動(dòng)物行為學(xué)分析精選(九篇)

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第1篇：動(dòng)物行為學(xué)分析范文

關(guān)鍵詞：帕金森病；大鼠；6-羥基多巴胺

帕金森?。≒D）是常見(jiàn)的中老年人中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其病因及發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚， 研究認(rèn)為可能與遺傳、環(huán)境因素、線粒體功能障礙、興奮性氨基酸、氧化應(yīng)激、過(guò)多的自由基形成及神經(jīng)生長(zhǎng)因子缺乏等有關(guān)，是多種機(jī)制協(xié)同作用的結(jié)果[1-2]。偏側(cè)6-OHDA損毀模型是目前使用最多的PD動(dòng)物模型之一，其在癥狀、病理、生化方面的表現(xiàn)與人類(lèi)PD有不少相似之處，但該模型的損傷程度因6-OHDA的劑量、濃度、注射位點(diǎn)不同而存有爭(zhēng)議，特別是對(duì)損傷早期大鼠行為學(xué)方面的觀察比較缺乏。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察6-OHDA損傷早期PD大鼠行為學(xué)及黑質(zhì)部位組織學(xué)的變化特點(diǎn)，驗(yàn)證損傷早期PD大鼠模型的穩(wěn)定性及可靠性。

1資料與方法

1.1一般資料 選用健康雄性SD大鼠40只， 體重 250～300 g，由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。6-OHDA、抗壞血酸干粉劑、鹽酸阿樸嗎啡（apomorphine）、抗酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase， TH）抗體均購(gòu)于Sigma公司。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 40只SD大鼠隨機(jī)分為三組：①空白對(duì)照組（n=8）；②6-OHDA模型組（n=24）：分為24 h組（n=8）、7 d組（n=8）和28 d組（n=8）3個(gè)亞組；③假手術(shù)組（n=8）。

1.2.2動(dòng)物模型 模型組大鼠用復(fù)合麻醉劑（含戊巴比妥鈉、丙二醇、硫酸鎂等，0.25 mL/100 g體重）腹腔注射麻醉，待大鼠后肢回縮反射及角膜反射消失后，將其頭部水平位固定在腦立體定位儀上，剪除顱頂鼠毛，碘酒、酒精消毒皮膚，沿中線切開(kāi)一長(zhǎng)約2cm切口，充分暴露前囟，參照Paxinos & Watson（1996）《大鼠腦立體定位圖譜》確定左側(cè)前腦內(nèi)側(cè)束（mfb）三維坐標(biāo)位置，選取mfb區(qū)坐標(biāo)：前囟后2.8 mm，中線左側(cè)2.0 mm，硬膜下8.2 mm。根據(jù)注射位點(diǎn)確定鉆顱部位，手術(shù)刀尖小心鉆開(kāi)一直徑約2 mm顱骨孔，微量進(jìn)樣器緩慢進(jìn)針至靶點(diǎn)，留針10 min，以9 ng/s的速度注入2 μg/μL 6-OHDA 4 μL（含0.02%抗壞血酸），注射完畢后留針5min，以1mm/min的速度退針。手術(shù)完畢，用明膠海綿堵塞顱骨孔，適量青霉素涂敷創(chuàng)口，消毒縫合皮膚，放回籠中飼養(yǎng)。并于24 h、7 d、28 d分別檢測(cè)大鼠行為學(xué)和組織學(xué)的改變。假手術(shù)組同法予含0.02%抗壞血酸的生理鹽水4 μL，空白對(duì)照組不作任何處理。

1.2.3行為學(xué)檢測(cè)

