明顯高于胎牛血清組和大鼠血清組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P
3 討論
隨著人們生活水平的進(jìn)步，大部分人均處于亞健康狀態(tài)，心血管疾病是臨床上常見的疾病。心血管疾病的臨床突破主要來自胚胎干細(xì)胞的發(fā)展，胚胎干細(xì)胞會(huì)根據(jù)誘導(dǎo)自發(fā)分化成多種細(xì)胞，如心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等[13-15]。心肌細(xì)胞對(duì)于恢復(fù)正常供血、免疫功能均有重要的意義[16-17]。一般情況下，胚胎干細(xì)胞能夠自然分化，但分化率低，因此提高分化率顯得至關(guān)重要。臨床上對(duì)于胚胎干細(xì)胞的研究較為廣泛，但是研究方向各不相同，關(guān)于中藥的研究更是鳳毛麟角，因?yàn)樯婕叭梭w、細(xì)胞、動(dòng)物等各個(gè)方面，給研究工作帶來了一定的困難，但也有部分學(xué)者取得了可喜的成果[18-19]。有研究方向?yàn)閷⒓?xì)胞采用不同密度制成懸浮液，采用不同的方法和改變環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)，分析其分化成心肌細(xì)胞的分化率。最后對(duì)具有促進(jìn)分化功能的中藥進(jìn)行相關(guān)的安全性評(píng)價(jià)，致力應(yīng)用于臨床。川芎是傘形科藁本屬植物，經(jīng)研究表明，其具有多種臨床功效，如使血管擴(kuò)張、增加腦部血流量、改善供血、降低血液黏稠度及改善心肌缺血[20]。本課題組在研究川芎含藥血清的胚胎毒性時(shí)發(fā)現(xiàn)川芎含藥血清對(duì)胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為心肌細(xì)胞有促進(jìn)作用（P
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第6篇：干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)范文
[關(guān)鍵詞]辛伐他?。谎浪韪杉?xì)胞；增殖；分化
[中圖分類號(hào)]Q813.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2013）02-0263-04
辛伐他汀是脂類代謝途徑中的限速酶3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（3-hydroxy-3-methylglut aryl coenzyme A reductase，HMG-CoA）還原酶的抑制劑，臨床常用于降低膽固醇、降低血脂，減少心臟病的發(fā)生[1]。1999年Mundy在Science發(fā)表文章，報(bào)道辛伐他汀在骨代謝方面的影響，其實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀可顯著增加成骨細(xì)胞數(shù)量，減少破骨細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn)松質(zhì)骨骨量增加，證明辛伐他汀具有良好的促進(jìn)骨修復(fù)的性能[2]。此后，國(guó)內(nèi)外學(xué)者也通過多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了辛伐他汀的促成骨分化特性。但以往的研究表明，不同的他汀類藥物對(duì)不同類型的細(xì)胞，其增殖效應(yīng)是不同的。他汀類藥物可能抑制平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，但卻可以提高成纖維細(xì)胞的有絲分裂活性。故本實(shí)驗(yàn)采用噻唑藍(lán)法、堿性磷酸酶活性檢測(cè)、茜素紅染色等多種方法，研究辛伐他汀對(duì)人牙髓干細(xì)胞增值及分化的影響。
1 材料和方法
1.1 主要材料：胎牛血清（Hyclone，美國(guó)）；DMEM F/12（Gibco，美國(guó)）培養(yǎng)基；3mg/ml Ⅰ型膠原酶（Gibco，美國(guó)）；0.25% 胰酶（碧云天生物技術(shù)研究所，上海）；青鏈霉素（碧云天生物技術(shù)研究所，上海）；PBS緩沖溶液；100μmol/L 抗壞血酸（sigma，美國(guó)）；10mmol/L β-甘油磷酸鈉（sigma，美國(guó)）；2mmol/L L-谷氨酰胺（sigma，美國(guó)）；茜素紅（Sigma，美國(guó)）；堿性磷酸酶試劑盒（南京建成生物工程研究所，南京）；噻唑藍(lán)（Amresco，美國(guó)）；辛伐他?。╯igma，美國(guó)）；二甲基亞砜（sigma，美國(guó)）；Triton X-100（碧云天生物技術(shù)研究所，上海）。
1.2 人牙髓干細(xì)胞分離培養(yǎng)及傳代：選擇哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二臨床醫(yī)院口腔外科門診采集的因正畸拔除的正常前磨牙或阻生的正常第三磨牙（患者14～25歲），所有成年患者及未成年患者家屬均知情同意。依據(jù)Gronthos DPSCs 原代細(xì)胞培養(yǎng)法[3]，劈開實(shí)驗(yàn)牙，用鑷子取出牙髓，含雙抗PBS充分沖洗，置于體積分?jǐn)?shù)為0.3%的Ⅰ型膠原酶和0.4%的分散酶（1：1）37℃橫濕振蕩器內(nèi)消化1h，200目尼龍篩過濾懸液至10ml離心管中，1000rpm離心5min，棄上清，加入含20%FBS培養(yǎng)基，吹打混勻，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)以1×108個(gè)/L細(xì)胞接種至50ml培養(yǎng)瓶，37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每周換液兩次，細(xì)胞融合達(dá)80%后，0.25%胰蛋白酶消化，1∶2比例傳代。
