核磁共振波譜法的基本原理精選(九篇)

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第1篇：核磁共振波譜法的基本原理范文

摘要：

本文對莢膜多糖進行了概述，綜述近年來細菌莢膜多糖相關的研究進展，并從理化性質與生物學功能的角度出發(fā)，總結了近年來莢膜多糖提取、分離、純化等方面的研究，重點介紹了與莢膜多糖結構相關的研究進展。本文為進一步研究細菌致病性、分型機制提供必要的方法，為疫苗的設計提供基礎數據，對加強致病菌的防控具有重要意義。

關鍵詞：

莢膜多糖；提??；分離；純化；理化性質

莢膜多糖是細菌細胞壁外層的膠狀物質，具有抗原性和特異性，可用于細菌鑒定［1］，是細菌重要的毒力因子［2］。莢膜多糖是一種分子量大、極性大的物質，對其進行分離純化和結構解析要比單糖和寡糖更加復雜。很多細菌的表面都具有莢膜，例如肺炎鏈球菌，B群鏈球菌，豬鏈球菌等［3］。有報道認為莢膜的存在與細菌耐藥性呈正相關，一旦感染則發(fā)病率和死亡率都很高［4］。為進一步了解細菌的致病機制，設計及研制更加有效的疫苗，研究細菌莢膜多糖的結構日益引起了國內外學者的重視。本文主要針對莢膜多糖的分離純化和結構解析的最新研究進展進行綜述。

1細菌莢膜多糖的概述

莢膜是某些細菌表面的特殊結構，是一層位于細胞壁表面的松散的粘液物質，莢膜的成分因菌種不同而異，主要是由糖與糖醛酸組成的聚合物，如豬鏈球菌的莢膜多糖。也有部分細菌的莢膜多糖含有多肽及脂質，如炭疽桿菌［5］。細菌莢膜具有抗原性，可用于細菌的鑒定［1］。細菌鑒定的前提是對細菌進行科學的分型，目前對于細菌分型主要有兩大分型系統(tǒng)，即血清型分型系統(tǒng)和基因分型系統(tǒng)。血清型分型系統(tǒng)主要依據莢膜多糖和脂多糖不同的抗原性對細菌進行區(qū)分?；蚍中拖到y(tǒng)主要依據毒力因子，與免疫相關的因子等因素為主，將具有相同致病機制的細菌分為一類［6］。莢膜多糖作為細菌的毒力因子，其與細菌的血清型有密切關系。不同血清型的細菌會產生不同的毒力因子，對宿主造成不同的影響，而不同的毒力因子是通過不同的基因進行編碼的，因此，毒力因子與血清型之間存在著密不可分的關系。由于莢膜位于細菌最外部，是細菌感染宿主時最先接觸的物質，所以多為細菌主要的毒力因子［2］。莢膜多糖作為毒力因子，在細菌抵抗免疫系統(tǒng)中吞噬細胞吞噬過程中擔任著重要角色［7］。以豬鏈球菌為例，豬鏈球菌2型的莢膜多糖主要由鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、N2－乙酰半乳糖胺和唾液酸這5種單糖組成，其糖蛋白是由231個氨基酸殘基組成，由位于基因組3846～4541bp之間的一段長696bp基因序列編碼［8］。莢膜多糖的存在降低了豬鏈球菌被吞噬細胞吞噬的程度，而無莢膜的突變株容易被吞噬。莢膜的厚度越大越有利于抵抗豬多形核白細胞的吞噬［9］。實驗表明，由于莢膜多糖的存在，使豬鏈球菌2型能夠抵抗巨噬細胞的吞噬，并且使被吞噬的細菌可以在巨噬細胞中存活至少3h［10］。Gottschalk和Segura在2000年提出“特洛伊木馬”模型，即豬鏈球菌黏附在免疫細胞上，特別是單核細胞，隨著單核細胞通過血腦屏障［11］，這就是莢膜多糖發(fā)揮抗吞噬能力的機制。莢膜多糖作為毒力因子，致病機理就在于抗吞噬能力，黏附能力和維持細菌在細胞內部存活的能力。