1.2.3.1跨步調(diào)節(jié)試驗(yàn)[3] 將大鼠身體的后半部分拖起 ，并使大鼠身體重量?jī)H由一側(cè)前肢支撐 ，記錄10s內(nèi)大鼠這一前肢走步次數(shù) ，然后同法檢測(cè)另一前肢的情況，以損傷對(duì)側(cè)前肢行走次數(shù)所占比例（損傷對(duì)側(cè)前肢行走次數(shù)/（損傷對(duì)側(cè)前肢行走次數(shù)+損傷側(cè)前肢行走次數(shù)））為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1.2.3.2姿勢(shì)不對(duì)稱(chēng)性試驗(yàn)[4] 握住鼠尾的中后部將其提起，懸空于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上方約10 cm處，使大鼠頭向下處于垂直狀態(tài)， 以其偏離垂直軸不超過(guò)10°為垂直位（標(biāo)準(zhǔn)位），記錄大鼠頭或上身左右擺動(dòng)的情況，以擺動(dòng)偏離垂直位并再返回到垂直位記數(shù)為1次。觀察45 s內(nèi)大鼠頭或身體轉(zhuǎn)動(dòng)的方向和次數(shù)，以向損傷對(duì)側(cè)擺動(dòng)的次數(shù)所占比例（損傷對(duì)側(cè)擺動(dòng)的次數(shù)/（損傷對(duì)側(cè)擺動(dòng)的次數(shù)+損傷側(cè)擺動(dòng)的次數(shù)））為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1.2.3.3阿撲嗎啡誘發(fā)旋轉(zhuǎn)試驗(yàn) 模型組分別于術(shù)后24 h、7 d、28 d于動(dòng)物腹腔內(nèi)注射阿撲嗎啡0.5 mg/Kg 誘發(fā)大鼠向右側(cè)（健側(cè)）旋轉(zhuǎn)，于阿撲嗎啡注射后5 min開(kāi)始記錄，持續(xù)記錄30 min。以24 h誘發(fā)旋轉(zhuǎn)次數(shù)210次/30 min為合格模型。

1.2.4組織學(xué)檢測(cè)

1.2.4.1動(dòng)物灌注、固定、取材、切片 各組大鼠在最后一次行為學(xué)檢測(cè)后，用復(fù)合麻醉劑麻醉，剪開(kāi)大鼠胸腔，經(jīng)主動(dòng)脈快速灌注生理鹽水（37℃）150～200 mL沖洗，至大鼠肝臟發(fā)白，流出液基本無(wú)色為止。隨即灌注4%甲醛（4℃）先快速灌注 200 mL，再緩慢灌注300 mL，至頭與四肢均已發(fā)硬。斷頭取腦，置于4%甲醛，放4℃冰箱固定4 h，再依次置入20%及30%蔗糖磷酸鹽緩沖液內(nèi)，存4℃冰箱至腦塊沉入瓶底。取中腦黑質(zhì)組織塊進(jìn)行冠狀連續(xù)冰凍切片，片厚20 μm。

1.2.4.2抗TH染色 作漂片SABC法染色，具體步驟依次為：冰凍切片用0.01 M（pH7.4）磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗3次，5 min/次。0.3% H2O2抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性， 0.02 mol/L EDTA（95℃）復(fù)性（2 min），非免疫的正常羊血清，室溫下孵育30 min，抗TH抗體（1∶1000，抗體稀釋液稀釋?zhuān)?7℃孵育4 h， SABC試劑，室溫下孵育1 h， DAB顯色（陽(yáng)性產(chǎn)物為棕黃色）。以上各步驟之間均以0.01M（PH7.4）PBS漂洗3次，5 min/次，正常羊血清與抗TH抗體孵育之間不漂洗。顯色后貼片，自然風(fēng)干，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。

1.2.4.3 TH陽(yáng)性神經(jīng)元記數(shù) 各組大鼠取包含黑質(zhì)致密部最明顯的中腦切片，在×100倍顯微鏡下計(jì)數(shù)兩側(cè)黑質(zhì)有完整細(xì)胞體的TH陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)算左側(cè)與右側(cè)黑質(zhì)TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的百分比（左側(cè)黑質(zhì)TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/右側(cè)黑質(zhì)TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)×100% ）。參照蔡文琴等[5]介紹的神經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)方法進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)結(jié)果均使用 SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。單因素方差分析進(jìn)行差異性檢驗(yàn)，P

2結(jié)果

2.1行為學(xué)觀察 對(duì)照組及假手術(shù)組大鼠經(jīng)阿撲嗎啡誘發(fā)后無(wú)旋轉(zhuǎn)行為，也未出現(xiàn)非藥物誘發(fā)的行為學(xué)改變。模型組大鼠在注射6-OHDA后數(shù)小時(shí)即出現(xiàn)損毀側(cè)肢體動(dòng)作減少，身體重心偏向損毀側(cè)，并出現(xiàn)身體向損毀側(cè)緩慢旋轉(zhuǎn)，不能進(jìn)行直線或隨意爬行。