1.3 DPSCs鑒定：克隆團(tuán)分選技術(shù)將DPSCs懸液進(jìn)行純化分離，流式細(xì)胞技術(shù)鑒定DPSCs，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞常規(guī)傳代至第3代用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)[4-5]。
1.4 MTT染色實(shí)驗(yàn)：將DPSCs以5×103個(gè)/孔接種在九十六孔板中，在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%C02飽和濕度條件下，于礦化培養(yǎng)液中（DMEM F/12培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素、100μmol/L抗壞血酸，10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉，2mmol/L L-谷氨酰胺[6-7]），分A、B、C、D、E五組，加入不同濃度辛伐他汀，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。各組辛伐他汀濃度為A組：1×10-5mol/L；B組：1×10-6mol/L； C組：1×10-7mol/L； D組：1×10-8mol/L；E組：0 mol/L。于細(xì)胞培養(yǎng)第3天加入MTT 20μl，37℃孵育4h，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入二甲基亞砜150μl，培養(yǎng)板均勻振蕩10min，自動(dòng)酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（A）值，觀察各組細(xì)胞增值情況。
1.5 ALP活性測(cè)定：細(xì)胞培養(yǎng)條件同MTT實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞培養(yǎng)分為ABCD四組，各組辛伐他汀濃度為：A組：1×10-6mol/L；B組：1×10-7mol/L； C組：1×10-8mol/L； D組：0 mol/L。培養(yǎng)3天時(shí)，去除培養(yǎng)板中培養(yǎng)液，0.01mol/L PBS沖洗細(xì)胞3次，加入50μl 0.1% Triton X-100，4℃冰箱過夜，光鏡下觀察已無明顯細(xì)胞結(jié)構(gòu)，反復(fù)吹打后每個(gè)樣本加入ALP緩沖液和基質(zhì)液各50μl，充分混勻，37℃水浴15min，加入顯色劑150μl，在酶標(biāo)儀上選擇520nm波長(zhǎng)檢測(cè)各孔A值。觀察各組細(xì)胞ALP活性，找出辛伐他汀誘導(dǎo)DPSCs成骨分化的最佳濃度。
1.6 茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色：將DPSCs以1×105個(gè)/孔接種于六孔板中，細(xì)胞分組及培養(yǎng)條件同ALP檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。DPSCs于14天進(jìn)行茜素紅染色，培養(yǎng)皿PBS緩沖液沖洗3遍，95%無水乙醇固定15min，蒸餾水沖洗3次，0.1%茜素紅-Tris-HCl（pH=8.3）37℃，30min，蒸餾水輕輕沖洗，干燥。
1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：使用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料采用“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”形式描述。
對(duì)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)和方差分析。
2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
2.1 DPSCs光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化：DPSCs原代培養(yǎng)24h內(nèi)細(xì)胞貼壁緩慢，可見細(xì)胞為梭形，形態(tài)較小，未完全伸展，且有少量懸浮未貼壁細(xì)胞。48h，細(xì)胞梭形，貼壁較多，少量細(xì)胞呈克隆團(tuán)狀生長(zhǎng)，見圖1。7天后可見DPSCs大量擴(kuò)增，呈伸展長(zhǎng)梭形，克隆團(tuán)狀聚集生長(zhǎng)，細(xì)胞融合率可達(dá)80%。
2.2 辛伐他汀對(duì)DPSCs增殖能力的影響：與對(duì)照組E組比較，A、B、C、D四組辛伐他汀對(duì)細(xì)胞增值均有一定的抑制作用，其中A組、B組、C組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P
2.3 辛伐他汀對(duì)DPSCs堿性磷酸酶活性的影響：A、B、C組測(cè)得的A值明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P
2.4 辛伐他汀對(duì)DPSCs礦化的影響：DPSCs 14天培養(yǎng)后，可見部分細(xì)胞發(fā)生成骨細(xì)胞樣多角形以及錐體形態(tài)改變。DPSCs在礦化誘導(dǎo)后逐漸產(chǎn)生白色點(diǎn)狀晶體。經(jīng)茜素紅染色后光學(xué)顯微鏡下均可見橘紅色礦化結(jié)節(jié)，呈團(tuán)狀不規(guī)則形態(tài)。如圖3。
3 討論
