中職檢驗(yàn)專(zhuān)業(yè)白細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)教學(xué)

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摘要在運(yùn)用顯微鏡計(jì)數(shù)法進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，容易出現(xiàn)一些問(wèn)題，如技術(shù)誤差、固有誤差、儀器誤差等。經(jīng)過(guò)多年的教學(xué)總結(jié)和仔細(xì)分析，得出一些相應(yīng)的解決方法，以期共同探討。

關(guān)鍵詞中職檢驗(yàn)專(zhuān)業(yè)；白細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)；誤差

1引言

中職學(xué)校檢驗(yàn)專(zhuān)業(yè)學(xué)生在進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)中，容易出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)器材使用不當(dāng)、實(shí)驗(yàn)操作不規(guī)范或?qū)?shí)驗(yàn)理論知識(shí)不理解而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差甚至實(shí)驗(yàn)過(guò)程受阻等；另外，即使一位技術(shù)熟練者，使用同一儀器在對(duì)同一標(biāo)本進(jìn)行連續(xù)多次操作，檢測(cè)結(jié)果也常有一定差異。本文提出白細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)中容易出現(xiàn)的一些問(wèn)題即技術(shù)誤差、固有誤差以及儀器誤差等進(jìn)行分析探討且給出相應(yīng)的解決方法，以盡力避免學(xué)生在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)的錯(cuò)誤操作或無(wú)效操作，提高學(xué)生操作效率及能力，達(dá)到更好的教學(xué)效果。