2.1.1跨步調(diào)節(jié)試驗(yàn) 對(duì)照組及假手術(shù)組大鼠兩側(cè)前肢10 s內(nèi)跨步次數(shù)基本相同，模型組大鼠在左側(cè)前腦內(nèi)側(cè)束注射6-OHDA后24 h跨步調(diào)節(jié)試驗(yàn)評(píng)分出現(xiàn)有意義減少，7 d及28 d評(píng)分進(jìn)一步減少，見(jiàn)表1。

2.1.2姿勢(shì)不對(duì)稱(chēng)試驗(yàn) 在左側(cè)前腦內(nèi)側(cè)束注射6-OHDA后24 h，姿勢(shì)不對(duì)稱(chēng)試驗(yàn)結(jié)果顯示模型組大鼠頭部和身體出現(xiàn)向右側(cè)轉(zhuǎn)動(dòng)次數(shù)有意義增加，7 d及28 d姿勢(shì)不對(duì)稱(chēng)試驗(yàn)評(píng)分進(jìn)一步增加，對(duì)照組及假手術(shù)組大鼠頭部和身體向兩側(cè)轉(zhuǎn)動(dòng)次數(shù)大致相同，見(jiàn)表2。

2.1.3阿撲嗎啡誘發(fā)旋轉(zhuǎn)試驗(yàn) 在注射6-OHDA后24 h，阿撲嗎啡腹腔注射誘發(fā)大鼠以右側(cè)后肢為支點(diǎn)，首尾相接向右側(cè)旋轉(zhuǎn)，30 min旋轉(zhuǎn)次數(shù)210次/30 min，對(duì)照組及假手術(shù)組大鼠未誘發(fā)出旋轉(zhuǎn)行為，見(jiàn)表3。

2.2組織學(xué)檢測(cè) 抗TH染色結(jié)果顯示，在左側(cè)前腦內(nèi)側(cè)束注射6-OHDA后24 h，大鼠左側(cè)黑質(zhì)TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目出現(xiàn)有意義減少，高倍鏡下見(jiàn)少部分神經(jīng)元出現(xiàn)胞體腫脹、核膜界限消失等變性征象，部分神經(jīng)軸突斷裂、錯(cuò)亂；7 d和28 d時(shí)大鼠左側(cè)黑質(zhì)TH陽(yáng)性神經(jīng)元幾乎消失，殘留的TH神經(jīng)元表現(xiàn)出染色質(zhì)濃縮壞死現(xiàn)象，神經(jīng)軸突散在稀疏；模型組大鼠右側(cè)黑質(zhì)TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目同時(shí)也有部分減少；對(duì)照組及假手術(shù)組大鼠兩側(cè)黑質(zhì)TH陽(yáng)性神經(jīng)元無(wú)明顯改變，見(jiàn)表4，圖1。

3討論

研究PD需要建立穩(wěn)定可靠的模型。6-OHDA是一種選擇性中樞兒茶酚胺能神經(jīng)元毒性物質(zhì)，具有很強(qiáng)的呼吸鏈抑制作用，偏側(cè)6-OHDA損毀模型是目前使用最多的PD模型之一。1970年Ungerstedl[6]首先報(bào)道了應(yīng)用6-OHDA成功制備大鼠偏側(cè)PD模型，這種模型能夠在多巴胺能藥物的誘發(fā)下產(chǎn)生旋轉(zhuǎn)行為，以便于判斷模型成功與否。阿撲嗎啡是多巴胺（dopamine，DA）受體激動(dòng)劑，能夠引起該模型向健側(cè)旋轉(zhuǎn)，這是由于損傷側(cè)紋狀體多巴胺含量下降，多巴胺D2受體代償性大量增加，且敏感性增高，出現(xiàn)超敏現(xiàn)象[7]，此時(shí)應(yīng)用DA受體激動(dòng)劑使損傷側(cè)興奮作用占優(yōu)勢(shì)而產(chǎn)生向健側(cè)旋轉(zhuǎn)。