實(shí)驗(yàn)研究表明，DPSCs可向神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞等多種細(xì)胞分化[8-13]，擁有多向分化的潛能，它可以作為一種組織工程的種子細(xì)胞，用于頜骨缺損的修復(fù)治療。目前，各種藥物、細(xì)胞因子及可溶性蛋白的添加廣泛用于誘導(dǎo)DPSCs的骨向分化，如抗壞血酸、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子等[11-13]。辛伐他汀作為一種新發(fā)現(xiàn)藥物，已被證實(shí)具有促進(jìn)成骨的活性。Wang PS等人的多項(xiàng)統(tǒng)計(jì)分析表明，辛伐他汀可以明顯提高絕經(jīng)后婦女和老年人的骨密度， 降低骨折發(fā)生的比例[14-16]。Maeda 等研究辛伐他汀對(duì)非轉(zhuǎn)化成骨樣細(xì)胞（MC3T3-E1）和鼠骨髓細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)辛伐他汀能提高成骨細(xì)胞ALP活性和促進(jìn)礦化結(jié)節(jié)形成[17]。
在骨形成過程中，成骨細(xì)胞的演化經(jīng)歷細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)成熟、礦化和細(xì)胞凋亡4個(gè)不同階段，各階段調(diào)控精細(xì)，不同標(biāo)志物特異性表達(dá)。ALP的表達(dá)是成骨細(xì)胞分化的主要特征之一，是基質(zhì)成熟的早期標(biāo)志物，其作用是水解有機(jī)磷酸釋放出無機(jī)磷，促使基質(zhì)礦化[18-19]。ALP是骨形成所必需的酶，它的表達(dá)表明細(xì)胞分化和骨組織形成的開始，代表著骨形成的狀況。礦化能力是干細(xì)胞成骨的重要特性之一，組織內(nèi)的鈣質(zhì)大部分以磷酸鈣或碳酸鈣的形式存在，茜素紅AR-S法通過鈣離子與茜素紅特異性結(jié)合，可使礦化結(jié)節(jié)呈現(xiàn)鮮紅色，因此茜素紅染色是鑒定成骨分化的較特異的方法。
本實(shí)驗(yàn)采用MTT法、ALP試劑盒、茜素紅染色法檢測(cè)辛伐他汀對(duì)人牙髓干細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示，辛伐他汀抑制牙髓干細(xì)胞的增值，但對(duì)牙髓干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化具有促進(jìn)作用。預(yù)示該藥具有骨缺損治療的臨床應(yīng)用前景，為頜骨骨缺損的組織工程修復(fù)提供了理論依據(jù)。辛伐他汀對(duì)人牙髓干細(xì)胞影響的研究還不成熟，本實(shí)驗(yàn)只是進(jìn)行了初步的探討，具體的藥物濃度、作用方式和作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。
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第7篇：干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)范文
[關(guān)鍵詞] 神經(jīng)干細(xì)胞；慢病毒載體；轉(zhuǎn)基因；神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3；腦缺血
應(yīng)用干細(xì)胞移植技術(shù)來治療中風(fēng)等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基礎(chǔ)研究已取得一定進(jìn)展。但到目前為止，還沒有直接證據(jù)表明移植細(xì)胞能和宿主的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建立有功能的突觸聯(lián)系[1]。近年來，研究方向已轉(zhuǎn)向促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system， CNS）內(nèi)源性NSCs的增殖、存活及向神經(jīng)元方向分化[1]。本研究旨在進(jìn)一步探討細(xì)胞移植后對(duì)大鼠海馬區(qū)內(nèi)源性細(xì)胞增殖及向神經(jīng)元方向的分化的影響。
1材料和方法
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及器械
孕14天Sprague-Dawley大鼠1只及雄性Sprague-Dawley大鼠（體重230g～250g）由汕頭大學(xué)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。15ml離心管（Corning，Mexico）， 低溫離心機(jī)（Lock-Song，北京路科順高新技術(shù)有限公司），一次性200目尼龍細(xì)胞篩（BD Falcon，美國(guó)），24孔培養(yǎng)板（Corning，美國(guó)）， 25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶（Corning，美國(guó)），CO2恒溫培養(yǎng)箱（Thermo forma 3110 series， 美國(guó)），倒置熒光顯微鏡（Leica，德國(guó)），手術(shù)顯微鏡（Leica，德國(guó)），立體定向儀（江灣II型-C）。
1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
干細(xì)胞培養(yǎng)液：DMEM/F12培養(yǎng)液（Gibco，美國(guó)），添加b-FGF（20ng/ml，Cytolab/Peprotech Asia，美國(guó)）、EGF 20ng/ml，Cytolab/Peprotech Asia，美國(guó)），1%濃度的N2和2%濃度的B27添加劑（Invitrogen，美國(guó)），谷氨酰胺（2mmol/ml，Hyclone， 美國(guó)）、青霉素（10u/ml， Gibco ，美國(guó)）、鏈霉素（10mg/ml， Gibco ，美國(guó)）。4℃保存。0.25%胰蛋白酶（Gibco ，美國(guó)），胎牛血清（Invitrogen，美國(guó)）； 10%水合氯醛（Sigma-Aldrich） ； 表達(dá)hNT3基因的慢病毒載體（LV/ hNT-3，上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建）。