2細菌莢膜多糖的理化特征

從化學組成上來說，大部分的細菌莢膜多糖是以2種或以上的單糖（如D－葡萄糖，D－半乳糖，L－鼠李糖等）及其他物質（如磷酸根，唾液酸等）為重復單元，聚合形成的大分子物質。大多數細菌的莢膜多糖為酸性黏多糖，屬于雜多糖類。有文獻報道b型流感嗜血桿菌莢膜多糖的主要成分是多聚核糖基核糖醇磷酸鹽［12］。還有一部分細菌莢膜多糖是有乙?；亩嗵墙M成［13］。A群腦膜炎奈瑟菌莢膜多糖，其主要結構是多聚磷酸乙酰氨基吡喃型甘露糖，乙?；Y構是該菌最重要的免疫原性表位［14］。從化學結構上來說，莢膜多糖通過各種作用力，如分子間氫鍵或者其他非共價鍵，與細胞壁之間形成了比較強韌的外膜，黏附在細菌的表面。莢膜多糖是由重復的單糖通過糖苷鍵連接形成聚合物，由于單糖種類不同，連接方式不同，多糖結構中是否存在支鏈，有機或者無機分子等因素導致莢膜結構解析存在巨大的復雜性［15］。正是因為其分子組成復雜性和構型多樣性，科研人員以此作為細菌血清學分型的基礎，即根據細菌莢膜多糖的抗原性的異同對細菌進行分型。肺炎雙球菌，根據其莢膜多糖的抗原性，迄今為止，可分為96種血清型，而其中有30多種血清型有致病性。大腸桿菌，據文獻報道，已經發(fā)現超過90種血清型，其中有少數是具有侵襲感染能力的，而在可以引發(fā)新生兒腦膜炎的這類大腸桿菌具有相同的多糖鏈，只是多糖的不同修飾導致它們之間存在差異［16］。

3細菌莢膜多糖的功能

莢膜由于其具有耐干燥，黏附，儲存養(yǎng)分等功能，成為致病性細菌的一種重要的毒力因子。細菌莢膜中水分占到95％以上，含有大量水分的莢膜在細菌的表面，可以避免細菌脫水死亡，這就使得有莢膜的細菌更容易在宿主間相互傳播［17］。莢膜多糖還能夠促進細菌與細菌或者細胞之間的黏附，從而促進生物膜的形成和在不同的生存環(huán)境中的定植［18］。例如，能夠引起齲齒的唾液鏈球菌和變異鏈球菌會分泌己糖基轉移酶，使口腔中的蔗糖轉變成果聚糖，這種果聚糖能使細菌牢牢黏附于牙齒表面，而細菌發(fā)酵糖類產生的乳酸在局部積累后，會使牙齒表面的琺瑯質層發(fā)生腐蝕而引起齲齒［19］。某些細菌的莢膜還是儲存養(yǎng)分的場所，以備細菌處于營養(yǎng)缺乏時可以利用，如黃色桿菌的莢膜。而豬鏈球菌的莢膜除上述作用外，最重要的作用是抗吞噬作用，由于它的存在大大降低了豬鏈球菌被吞噬的程度，而莢膜厚度的增加也會使豬鏈球菌抗白細胞殺傷能力［20］。

4細菌莢膜多糖的分離純化

莢膜多糖的提取分離一般分以下幾個步驟：去菌體，粗提總糖，去除蛋白質和核酸，分級分離［21－22］。

4．1去除菌體和總糖粗提取在提取多糖之前，首先需要去除菌體。目前，去除菌體提取總糖的方法主要有離心法，酶解法，巴氏滅菌法［23］等。離心法，將滅菌過的培養(yǎng)液通過離心機離心，然后收集上層清液的方法除去菌體。但是該方法去除菌體的效果差，離心的效果依賴于高效能的離心設備。對于含有唾液酸等不穩(wěn)定結構的莢膜多糖，最常用的方法是酶解法，即細菌培養(yǎng)液離心得到菌體，然后將菌體分散在緩沖液中，再加入不同的酶，酶解菌體，最后再次離心使菌體碎片和莢膜多糖分離，取上層清液［24］。用溶菌酶來裂解菌體，從而可以避免破壞莢膜多糖。酶解法的成本較高，但是專一性強，去除菌體的效果較好。中國海洋大學的趙峽課題組通過將菌體分散在甘氨酸緩沖液中，然后加入溶菌酶裂解消化的方法去除豬鏈球菌菌體，從而得到莢膜多糖［25］。巴氏滅菌法，通過對菌液進行加熱滅菌，隨著溫度的提高，多糖的溶解度逐步提高，有利于后續(xù)的離心。巴氏滅菌法便于操作，去除菌體效果較好，過程中要注意溫度，溫度過高會導致多糖分解。在2013年Gottschalk課題組發(fā)表的文章中，通過此方法，在121℃加熱菌液75min來達到去除菌體的目的，從而得到14型豬鏈球菌的莢膜多糖［26］。