PD的神經(jīng)保護(hù)治療需要早期進(jìn)行，評(píng)估6-OHDA損傷早期大鼠行為學(xué)變化，可進(jìn)一步明確模型是否成功及神經(jīng)保護(hù)性治療是否有效。阿撲嗎啡誘發(fā)旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)結(jié)合非藥物誘發(fā)的行為學(xué)試驗(yàn)，其評(píng)估結(jié)果更加有效、可靠[8]。在偏側(cè)前腦內(nèi)側(cè)束注射6-OHDA后數(shù)小時(shí)，大鼠出現(xiàn)肢體動(dòng)作減少，身體重心偏向損毀側(cè)，并出現(xiàn)身體向損毀側(cè)不自主旋轉(zhuǎn)，不能進(jìn)行直線或隨意爬行，6-OHDA注射后24 h大鼠跨步調(diào)節(jié)試驗(yàn)和姿勢(shì)不對(duì)稱(chēng)試驗(yàn)出現(xiàn)有意義改變，腹腔注射阿撲嗎啡后可誘導(dǎo)大鼠在原地向健側(cè)旋轉(zhuǎn)，以健側(cè)后肢為支點(diǎn)，首尾相接，形成環(huán)狀，但旋轉(zhuǎn)次數(shù)

偏側(cè)前腦內(nèi)側(cè)束注射6-OHDA后24 h大鼠出現(xiàn)行為學(xué)和組織學(xué)方面的變化，為檢測(cè)模型的穩(wěn)定性和可靠性，實(shí)驗(yàn)設(shè)立6-OHDA損傷后7d和28d組。結(jié)果顯示：大鼠行為學(xué)改變較24 h組更加顯著，阿撲嗎啡誘發(fā)旋轉(zhuǎn)次數(shù)>210次/30 min，符合成功PD模型標(biāo)準(zhǔn)；7 d和28 d時(shí)大鼠左側(cè)黑質(zhì)TH陽(yáng)性神經(jīng)元減少90%。偏側(cè)前腦內(nèi)側(cè)束注射6-OHDA后，損傷對(duì)側(cè)有部分DA能神經(jīng)元丟失，可能與藥物的滲透作用或經(jīng)血液循環(huán)等有關(guān)。

綜上所述，通過(guò)早期行為學(xué)檢測(cè)，可為神經(jīng)保護(hù)性研究確立合格的PD模型，避免了藥物提前干預(yù)存在的藥物顯效與模型失敗之間的爭(zhēng)議。

參考文獻(xiàn)：

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第2篇：動(dòng)物行為學(xué)分析范文

關(guān)鍵詞：銀杏平顫方；MPTP；形態(tài)學(xué)；行為學(xué)；帕金森病；中藥

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：

1673-7717（2008）11-2348-04

Experimental Study on Treatment of Ginkgo Biloba Pingchan Recipe

and Its Diffrent Combination on the Behavioral Test and Morphology in the Model

Mouse with Parkinson Disease

ZHANG Jun1,LI Qianjun1,SHUN Hongmei1,BAI Limin1,QIU Tingjian3

（1.Guangzhou University of Chinese Medicie,Guangzhou 510120,Guangdong,China;2.Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China;3.Hulin Hospital of TCM,Hulin 158400,Heilongjiang,China）

Abstract：Objective：To investigate the effect and its mechanism of Chinese herb recipe in the treatment of PD，to measure the effect of Ginkgo Biloba Pingchan Recipe and its three similar prescriptions on the behavioral test and neurons in substantia nigra compacta（SNc）and striatum of model mouse for PD．Methods：The Parkinson’s disease model was established by consecutive administration of MPTP to C57／BL mice． The doses of Ginkgo Biloba Pingchan Recipe were respectively given for 2 weeks and 4 weeks in the treatment groups. Animals were examined behaviorally with the pole test consecutively. then killed，Taking out the forebrain and striate body were observed in morphology by HE.Results：(1)Ginkgo Biloba Pingchan Recipe(GBPR) and its three similar prescriptions improved the dyskinesia of PD mice and showed different disability in pole the test and decrease of spontaneous motor activity, the model group mice demonstrated dyskinesia, scores obtained from the behavioral test were increased significantly compared with Normal control group. While the scores in treatment groups showed a marked decrease to some degree (allP0.05).(2)GBPR and its three similar prescriptions protected neurons in SNc. The HE showed that, there were seldom neurons in SNc in model group;while there were much more neurons presented in the treatment groups than that in model group.Conclusion：Ginkgo Biloba Pingchan Recipe plays role in improving disability in pole test and increased spontaneous motor activity and in protection the neurons．