1.3 神經(jīng)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及hNT-3基因修飾
從孕14天Sprague-Dawley胎鼠海馬組織提取NSCs，進(jìn)行體外無血清培養(yǎng)、擴(kuò)增和純化 [2]。經(jīng)免疫熒光Nestin染色鑒定后，取第五代的神經(jīng)干細(xì)胞球，用0.125%的胰蛋白酶消化和機(jī)械吹打的方法，使神經(jīng)球分散成3～5個(gè)細(xì)胞一簇；4℃離心1000rpm×5min，吸走上清，再用干細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞兩次；用干細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，以1×105 cells /500µl/孔接種于24孔板，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；3～4h后，各孔以最佳感染復(fù)數(shù) （multiplicity of infection， MOI）為10的比例加入LV/ hNT-3稀釋液100µl， 10h后置換出病毒液，培養(yǎng)條件不變。已轉(zhuǎn)染hNT-3基因的NSCs命名為NSCs-hNT3。
1.4 大鼠缺血再灌注模型（tMCAO）建立及細(xì)胞移植
參考Pringle等的方法，建立大鼠tMCAO模型[3]，右側(cè)大腦中動(dòng)脈阻斷時(shí)間為2h。tMCAO模型建立后7d，選取神經(jīng)損害程度評(píng)分[4] （Neurological Severity Scores，NSS）為8～9分的大鼠，隨機(jī)分為NSCs-hNT3治療組、NSCs治療組及生理鹽水對(duì)照組，各組動(dòng)物數(shù)均為6個(gè)（最終納入實(shí)驗(yàn)數(shù)）。細(xì)胞治療組分別移植NSCs-hNT3或NSCs 2 00，000 cells/10µl，生理鹽水對(duì)照組注射10µl生理鹽水。具體方法參照文獻(xiàn)報(bào)道[2]。
1.7 BrdU標(biāo)記及標(biāo)本取材
三組大鼠，在細(xì)胞移植7天后開始腹腔注射BrdU（50 mg/kg， b.i.d，共6天），對(duì)內(nèi)源性新增殖的細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。在最后一次注射結(jié)束后24h內(nèi)（細(xì)胞移植后第14天），完成NSS評(píng)分后，處死動(dòng)物取材。具體是：以10％水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，用冰生理鹽水和4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌洗固定后，取出腦標(biāo)本，4%多聚甲醛4℃下后固定24h，30％蔗糖脫水48h。標(biāo)本用冰凍切片機(jī)行冠狀位連續(xù)冰凍切片，片厚20 µm。切片取材部位為背側(cè)海馬區(qū)（冠狀縫后3.0 mm-4.5 mm）。切片收集到24孔板內(nèi)，浸泡在凍存液內(nèi)-20℃保存?zhèn)溆?。每?張取1張切片用于免疫熒光組織化學(xué)染色，對(duì)體內(nèi)新增殖的細(xì)胞及其分化進(jìn)行檢測(cè)。
1.8 免疫熒光雙標(biāo)染色
取24孔板，孔內(nèi)預(yù)先加入TBS。將冰凍切片從凍存液內(nèi)取出放入板孔內(nèi)，行抗BrdU/DCX雙標(biāo)染色。具體如下：（a） TBS洗3次，每次5min；（b） 50%甲酰胺/2×SSC在65℃條件下作用2h；（c） 吸去液體后用2×SSC洗2次，每次5min；（d） 2N的HCl 37℃處理10 min；（e） 0.1M的硼酸緩沖液室溫下10min，TBS洗3次，每次5min；（f） 3%H2O2 37℃處理10 min ，蒸餾水洗3min，TBS洗5min；（g） 用含5%羊血清、0.1%BSA、0.1%TritonX-100的TBS在37°C封閉30min；（h） 吸去封閉液，加入小鼠抗BrdU IgG （1：100）與兔抗DCX IgG （1：100），將腦片漂浮在上述抗體中，4°C孵育過夜；（i） TBS洗3次后， 各孔內(nèi)加入用封閉液稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗鼠和TRITC標(biāo)記的羊抗兔的二抗混合液（1：100）。室溫暗盒中作用40min后，各孔再加入0.1%的DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色，繼續(xù)作用10min；（j）TBS洗3次后用毛筆把腦片裱貼在載玻片上，并用 50%甘油封片，置熒光顯微鏡下觀察，參考Baldauf [5]方法對(duì)海馬齒狀回SGZ和SCZ區(qū)域800µm范圍進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)、照相。用 Image plus 6.0圖像處理軟件來處理和分析圖像。
1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以X±S表示，組間細(xì)胞計(jì)數(shù)先應(yīng)用Kruskal-Walis法進(jìn)行差異性檢驗(yàn)，再用Mann-Whitney’ U檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
2結(jié)果
2.1 神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定
原代培養(yǎng)5～7天， 即形成懸浮生長(zhǎng)的神經(jīng)球（圖1），免疫熒光Nestin染色陽性，在熒光顯微鏡下觀察呈綠色（圖2）。
圖1倒置顯微鏡下觀察呈懸浮生長(zhǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞球
圖2熒光顯微鏡下觀察呈綠色的
Nestin 染色陽性的神經(jīng)干細(xì)胞球
2.2 免疫熒光染色
圖3免疫熒光染色