2技術(shù)誤差

由于操作不正確或儀器不精確造成的誤差為技術(shù)誤差。這類(lèi)誤差通過(guò)主觀(guān)努力可以避免或降到最低程度[1]。采血部位不同結(jié)果產(chǎn)生偏差世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦采血部位以左手無(wú)名指或中指指尖的內(nèi)側(cè)為宜。在我國(guó)有些地方仍采用耳垂取血，耳垂部位痛感較輕且不易感染，但其血循環(huán)較差，受溫度變化影響較大，所以一般情況下采用手指部位取血。在學(xué)生實(shí)驗(yàn)操作時(shí)，筆者將30名學(xué)生同時(shí)采指血和耳垂血，分別進(jìn)行采血取樣進(jìn)行對(duì)照。計(jì)數(shù)結(jié)果是耳垂血白細(xì)胞數(shù)高于手指血白細(xì)胞數(shù)的為28例，約占93.3%，平均數(shù)值增高1.9×109/L。白細(xì)胞數(shù)目的多少可能與所在采血部位的血管深淺、粗細(xì)、血流速度、血液粘滯度等多種因素有關(guān)。耳垂白細(xì)胞計(jì)數(shù)偏高的主要原因可能是耳垂體積小散熱快，所處環(huán)境溫度低，血流慢，血液粘滯度大，白細(xì)胞易于沉積。手指則不然，手指活動(dòng)量大、體積大，溫度相對(duì)高，血流快，血液粘滯度小，白細(xì)胞不易沉積，所以這些可能是手指血白細(xì)胞計(jì)數(shù)偏低的主要原因[2]。計(jì)數(shù)板不清潔干燥1）計(jì)數(shù)板的清潔方法。血細(xì)胞計(jì)數(shù)板使用后，取下蓋玻片，用自來(lái)水沖洗，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免損壞網(wǎng)格刻度。洗后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干，也可用95%的乙醇、無(wú)水乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑脫水使其干燥。另外，計(jì)數(shù)板沖洗后,還要通過(guò)鏡檢觀(guān)察每小格內(nèi)是否殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈,則必須重復(fù)清洗直到干凈為止，干燥后方可放入盒內(nèi)保存或使用。2）計(jì)數(shù)板上殘存水滴，會(huì)使充液不均，還會(huì)造成混合液濃度降低[3]。解決方法：將計(jì)數(shù)板置于清潔環(huán)境，自然干燥或在空氣中快速揮動(dòng)，如急用也可輕輕甩掉計(jì)數(shù)板上水滴后再用濾紙片將殘存水分吸干。3）計(jì)數(shù)板上殘留纖維等雜質(zhì)影響鏡下觀(guān)察清晰度。解決方法：用流動(dòng)的清水洗凈計(jì)數(shù)板后再進(jìn)行上述具體操作。微量吸管使用不當(dāng)本實(shí)驗(yàn)采用一種改進(jìn)的微量吸管，屬于醫(yī)療器械技術(shù)領(lǐng)域。它由氣囊和與之管通的吸管一體構(gòu)成，氣囊與吸管管通一端的底部具有孔，吸管上標(biāo)有刻度，故可在采取樣液時(shí)利用指壓?jiǎn)㈤]其孔實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確性，該吸管具有造價(jià)低、精確度高、操作簡(jiǎn)便靈活的特點(diǎn)，又具有可作為一次性產(chǎn)品使用，能夠避免交叉感染等的優(yōu)點(diǎn)。1）微量吸管折斷。解決方法：微量吸管細(xì)長(zhǎng)易斷，在將其插入橡膠頭內(nèi)時(shí)，應(yīng)左手持橡膠頭（注意氣囊孔的控制），右手必須持住靠近微量吸管上端的部分輕輕操作，才能有效防止其折斷。2）微量吸管取樣混有氣泡。解決方法：取樣時(shí)，需將微量吸管末端完全浸入血樣末端，輕輕抽吸，才不會(huì)混入空氣。3）血樣進(jìn)入橡膠頭。解決方法：取樣前應(yīng)先捏緊橡膠頭，封閉氣孔，取樣時(shí)將橡膠頭慢慢地、一點(diǎn)一點(diǎn)地松開(kāi)，如果松開(kāi)速度過(guò)快或力度過(guò)大，就會(huì)發(fā)生上述現(xiàn)象[4]。取樣操作不規(guī)范以用一次性定量（20μl）微量吸管取末梢血為例，正確操作是：輕輕吸取末梢血到微量吸管第二個(gè)刻度線(xiàn)后再多取一點(diǎn)兒，此時(shí)右手捏穩(wěn)橡膠頭不動(dòng)，左手持干棉球置于微量吸管管尖部位，右手輕捏橡膠頭擠出管內(nèi)多余血樣至剛好到吸管第二個(gè)刻度線(xiàn)為止，此時(shí)再用左手的棉球?qū)⒐芗馔舛嘤嘌翰恋?。上述每一步驟缺一不可。充液不當(dāng)1）充液量過(guò)少造成充液缺損，過(guò)多則造成蓋玻片懸浮，細(xì)胞飄忽不定。2）充液時(shí)玻棒位置不正確，造成充液缺損或有氣泡。正確操作是：用玻棒蘸取適量混懸液后應(yīng)輕輕接觸蓋玻片一角，讓液體自動(dòng)進(jìn)入計(jì)數(shù)池并剛好充滿(mǎn)后立即移走玻棒。3）充液時(shí)間延遲。混懸液完成后應(yīng)立即充液觀(guān)察計(jì)數(shù)，有實(shí)驗(yàn)證明如果混懸液放置超過(guò)1.5分鐘以上在進(jìn)行充液計(jì)數(shù)操作，會(huì)使計(jì)數(shù)結(jié)果偏低[5]。白細(xì)胞在剛剛混勻的液體中均勻分布，而靜置超過(guò)1.5分鐘后白細(xì)胞會(huì)逐漸下沉，造成混懸液密度不均，在吸取上層液體充液進(jìn)行計(jì)數(shù)時(shí)會(huì)產(chǎn)生偏差[5]。低倍鏡下看不到計(jì)數(shù)池1）了解計(jì)數(shù)板的構(gòu)造。血球計(jì)數(shù)板是一塊特制的厚型載玻片，載玻片上有4個(gè)槽構(gòu)成3個(gè)平臺(tái)。中間的平臺(tái)較寬，其中間又被一短橫槽分隔成兩個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)，每個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)上面各刻有一方格網(wǎng)，每個(gè)方格網(wǎng)共分9個(gè)大方格，4個(gè)角的大方格作為白細(xì)胞計(jì)數(shù)用，每個(gè)大方格被單線(xiàn)劃分成16個(gè)中方格；最中央大方格被雙線(xiàn)劃分成25個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成16個(gè)小方格，供計(jì)數(shù)密度較大的紅細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)使用。每個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)由400個(gè)小方格組成，計(jì)數(shù)區(qū)邊長(zhǎng)為1mm，則計(jì)數(shù)區(qū)的面積為lmm2，每個(gè)小方格的面積為1/400mm2。蓋上蓋玻片后，計(jì)數(shù)區(qū)的高度為0.1mm，所以每個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)的體積為0.1mm3，每個(gè)小方格的體積為1/4000mm3。2）計(jì)數(shù)板放置位置不正確。計(jì)數(shù)板有上下兩個(gè)相同的計(jì)數(shù)池，應(yīng)將要觀(guān)察的、充好液的一側(cè)置于視野中央。3）光線(xiàn)過(guò)強(qiáng)。計(jì)數(shù)板放置好后，調(diào)整好焦距，如仍看不到計(jì)數(shù)池上的畫(huà)線(xiàn)，可能是光線(xiàn)過(guò)強(qiáng)的緣故，調(diào)整顯微鏡光圈或遮光鏡至視野較暗，再調(diào)整細(xì)準(zhǔn)焦螺旋至視野清晰即可看到計(jì)數(shù)池上的畫(huà)線(xiàn)[6]。辨別不出計(jì)數(shù)池4個(gè)角大方格的位置，解決方法如下。1）先找到計(jì)數(shù)池內(nèi)最中央的大方格，特點(diǎn)是橫線(xiàn)與豎線(xiàn)均為雙線(xiàn)劃分的含有25個(gè)中方格的大方格，也是線(xiàn)條最密集的大方格就是計(jì)數(shù)池內(nèi)最中央的大方格。2）以最中央大方格為標(biāo)的，分別沿上、下、左、右方向移動(dòng)計(jì)數(shù)板，找到外側(cè)兩邊為單線(xiàn)、內(nèi)側(cè)兩邊為雙線(xiàn)的含16個(gè)中方格的大方格即分別為四個(gè)角上的大方格。顯微鏡下將雜質(zhì)誤認(rèn)為白細(xì)胞1）粉塵顆粒。粉塵顆粒不具備細(xì)胞的基本形態(tài)，低倍鏡下白細(xì)胞呈圓形，細(xì)胞內(nèi)有深色的核，上下微調(diào)細(xì)準(zhǔn)焦螺旋白細(xì)胞具有折光性。2）氣泡。氣泡亦不具備細(xì)胞的基本形態(tài)，微調(diào)細(xì)準(zhǔn)焦螺旋時(shí)鏡下顯現(xiàn)為無(wú)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的空圈。漏數(shù)或重復(fù)計(jì)數(shù)1）每一個(gè)角上的大方格都被劃分為16個(gè)中方格，計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)以中方格為依據(jù)，按一定方向和順序計(jì)數(shù)，如從上到下、從左到右的順序。2）對(duì)壓線(xiàn)的白細(xì)胞應(yīng)采取數(shù)上不數(shù)下、數(shù)左不數(shù)右的原則。

