淺談microRNA在醫(yī)檢中的應(yīng)用
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MiRNA的檢測技術(shù)很多，既有傳統(tǒng)的Northernblotting技術(shù)、實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)和RNA芯片技術(shù)，也有最近發(fā)展起來的結(jié)合物理和化學(xué)方法建立的銀染增強(qiáng)放大技術(shù)、共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)、拉曼光譜分析技術(shù)和生物傳感技術(shù)等。
1Northernblotting技術(shù)
該技術(shù)是目前很可靠的檢驗(yàn)技術(shù)，但是所需要的樣品較多，檢測周期也比較長，其敏感性也不是很好。為此研究人員發(fā)展了LNA技術(shù)。LNA是一種類寡核酸的衍生物，使用其進(jìn)行雜交可顯著提高雜交的敏感性和雜交效率，大約是傳統(tǒng)雜交方法的10倍，而且并且僅用2h完成。［3］此外，，Pall等［4］采用了可溶性的碳化二亞胺來代替?zhèn)鹘y(tǒng)的紫外交聯(lián)法把miRNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜上，使檢測敏感度提高了25－50倍。通過以上這些改進(jìn)，Northernblotting技術(shù)將在很大程度上促進(jìn)miRNA檢測技術(shù)在臨床實(shí)驗(yàn)宅的順利開展。
2實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)
其是檢測miRNA最常用的技術(shù)?？捎糜跈z測各種組織中的miRNA表達(dá)以及表達(dá)量，包括血液、腫瘤組織以及其他病理組織等。Mitchell等使用經(jīng)典的Taq-Man熒光定量RT－PCR技術(shù)定量分析了健康志愿者血漿中的miR－15b、miR－16和miR-24。同時(shí)，他們還使用該方法定量測定了從前列腺癌血漿標(biāo)本中篩選出來的6個(gè)miRNA，結(jié)果顯示，miR-141在前列腺癌患者血漿中的表達(dá)量明顯升高(是健康人的46倍)，同時(shí)他們對(duì)miR-141的表達(dá)水平同PSA的水平進(jìn)行了相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)了二者存在一定程度上的相關(guān)性。［5］才外，肖丙秀等課題組使用通用引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，可以用一次RT產(chǎn)物用于檢測多種miRNA，很大程度上節(jié)省了寶貴的材料，也提高了檢測的效率，對(duì)于臨床分析有很高的參考價(jià)值。［6］
3miRNA芯片技術(shù)
這種技術(shù)包括微陣列芯片技術(shù)和微流體芯片技術(shù)。微陣列芯片技術(shù)是將大量的寡核苷酸以高度有序的微陣列的形式排列在某種固相支持物上從而檢測特定基因表達(dá)。優(yōu)點(diǎn)是可以一次就可以高通量的分析多個(gè)基因的表達(dá)情況，而且可以鑒別特意表達(dá)的基因。而微流體芯片技術(shù)是根據(jù)經(jīng)典的分離理論，也就是不同大小的分子其流動(dòng)性也不同。肖丙秀等課題組利用該技術(shù)初步鑒定出了一批在胃癌組織中高表達(dá)的miRNA：R-20b、miR-20a，miR-17、miR-106a，miR-18a，miR-21，miR-106b，miR-18b，miR-421、miR-340+、miR-19a和miR-65，為胃癌的診斷提供了有價(jià)值的參考資料。Tan等也利用該技術(shù)建立了腦卒中患者外周血miRNA的表達(dá)譜。此外采用該技術(shù)還可以實(shí)現(xiàn)對(duì)miRNA表達(dá)的絕對(duì)定量，具體方法為先測定標(biāo)本中所有miRNA的表達(dá)譜，然后挑選出若干不表達(dá)的miRNA，隨后在標(biāo)本中按照濃度梯度定量加入這些miRNA進(jìn)行水平雜交，最后再測定熒光強(qiáng)度，進(jìn)而繪出標(biāo)本中不同miRNA的熒光強(qiáng)度曲線，根據(jù)曲線確定其表達(dá)量。
為了使芯片技術(shù)更方便于開展標(biāo)準(zhǔn)化檢測和質(zhì)量控制，美國食品藥品監(jiān)督管理局在2005年展開了一項(xiàng)芯片質(zhì)量控制計(jì)劃，該計(jì)劃正致力于miRNA芯片檢測的標(biāo)準(zhǔn)化研究，這對(duì)該技術(shù)走向臨床領(lǐng)域有著重要的借鑒意義。最新發(fā)展起來的miRNA檢測技術(shù)中，共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)可以使用QDs做標(biāo)記物對(duì)生物大分子的活性沒有傷害，比較適于活細(xì)胞內(nèi)miRNA的分析。這里重點(diǎn)介紹下生物傳感器技術(shù)。目前在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，生物傳感器發(fā)揮著越來越重要的作用。生物傳感器是由生物識(shí)別部分和高度靈敏的信號(hào)傳感放大器件構(gòu)成。有很多的優(yōu)點(diǎn)，比如體積小、靈敏度高、成本低、檢測迅速和易于自動(dòng)化等。其中在核酸檢測中，生物識(shí)別部分主要是負(fù)責(zé)特異性結(jié)合待測核苷酸。近幾年來納米技術(shù)的引入大大提高了miRNA檢測的準(zhǔn)確性和靈敏性，這種方法迅速壯大。有希望成為臨床檢測各種疾病標(biāo)志物的有效方法。
作者：陳躍龍 單位：楚雄醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校