4．2去除蛋白質和核酸由于一些細菌的莢膜多糖結構復雜且穩(wěn)定性較差，所以在純化過程中要注意方法的選擇。有機溶劑多級沉淀法由于其操作簡單并且對操作人員的良好性被廣泛使用［27］。有機試劑引起多糖、蛋白等物質沉淀的原因是加入有機試劑使水溶液的介電常數降低，從而增加了具有相反電荷的基團之間的吸引力，促使分子聚集而沉淀，此類現象類似鹽析。但是利用該法沉淀莢膜多糖的同時也會導致核酸和蛋白的沉淀，為避免多糖中混合核酸和蛋白，可以在溶液中加入陽離子，例如CaCl2，NaCl，利用陽離子和帶負電的基團結合，降低多聚核苷酸鏈之間的排斥作用，從而去除核酸和蛋白，或者通過加入酶，將蛋白質去除，得到莢膜多糖的沉淀［28］。

4．3分級分離根據莢膜多糖的理化性質對其進行分級分離，莢膜多糖是一種極性很大，分子量之間存在較大差異的物質。所以可以通過體積排阻色譜技術進行分離純化，其中凝膠層析技術運用最為成熟，且效果最佳［29］。莢膜多糖除了可以根據分子量差異進行分離純化，在其組成中有磷酸基或者乙?；@些基團可以使莢膜多糖具有不同的電荷性質和pH值，根據此類理化性質可以采用離子交換技術對其進行分離純化［30］。進一步的純化還可以采用超濾法，這是一種用于分子分離的膜分離技術，操作簡便，無需添加化學試劑［31］?？梢愿鶕蛛x的物質的性質選擇不同規(guī)格的超濾膜。

4．3．1凝膠色譜法凝膠色譜法是一種簡單而快速的分離技術，對高分子物質有較好的分離能力。分離的基本原理是分子篩效應。根據凝膠的種類和性質不同，分為交聯葡聚糖凝膠（sephadex），瓊脂糖凝膠（sepharose）［32］，丙烯葡聚糖凝膠（sepharcryl）等。根據多糖的性質和分子量范圍選擇適合的凝膠種類和型號。CristinaDeCastro課題組于2008年發(fā)表的文章中，采用sepharcrylS－500HR凝膠柱成功地從Rhizobiumrubi分離純化出一種新的莢膜多糖［33］。在2010年Gottschalk課題組通過乙醇沉淀法提取2型豬鏈球菌的莢膜多糖，然后通過使用sepharcrylS－400HR凝膠裝柱，對粗多糖進行分離純化，然后運用GC－MS技術得到2型豬鏈球菌莢膜多糖的單糖組成，結合質譜，核磁共振，以及相關化學反應，確定了2型豬鏈球菌莢膜多糖的結構［28］。該課題組在2013年又得到了14型豬鏈球菌莢膜多糖的結構［26］。

4．3．2離子交換色譜法離子交換色譜的基本原理是根據物質的酸堿性，極性的不同極性分離。運用離子交換色譜技術分離糖類，可以有效地去除酸堿成分和無機離子，從而得到糖和糖苷［30］。但是對于帶有唾液酸的多糖樣品，不宜使用強陰離子交換，唾液酸會發(fā)生嚴重脫離［34］。