各組大鼠缺血側(cè)海馬DG區(qū)新增殖的BrdU+細(xì)胞（紅色）、DCX+細(xì)胞（綠色）及非特異性細(xì)胞核DAPI染色（藍(lán)色）。其中 A-E 為NSCs-hNT3治療組，A1-E1為 NSCs治療組；A2-E2為生理鹽水對(duì)照組。D、D1及D2分別為對(duì)應(yīng)組別的融合圖像，BrdU+/DCX+的細(xì)胞顯示為黃色。E、E1及E2分別為對(duì)應(yīng)組別融合圖像的局部放大，箭頭所示為BrdU+/DCX+細(xì)胞，即海馬DG區(qū)新增殖并已向神經(jīng)元方向分化的內(nèi)源性細(xì)胞。Bars=100µm
圖4各組缺血側(cè)海馬DG區(qū)增殖細(xì)胞數(shù)比較。
*表示組間比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著（P
雖然海馬組織未直接受到缺血性損傷，但是缺血發(fā)生后，缺血性損傷同側(cè)海馬區(qū)也會(huì)出現(xiàn)新生細(xì)胞增多，表現(xiàn)為BrdU+（紅色），主要位于齒狀回附近（圖3）。細(xì)胞移植2周后，Kruskal-Walis檢驗(yàn)示3組間BrdU+細(xì)胞數(shù)有顯著性差異 （X2=13.36， P=0.001），NSCs-hNT3治療組和NSCs治療組海馬齒狀回SGZ和SCZ BrdU+細(xì)胞數(shù)（63.8±8.1 cells/800µm，52.5±6.7 cells/800µm）顯著高于生理鹽水對(duì)照組（13.3±2.5 cells/800µm）（P=0.004， P=0.004 respectively），且NSCs-hNT3治療組BrdU+性細(xì)胞數(shù)也顯著高于和NSCs治療組 （P=0.037）。DCX是未成熟神經(jīng)元的免疫學(xué)指標(biāo)（綠色）。DAPI將細(xì)胞核非特異性染成藍(lán)色。用Image plus 6.0圖像處理軟件將三種不同染色圖像進(jìn)行融合，顯示>90%的新增殖細(xì)胞為BrdU+/DCX+細(xì)胞（黃色）。三組之間BrdU+/DCX+細(xì)胞數(shù)也存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（ X2=13.93， P=0.001），組間兩兩比較結(jié)果與BrdU+細(xì)胞數(shù)比較結(jié)果相一致（圖4）。
3討論
Parkinson，s病、中風(fēng)及脊髓損傷等神經(jīng)系統(tǒng)常見疾病是由神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能缺失所致，干細(xì)胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究已取得一定進(jìn)展。但遺憾的是，由于諸多因素的影響，移植的干細(xì)胞及其在宿主CNS內(nèi)的子代細(xì)胞，大多數(shù)會(huì)在短期內(nèi)死亡[1，7，8]，而且干細(xì)胞在體內(nèi)自行分化成神經(jīng)元的比例低，是影響療效提高的重要因素。且到時(shí)目前為止，并沒有獲得移植細(xì)胞與宿主神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建立突觸聯(lián)系的確切證據(jù)。近來，基于干細(xì)胞治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究熱點(diǎn)，已轉(zhuǎn)向促進(jìn)CNS內(nèi)源性NSCs增殖并向神經(jīng)元方向分化，防止其凋亡，并整合到神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中，進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)功能和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)重塑[9]。
利用干細(xì)胞攜帶目的基因到達(dá)損傷部位或病灶局部，以達(dá)到修復(fù)損傷、治療疾病的目的， 是目前干細(xì)胞研究的另一個(gè)熱點(diǎn) [10，11，12]。以NSCs作為基因治療的細(xì)胞載體，來治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，具有其特別的優(yōu)點(diǎn)。NSCs不僅具有自我更新和多方向分化潛能，而且具有低免疫原性，以及向病灶和損傷部位敏銳的趨化性，移植基因修飾的NSCs， 一方面不僅可以突破血腦屏障的限制，在病變或損傷部位通過表達(dá)目的基因來發(fā)揮治療作用。另一方面有望解決基因治療的靶向性問題。而且與直接體內(nèi)法（in vivo）比較，可以降低基因治療過程中病毒載體產(chǎn)生的免疫毒性反應(yīng)。其次，NSCs移植到體內(nèi)后，存活的時(shí)間比骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、臍血干細(xì)胞等長(zhǎng)，滿足基因長(zhǎng)期表達(dá)的需要。此外，與其它載體細(xì)胞如成纖維母細(xì)胞不同，NSCs移植能分化成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞[13] 。移植基因修飾的NSCs治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，有望獲得細(xì)胞移植和基因治療的雙重療效。