Keywords：Ginkgo Biloba Pingchan Recipe;MPTP;behavioral test;morphology;Parkinson’s disease；Chinese medicine

帕金森病又稱(chēng)震顫麻痹，是一種好發(fā)于中老年人[1]的多巴胺能神經(jīng)元功能降低引起的錐體外系慢性病，現(xiàn)在多數(shù)學(xué)者認(rèn)為與氧化應(yīng)激－自由基有關(guān)[2-3]。原發(fā)性帕金森病的主要臨床癥狀和體征為靜止性震顫、肌強(qiáng)直、少動(dòng)和障礙。有時(shí)可出現(xiàn)面目呆滯、發(fā)音低、書(shū)寫(xiě)字體過(guò)小、唾液增多、皮脂外溢、體溫增高、出汗增多、便秘、疲乏、手腳痙攣引起的疼痛、抑郁及情感方面改變等。延緩PD功能障礙的抗氧化治療有誘發(fā)精神障礙的副作用[4-5]。為了研究探討PD的發(fā)病因病機(jī)，建立了不同的動(dòng)物模型。以往的研究已證實(shí)MPTP小鼠模型的生物化學(xué)和組織化學(xué)特征均與臨床PD相似。因此，本實(shí)驗(yàn)采用以MPTP腹腔注射誘發(fā)PD小鼠模型，觀察PD小鼠行為學(xué)、病理學(xué)的變化，研究中藥銀杏平顫方及其拆方對(duì)PD小鼠行為及DA能神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，以探討其防治PD的機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物C57/BL6J小鼠，雄性，6～7周齡，體重（18±2）g，購(gòu)于北京維通利華公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物自由進(jìn)食飲水，動(dòng)物房12h光、暗交替，平均溫度22℃，相對(duì)濕度30%。

1.1.2主要儀器1510石蠟切片機(jī)：德國(guó)LETIZ公司。H-160萬(wàn)能研究顯微鏡：美國(guó)POLYVAR公司。Olympus BX5顯微鏡：日本Olympus株式會(huì)社。Image-pro Plus 5.0圖象分析系統(tǒng):日本Olympus株式會(huì)社。自制小鼠測(cè)試桿。

1.1.3化學(xué)試劑MPTP（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine）購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。

1.2方法

1.2.1中藥制備乙醇提取法獲得浸膏,溶于蒸餾水中，根據(jù)藥理學(xué)方法計(jì)算小鼠給藥量[6]，動(dòng)物用藥量根據(jù)成人6倍量計(jì)算，按照每次灌胃量0.5mL配制。0.1mPa滅菌15min，4℃保存?zhèn)溆?。每次腹腔注射MPTP前40min給小鼠灌胃。

1.2.2小鼠PD模型的建立參照Nobutaka Arai,Kazuaki Misugi的實(shí)驗(yàn)方法[7]，略加修改，小鼠造模前采用爬桿法[8]進(jìn)行篩選：動(dòng)物給藥前，先引導(dǎo)動(dòng)物在15s內(nèi)由桿頂爬至桿底，每只訓(xùn)練4次，訓(xùn)練完畢對(duì)其進(jìn)行測(cè)定，選用0分C57-BL/6J小鼠（評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1），用生理鹽水配制的0.3%MPTP（按30mg•kg-1•d-1）腹腔注射，連續(xù)5天。