5莢膜多糖的結構解析

莢膜多糖由于極性大，分子量高，結構復雜，多以復合物存在等原因，增加了結構解析的難度。分離純化度高會增大結構解析的成功率和準確性。結構解析一般分為以下幾個步驟，單糖組成分析，分子量確定［35］，糖殘基連接位置和順序、構型、分支點結構分析［36］。單糖組成分析方面，主要技術有高效液相色譜［37］，氣相色譜質譜聯用技術［38］，離子色譜技術［39］等。由于糖類物質沒有紫外吸收，可以通過柱前衍生化使其結合上有光學活性的基團，1－苯基－3－甲基－5－吡唑啉酮（PMP）是目前最常用的衍生化試劑，該反應條件溫和，操作簡便，衍生化效率高，適合復雜樣品的單糖組成［40］。中國海洋大學的趙峽課題組在2014年發(fā)表的文章中，使用PMP做柱前衍生化，成功得到豬鏈球菌4種血清型的單糖組成及其摩爾比例［25］。離子色譜技術在近些年逐漸被運用在糖化學研究中，2013年FionaL．Lin課題組通過運用離子色譜技術，準確的分析出肺炎鏈球菌33C和33D血清型的單糖組成［41］。糖殘基連接位置和順序方面，當前常見的分析手段有氣相色譜質譜聯用技術。通過對多糖依次進行甲基化反應，水解反應，還原反應和乙酰化反應，然后運用氣相色譜質譜聯用技術對糖殘基連接位置和順序進行確定。核磁共振技術為糖類物質的結構解析起推動作用，通過核磁共振圖譜分析可以推測出糖類物質中碳鏈的連接位置，構型等信息［42］，還可以進行樣品檢定［43］。BentO．Petersen課題組在2013年通過核磁共振技術成功解析了肺炎鏈球菌47A血清型的結構［44］。在2010年Gottschalk課題組運用GC－MS技術得到2型豬鏈球菌莢膜多糖的單糖組成，結合質譜，核磁共振，以及相關化學反應，確定了2型豬鏈球菌莢膜多糖的結構［28］。該課題組在2013年又得到了14型豬鏈球菌莢膜多糖的結構［26］。莢膜多糖的結構解析需要諸多分析技術的結合，譜圖解析工作難度仍然很大。

6多糖合成的相關基因和途徑

莢膜多糖合成的相關基因主要包含3種，即莢膜多糖合成調節(jié)基因，糖基轉移酶基因和轉運基因。以肺炎鏈球菌為例，其90個血清型的莢膜多糖合成的相關基因簇已經被測序并分析。除去3型和37型以外，其余的血清型的莢膜多糖合成的相關基因簇均位于染色體上dexB和aliA之間的一個完整的轉錄單位，具有位于上游位置高度保守的4個合成調節(jié)基因（cpsABCD），基因簇內包含多種糖基轉移酶，多糖合成酶，乙?；D移酶和翻轉酶等［15］。糖基轉移酶（GT）作為多糖生物合成的主要酶之一。多糖結構的多樣性取決于催化反應中的GT。GT催化轉糖基反應，即催化一個糖基供體上的糖殘基轉移到另一個受體上。糖基供體為糖核苷酸，而糖基受體可以是單糖、寡糖、多糖、多肽、蛋白質等物質［45］。根據糖基供體和生成的糖苷鍵的立體構型，GT分為保留型和反轉型［46］。由于GT的不同作用的結果，使多糖結構從組成到構型都存在巨大的多樣性。從基因研究角度，表明細菌多糖的生物合成途徑分為3種，wzy－依賴途徑，ABC轉運體－依賴途徑和合酶－依賴途徑［47］。以生物合成分為3個步驟，起始－延伸－連接終止。以上3種合成途徑主要根據延伸步驟進行劃分?；蛘{控酶進行多糖的生物合成。從多糖的多樣性，到多糖的合成調控，現階段仍暗含著尚不明確的步驟，有待進一步的研究。

7展望

莢膜多糖作為細菌的主要毒力因子，在研制疫苗方面有重要作用。肺炎鏈球菌23型多糖疫苗于1983年在美國批準并開始使用，在使用的過程中問題也隨之發(fā)生，該疫苗對成年人的效果較好，但是對嬰幼兒效果不好［48］。這使人們對莢膜多糖制備的疫苗有了新的思考。細菌莢膜多糖作為主要的毒力因子，研究人員對其結構組成，功能及基因已越來越重視［49］。高效地分離純化莢膜多糖對其結構解析至關重要，不斷改進原有分離技術和開發(fā)新型分離技術要齊頭并進，從而得到純化度更高的多糖樣品，增加結構解析的準確性。隨著對莢膜多糖研究的深入，進一步解析莢膜多糖結構以及合成基因與調節(jié)機制等方面［50］，會對莢膜多糖在疫苗研制和疾病治療中的作用有更加清晰的認識。在此基礎上，通過生物工程手段對細菌進行改造，使細菌的莢膜多糖向著有利于人類生存和應用的方向發(fā)展。

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