在海馬DG區(qū)， 內(nèi)源性NSCs增殖主要發(fā)生在腦缺血后第一周，到第2、3周則已恢復(fù)至至正常對(duì)照水平。新增殖的細(xì)胞存活可達(dá)3周 [7，8]。本研究中，我們?cè)诖笫笕毖俟嘧⒛X損傷發(fā)生1周后，將NSCs-hNT3移植到大鼠紋狀體半暗帶，對(duì)照組移植普通NSCs或生理鹽水。我們發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞移植2周后（腦缺血3周后），生理鹽水對(duì)照組缺血側(cè)海馬區(qū)僅少許BrdU+細(xì)胞，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致。而與之比較，NSCs治療組缺血側(cè)海馬SGZ區(qū)BrdU+/DCX+細(xì)胞顯著增加（P=0.004），提示大鼠體CNS內(nèi)源性NSCs增殖因外源性NSCs移植而增強(qiáng)，這可能是因細(xì)胞移植后，分泌了一些可改善缺血局部的微環(huán)境的營(yíng)養(yǎng)因子，對(duì)CNS內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖與存活發(fā)揮了促進(jìn)作用。hNT-3是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族成員之一，具有介導(dǎo)NSCs存活的作用[14]，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和損傷后修復(fù)過程中還能誘導(dǎo)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化[15]。正常生理情況下，hNT-3的表達(dá)維持在較低水平。但經(jīng)基因hNT-3修飾的NSCs移植到大鼠CNS內(nèi)，能夠表達(dá)豐富的hNT3因子[2]。這可能是NSCs-hNT3移植后，缺性性腦損傷大鼠海馬區(qū)內(nèi)源性細(xì)胞增殖進(jìn)一步顯著增強(qiáng)（P=0.037）的原因之一。在海馬DG區(qū)，免疫熒光染色示>90% 的新增殖細(xì)胞為BrdU與DCX染色雙陽性（BrdU+/DCX+），提示新生的NSCs主要向神經(jīng)元方向分化，也許其中部分細(xì)胞已經(jīng)分化成成熟的神經(jīng)元，不過有待進(jìn)一步研究。
干細(xì)胞移植治療CNS疾病，其作用機(jī)理復(fù)雜，一般認(rèn)為是通過分泌多種細(xì)胞因子及免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)起作用――即所謂的“旁路作用機(jī)理（bystander mechanism）”[1]。利用基因技術(shù)手段，對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行基因修飾已是相對(duì)成熟的技術(shù)。但基因修飾的干細(xì)胞在表達(dá)生成特殊細(xì)胞因子的同時(shí)，可能會(huì)使其它細(xì)胞因子的表達(dá)發(fā)生意想不到的變化。移植到宿主體內(nèi)后，各種細(xì)胞因子的表達(dá)、調(diào)控及對(duì)CNS的影響更為復(fù)雜。對(duì)此，我們必須有清醒的認(rèn)識(shí)。
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第8篇：干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)范文
【關(guān)鍵詞】骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)；細(xì)胞鑒定
【中圖分類號(hào)】R392.4【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】1044-5511（2011）11-0346-02
骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-drived mes-enchymal stem cells,BMSCs是來源于骨髓的 MSCs，具有采集方便的優(yōu)點(diǎn)，是理想的組織工程種子細(xì)胞［1］具有多向分化和自我復(fù)制潛能,易于自體采集、無免疫排斥反應(yīng)、避免倫理學(xué)限制等優(yōu)點(diǎn),在細(xì)胞治療方面得到了廣泛的應(yīng)用。但是BMSCs在骨髓微環(huán)境中所占比例極少,使用何種簡(jiǎn)單操作方法快速獲取形態(tài)均一和純度較高的BMSCs便成為該研究領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)［2］。本實(shí)驗(yàn)采用全骨髓貼壁細(xì)胞培養(yǎng)法和密度梯度離心法相結(jié)合分離、純化BMSCs，通過體外培養(yǎng)擴(kuò)增，以及流式細(xì)胞術(shù)鑒定，建立穩(wěn)定的BMSCs培養(yǎng)擴(kuò)增方法。
1 材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：日本大耳白兔4只，4周齡，雌雄不限，體重250~300g，購(gòu)于蘭州生物制品研究所。
1.2 主要試劑及儀器：二氧化碳培養(yǎng)箱(BB16UV型,德國(guó)Heraeus公司)、超凈工作臺(tái)(VS-1300L型,蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限責(zé)任公司)、倒置相差顯微鏡、超聲波清洗儀、純凈水系統(tǒng)、酸度計(jì)、臺(tái)式高速離心機(jī)(北京科偉永鑫實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備廠)、低糖培養(yǎng)基(GBICO公司)、胎牛血清（杭州四季青）、谷氨酰胺、青鏈霉素、胰酶、流式細(xì)胞抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）。
1.3 兔BMSCs的采集： 取4周齡日本大耳白兔一只，雌雄不限，20ml空針空氣栓子經(jīng)耳緣靜脈注入，待兔死亡后，將其全部浸泡于75%酒精溶液內(nèi)8~10分鐘，在無菌環(huán)境下切開前后肢皮膚，切下兔前后兩肢，剃去覆蓋于肱骨、脛骨及股骨上的肌肉組織，注意保留骨的完整性，用組織剪分離股骨、脛骨及肱骨，將其置于無菌培養(yǎng)皿中，縱向依次剪開各長(zhǎng)骨兩端，5ml注射器沿剪開的骨端注入L-DMEM沖洗3次，收集沖洗液約10ml，用篩網(wǎng)過濾沖洗液，加入完全低糖培養(yǎng)基重懸組織沖洗液，吸管反復(fù)吹打混勻，1000 r/ min ，4 ℃，離心 5 min ，棄去上清。再次加入適量完全低糖培養(yǎng)基，吹打混勻，分別加入一次性培養(yǎng)皿中，放入37℃，體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（圖1）。