1.2.3動(dòng)物分組及處理選取0分小鼠隨機(jī)分成6組,每組12只: ①正常對(duì)照組(簡(jiǎn)稱(chēng)正常組，Normal control，NC)：不作任何處理。②模型對(duì)照組(簡(jiǎn)稱(chēng)模型組，Model control，MC)：生理鹽水每天灌胃0.5mL/只。③銀杏平顫方全方治療組(簡(jiǎn)稱(chēng)全方組,Ginkgo Biloba Pingchan Recipe,G)：灌胃全方中藥每天約0.5mL/只(含生藥量1.18g/mL)。④清熱解毒方治療組(簡(jiǎn)稱(chēng)解毒組,Jiedu Recipe,J)：解毒中藥灌胃每天約0.5mL/只(含生藥量0.6g/mL)。⑤平肝熄風(fēng)方治療組(簡(jiǎn)稱(chēng)平肝組,Pinggan Recipe,P):平肝熄風(fēng)中藥灌胃每天約0.5mL/只(含生藥量0.6g/mL)。⑥化瘀通絡(luò)方治療組（簡(jiǎn)稱(chēng)化瘀組,Huayu Recipe,H）:化瘀通絡(luò)中藥灌胃每天約0.5mL/只(含生藥量0.6g/mL)。第②～⑥各組從造模第1天開(kāi)始灌胃，每次腹腔注射MPTP前40min給小鼠灌胃，各治療組給予相應(yīng)中藥灌胃，模型組給予生理鹽水灌胃。MPTP用生理鹽水配制，每日30mg/kg腹腔注射，1日1次，各組連續(xù)用藥5天。以上各組每日進(jìn)行2次爬桿試驗(yàn)并進(jìn)行評(píng)分，結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。動(dòng)物的存活期分別是造模開(kāi)始14天和28天。

1.2.4小鼠行為學(xué)測(cè)試爬桿實(shí)驗(yàn)：所用工具為一直徑13mm、高760mm的光滑不銹鋼桿，垂直豎立，將小鼠頭向下放置在金屬桿的頂部，使其沿桿自然爬下，觀察動(dòng)物在下行過(guò)程中的行為，并按標(biāo)準(zhǔn)計(jì)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)前每只小鼠爬桿2次，選用爬桿行為計(jì)分為0分的動(dòng)物用于實(shí)驗(yàn)，稱(chēng)重并隨機(jī)分組。所有動(dòng)物于注射MPTP前及末次注射后第1至第3周每日口服藥物前后，均進(jìn)行爬桿試驗(yàn)，每只鼠爬桿2次，積分并計(jì)算平均分，評(píng)分結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.5組織形態(tài)學(xué)觀察①取材及材料處理：動(dòng)物用10%的水合氯醛腹腔麻醉后，打開(kāi)胸腔，先經(jīng)左心室升主動(dòng)脈快速推注生理鹽水20mL，后緩緩?fù)谱?0%福爾馬林灌流固定，取腦、置于10%福爾馬林固定1周。腦組織經(jīng)常規(guī)步驟處理：脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，切片、片厚6μm，常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

②HE染色法：石蠟切片烤干，脫蠟，脫苯，Ehrlich氏蘇木精染，鹽酸酒精分化，藍(lán)化，伊紅染色，脫水，透明、中性樹(shù)脂封片。

③光鏡下觀察并攝片：根據(jù)小鼠腦立體定位圖譜，每組每只動(dòng)物選一張腳間核平面切片，取材部位見(jiàn)圖1。

2結(jié)果

2.1小鼠行為學(xué)改變

2.1.1注射MPTP后 各組小鼠行為表現(xiàn)各組給藥（MPTP）后10min小鼠都出現(xiàn)不同程度的肢體震顫，開(kāi)始前肢抬舉伴震顫，后肢僵硬，豎尾、豎毛及跳、躥等動(dòng)作，持續(xù)約30min后，又出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)障礙，動(dòng)作遲緩，短暫性活動(dòng)減少，對(duì)外界刺激易產(chǎn)生尖叫，逃避反應(yīng)慢；注射MPTP后1h，小鼠表現(xiàn)明顯的運(yùn)動(dòng)減少，對(duì)外界刺激反應(yīng)低下，之后逐漸恢復(fù)。但各組動(dòng)物癥狀都于24h后完全消失。隨著用藥時(shí)間延長(zhǎng)，動(dòng)物運(yùn)動(dòng)障礙程度增加，癥狀持續(xù)時(shí)間和恢復(fù)時(shí)間延長(zhǎng)。中藥全方組和拆方各組均可不同程度改善PD小鼠出現(xiàn)的爬桿能力下降、時(shí)間延長(zhǎng)和自發(fā)活動(dòng)次數(shù)減少等上述小鼠行為學(xué)異常與模型組比較有顯著性差異（P均