3固有誤差

由于因每次白細(xì)胞分布不可能完全相同而造成的偏差叫固有誤差[1]。計(jì)數(shù)池內(nèi)細(xì)胞分布不均白細(xì)胞總數(shù)在正常參考范圍內(nèi)時(shí)，若每個(gè)大方格的白細(xì)胞數(shù)值相差8個(gè)以上視為細(xì)胞分布嚴(yán)重不均，可能是混合液密度不均或充液不當(dāng)，需輕輕搖勻混合液重新充液計(jì)數(shù)。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)研究白細(xì)胞在技術(shù)池內(nèi)的分布符合Poison分布。其變異系數(shù)CV=1/m½，m代表計(jì)數(shù)池重復(fù)計(jì)數(shù)的白細(xì)胞均數(shù)。通過(guò)上式可以得出m越大，CV越小，所以計(jì)數(shù)范圍越大，計(jì)數(shù)細(xì)胞越多，計(jì)數(shù)域誤差越小。常規(guī)考核標(biāo)準(zhǔn)學(xué)生計(jì)數(shù)完畢后，通常要用常規(guī)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)公式來(lái)評(píng)判實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否達(dá)標(biāo)，否則要重新采血充液計(jì)數(shù)。即：RCS=（4個(gè)大方格所數(shù)白細(xì)胞數(shù)最大值-最小值）／4個(gè)大方格所數(shù)白細(xì)胞平均數(shù)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：白細(xì)胞≤4×109/L時(shí)，RCS＜0.3白細(xì)胞=（4.1～14.9）×109/L時(shí)，RCS＜0.2白細(xì)胞≥15×109/L時(shí)，RCS＜0.15超過(guò)上述標(biāo)準(zhǔn)為不合格。