1.4 兔 BMSCs 培養(yǎng)：1.4.1 原代 BMSCs 培養(yǎng) 向分離得到的細(xì)胞組織懸液加入 10ml 含 20 %胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的 L-DMEM 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至中號(hào)塑料培養(yǎng)皿內(nèi)。將培養(yǎng)皿置于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為 5 %的 CO2孵箱中培養(yǎng)。培養(yǎng) 72 h后使用含 20 %FBS 的 L-DMEM 完全培養(yǎng)基換液。原代培養(yǎng) 5-7 天后，細(xì)胞融合可達(dá) 80 %以上。將原代培養(yǎng)的 BMSCs 在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞集落的形成和細(xì)胞形態(tài)（圖2）。
1.4.2 傳代 BMSCs 培養(yǎng) 待原代細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底后，用EDTA胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，F(xiàn)BS 終止消化后將細(xì)胞懸液以 1:3 比例接種于新培養(yǎng)瓶中，加入含 10 %FBS 的 L-DMEM完全培養(yǎng)基 5ml 培養(yǎng)，每隔 2 天換液，約 3-4 天后細(xì)胞可鋪滿瓶底。將傳代培養(yǎng)的 BMSCs 在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。以此方法，向后傳至三代（圖3、4）。
1.5 兔 BMSCs的鑒定
對(duì)干細(xì)胞的鑒定主要是建立在對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)記物的識(shí)別基礎(chǔ)上，采用流式細(xì)胞儀特有的細(xì)胞分析技術(shù)，可在短時(shí)間內(nèi)精確分析出細(xì)胞表型以及其所占有的比例，使用間接標(biāo)記法標(biāo)記 CD44、CD34。取第3 代 BMSCs 以 2.0×105/mL 重懸，PBS 洗滌細(xì)胞 3次，向細(xì)胞懸液中加入鼠抗兔CD44、CD34 （稀釋 1:100） 為一抗，4 ℃保存 30 min，加入羊抗鼠含 FITC、PE 的二抗，4 ℃避光保存 30min。PBS 洗滌細(xì)胞 3 次后放入流式細(xì)胞儀中檢測(cè)。記錄數(shù)據(jù)（圖5、6）。
2 討論
BMSCs具有貼壁性、具有強(qiáng)大的增殖能力和多向分化潛能、具有免疫調(diào)節(jié)功能、具有來源方便，易于分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增和純化，多次傳代擴(kuò)增后仍具有干細(xì)胞特性，不存在免疫排斥的特性。
2.1更好地增加BMSCs的貼壁性： 在BMSCs培養(yǎng)中，細(xì)胞貼壁培養(yǎng)與傳代成功與否是本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。其中存在很多問題，比如在細(xì)胞貼壁方面，用一次性塑料培養(yǎng)皿效果要優(yōu)于可重復(fù)使用的玻璃培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿。塑料培養(yǎng)皿內(nèi)壁有一層鼠尾膠原，它可以更好地促使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁。
2.2 培養(yǎng)基最佳的酸堿度： 培養(yǎng)基中加碳酸氫鈉的目的，是為了在二氧化碳培養(yǎng)箱中平衡培養(yǎng)基中的PH值。對(duì)于GBICO的DMEM培養(yǎng)基，3.7g是對(duì)應(yīng)二氧化碳培養(yǎng)箱的二氧化碳濃度設(shè)定在10%，而5%的則對(duì)應(yīng)的是2g碳酸氫鈉。暴露在空氣中的培養(yǎng)液，因?yàn)榇髿庵卸趸嫉臐舛群艿停后w中的二氧化碳會(huì)氣體分壓高于大氣，因此會(huì)逐漸溢出，濃度逐漸降低，液體的PH值也逐漸升高，如果DMEM在空氣中存放時(shí)間過長(zhǎng)，它將有可能變成紫紅色。一般新配置的顏色正常，在多次開蓋，培養(yǎng)液接觸空氣的時(shí)間較長(zhǎng)后，顏色會(huì)逐漸變成紫紅色，筆者的做法是，配制培養(yǎng)液時(shí)加hepes，用小容量的分裝瓶分裝，及盡量減少培養(yǎng)液與空氣的接觸時(shí)間。配培養(yǎng)基時(shí)，將酸堿度調(diào)至6.9-7.0，過濾后酸堿度會(huì)適當(dāng)增高。
2.3 傳代的注意事項(xiàng)
2.3.1 EDTA-胰酶最佳消化時(shí)間：具筆者在試驗(yàn)中的觀察，在BMSCs傳代過程中，根據(jù)培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中貼壁細(xì)胞的覆蓋率確定，當(dāng)BMSCs貼壁達(dá)到80%-90%就可以傳代了，用玻璃尖吸管滴入EDTA-胰酶4-7滴，在倒置相差顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞70%由原來的紡錘狀、梭形變化為橢圓形時(shí)為最佳時(shí)間，一般為1至2分鐘。
2.3.2 加入EDTA-胰酶后的吹打時(shí)間與次數(shù) ：加入EDTA-胰酶后，靜置1分鐘，在鏡下觀察細(xì)胞變橢圓或圓形，并有輕度漂浮時(shí)，用尖吸管輕輕吹打3-6次即可。
2.3.3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞特異性標(biāo)志物： 雖然目前尚未發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞特異性標(biāo)志物，Pittenger等認(rèn)為CD29、CD44、CD105、CD166、SH2、SH3為間充質(zhì)干細(xì)胞的重要標(biāo)志物［3］。
綜上所述，對(duì) BMSCs 的形態(tài)學(xué)觀察和表型分子鑒定實(shí)驗(yàn)均證實(shí)培養(yǎng)傳代的 BMSCs 的生物學(xué)特性并未發(fā)生明顯改變，說明本實(shí)驗(yàn)的分離培養(yǎng)擴(kuò)增方法安全有效。本實(shí)驗(yàn)成功的建立了一系列分離、體外培養(yǎng)和擴(kuò)增兔 BMSCs 的實(shí)驗(yàn)方法，為進(jìn)一步組織工程研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
參考文獻(xiàn)
［1］ 兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)和生物學(xué)特性觀察Progress in Modern Biomedicine Vol.10 NO.17 SEP.2010 3239-3243
［2］骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及生物學(xué)特性 陳建梅姚榮偉 李勇 張馥敏 江蘇醫(yī)藥2010年10月第36卷第19期2306-2308
第9篇：干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)范文
【關(guān)鍵詞】阿爾茨海默?。凰囊野?；β淀粉樣多肽；神經(jīng)干細(xì)胞
基金項(xiàng)目：黑龍江省佳木斯大學(xué)研究生創(chuàng)新科研項(xiàng)目資金（項(xiàng)目編號(hào)：YJSCX2011021JD）；黑龍江省科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：2012772）
作者單位：154000佳木斯大學(xué)阿爾茨海默?。ˋlzheimers disease， AD）是與衰老相關(guān)， 以嚴(yán)重的高級(jí)認(rèn)知功能障礙為特征的隱襲性、逐漸性進(jìn)展的退行性腦病[1，2]。AD 發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜， 主要病理學(xué)特點(diǎn)是β淀粉樣多肽（Aβ）聚集形成的老年斑（SP） 和神經(jīng)原纖維纏結(jié) （NFT） 的形成， 伴腦皮質(zhì)層神經(jīng)元減少[3，4]。在研究中發(fā)現(xiàn)，AD患者常伴發(fā)大腦海馬區(qū)的萎縮和神經(jīng)干細(xì)胞的減少。同時(shí)也證實(shí)Aβ具有神經(jīng)元毒性作用[5]和誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞的凋亡[6]，Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡的同時(shí)均伴隨鉀通道激活，尤其是延遲整流鉀電流增強(qiáng)[7]。TEA是鉀通道阻滯劑，研究證實(shí)心肌細(xì)胞凋亡中鉀通道阻滯劑能起到保護(hù)和抑制的作用[8]。本研究以鉀離子通道阻滯劑TEA作用于Aβl40誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞，觀察神經(jīng)干細(xì)胞存活和Caspase3活性的變化，探討Aβ致傷的神經(jīng)干細(xì)胞凋亡時(shí)鉀通道阻滯劑TEA在其中的作用。
1資料與方法
11實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑及儀器雄性 Wistar 大鼠（
12大鼠海馬區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞的分離與傳代培養(yǎng)及鑒定新生的Wistar 大鼠（
13實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)共分四組：Aβ140組：在傳三代后的神經(jīng)干細(xì)胞加入Aβ140 5 μM；Aβ140+TEA組：在Aβ140 5 μM孵育前30 min加入TEA 5 mM；空白對(duì)照組：加入等量的培養(yǎng)液的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)組；TEA對(duì)照組：神經(jīng)干細(xì)胞加入TEA 5 mM。上述各組分別在0 h，12 h，24 h和48 h個(gè)時(shí)間點(diǎn)行細(xì)胞活性及凋亡檢測(cè)。
14MTT法檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞的存活率四組傳代后的神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)不同處理后，停止培養(yǎng)前4 h將每孔加入MTT溶液（5 mg/ml）20 μl使終濃度為 1 mg/ml，放置37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用翻板法將96孔板內(nèi)的培養(yǎng)基棄去，在每孔中加入溶解液 DMSO 150 μl，振蕩 10 min使其充分溶解結(jié)晶產(chǎn)物。在酶標(biāo)儀上以波長(zhǎng)570nm檢測(cè)每孔的OD值。所檢測(cè)OD值的大小可反映細(xì)胞代謝活性的強(qiáng)弱。每組設(shè)3個(gè)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，細(xì)胞存活率的計(jì)算：細(xì)胞存活率=試驗(yàn)組光吸收值/對(duì)照組光吸收值×100%。