4儀器誤差

計(jì)數(shù)板的鑒定要求計(jì)數(shù)板的臺(tái)面光滑、透明，畫(huà)線(xiàn)清晰，計(jì)數(shù)池畫(huà)線(xiàn)面積準(zhǔn)確，必要時(shí)采用嚴(yán)格校正的目鏡測(cè)微計(jì)測(cè)量計(jì)數(shù)池的邊長(zhǎng)與底面積，用微米千分尺測(cè)量計(jì)數(shù)池的深度。美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)局（NBS）規(guī)定每個(gè)大方格邊長(zhǎng)的誤差應(yīng)小于1%，即1±0.01mm，深度誤差應(yīng)小于2%，即0.1±0.002mm。若超過(guò)上述標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)棄之不用。蓋玻片的標(biāo)準(zhǔn)蓋玻片應(yīng)平整、光滑、無(wú)裂痕，厚薄均勻一致，可使用卡尺多點(diǎn)測(cè)量（至少在9個(gè)點(diǎn)），不均勻度在0.002mm之內(nèi)，必要時(shí)采用平面平行儀進(jìn)行測(cè)量與評(píng)價(jià)，要求呈現(xiàn)密集平行的直線(xiàn)干涉條紋。最簡(jiǎn)單的評(píng)價(jià)方法是將潔凈的蓋片緊貼于干燥的平面玻璃上，若能吸附一定的時(shí)間不脫落，落下時(shí)呈弧線(xiàn)形旋轉(zhuǎn)，表示蓋片平整、厚薄均勻。同時(shí)，合格的蓋片放置在計(jì)數(shù)池表面后，與支持柱緊密接觸的部位可見(jiàn)到彩虹。精選出的蓋片與其他蓋片緊密重合后，在掠射光線(xiàn)下觀(guān)察，如見(jiàn)到完整平行的彩虹條紋表示另一枚蓋片質(zhì)量也達(dá)標(biāo)。如果蓋玻片不達(dá)標(biāo)勢(shì)必會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

5其他情況

白細(xì)胞總數(shù)過(guò)低計(jì)數(shù)完成后，白細(xì)胞總數(shù)過(guò)低者（＜3×109/L），可擴(kuò)大計(jì)數(shù)區(qū)域或重新加倍取血計(jì)數(shù)。白細(xì)胞總數(shù)過(guò)高對(duì)于白細(xì)胞總數(shù)過(guò)高者（＞15×109/L），可增加稀釋倍數(shù)重新計(jì)數(shù)，如若是外周血中有核紅細(xì)胞過(guò)多，必須再進(jìn)行白細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)，然后用校正公式予以校正除去。校正公式[1]：白細(xì)胞總數(shù)=校正前白細(xì)胞數(shù)×［100/（100+100個(gè)白細(xì)胞中的有核紅細(xì)胞數(shù)）］以上所述大致涵蓋了學(xué)生在白細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)中容易出現(xiàn)的問(wèn)題，若能有效克服,必定會(huì)大大增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。另外，熟能生巧，該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)初次完成后，建議再利用一些課時(shí)進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)的技能考試，強(qiáng)化規(guī)范操作，為日后進(jìn)行紅細(xì)胞計(jì)數(shù)及血小板計(jì)數(shù)等實(shí)驗(yàn)打下良好基礎(chǔ)。

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作者：王新華