2.1.2中藥銀杏平顫方及其拆方對(duì)PD小鼠爬桿行為的影響正常組小鼠在給予生理鹽水前后，爬桿測(cè)試無(wú)明顯差異。MPTP 30mg•kg-1•d-1腹腔注射后當(dāng)日及以后幾天，協(xié)調(diào)能力明顯降低，表現(xiàn)為快速下滑，甚至不能抱桿、墜落，持續(xù)4日后，于第5日末次注射MPTP后小鼠協(xié)調(diào)能力逐漸恢復(fù)，模型對(duì)照組1～4周評(píng)分結(jié)果與正常對(duì)照組相比升高且均有顯著性差異（P

2.2病理學(xué)改變

2.2.1肉眼觀察全部小鼠腦標(biāo)本外觀均未見(jiàn)明顯異常，切面檢查亦未見(jiàn)出血、壞死和軟化灶。

2.2.2HE染色光鏡觀察正常組14天、28天腦黑質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)正常，體積正常，結(jié)構(gòu)清晰，密集成群。模型組14天、28天小鼠腦黑質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量明顯減少，部分神經(jīng)元喪失，殘留神經(jīng)元呈大多角形或錐體形狀，有的胞體變小，胞核固縮，胞核結(jié)構(gòu)不清，有的胞核變大，核染色質(zhì)疏松，有顆粒出現(xiàn)，核周?chē)麧{有溶解樣改變；胞漿染色加深，胞漿內(nèi)可見(jiàn)大小不等的嗜酸性顆粒并出現(xiàn)小空泡。大部分小鼠黑質(zhì)區(qū)域內(nèi)尚可見(jiàn)廣泛的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，部分淋巴細(xì)胞圍繞在血管周?chē)纬裳芴?。殘存的神?jīng)元體積瘦小，結(jié)構(gòu)不清晰，色素變淺，同時(shí)伴輕度膠質(zhì)細(xì)胞增生；與模型組14天和28天比較，銀杏平顫方全方及拆方各組14天和28天小鼠腦黑質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量明顯增多，神經(jīng)元體積較飽滿，結(jié)構(gòu)較清晰；各中藥治療組14天黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元形態(tài)與28天各組相比基本相似，黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元數(shù)量未見(jiàn)明顯減少，但有少數(shù)神經(jīng)元變性，細(xì)胞呈圓形或卵圓形，胞漿內(nèi)未見(jiàn)嗜酸性顆粒出現(xiàn)。但總的看來(lái)中藥各治療組與正常對(duì)照組比較神經(jīng)細(xì)胞未見(jiàn)明顯減少，無(wú)特異性改變；有的可見(jiàn)星形細(xì)胞輕度增多，胞核變大，偶見(jiàn)核分裂現(xiàn)象。解毒組28天2例黑質(zhì)區(qū)有散在軟化灶形成，病灶較小，灶內(nèi)大多數(shù)神經(jīng)元消失，殘留的神經(jīng)元胞體變小，胞核固縮。部分小鼠黑質(zhì)區(qū)可見(jiàn)彌漫性淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，偶見(jiàn)淋巴細(xì)胞圍繞在小血管周?chē)⑽葱纬裳芴住?/p>

3討論

3.1模型的建立和銀杏平顫方對(duì)PD模型小鼠行為學(xué)改善的作用

帕金森病又稱(chēng)震顫麻痹，臨床以肢體震顫、木僵為典型癥狀，是一種好發(fā)于老年人的多巴胺能神經(jīng)元功能降低引起的錐體外系慢性病，同老年癡呆一樣是與衰老相關(guān)的神經(jīng)退行性病。目前認(rèn)為其腦內(nèi)黑質(zhì)紋狀體的多巴胺能和膽堿能神經(jīng)功能平和失調(diào)是運(yùn)動(dòng)障礙的主要原因，凡引起前者功能降低或后者功能亢進(jìn)的因素均可以導(dǎo)致震顫。帕金森病人的行為變化為運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力降低，在本實(shí)驗(yàn)中，用爬桿實(shí)驗(yàn)作為測(cè)定動(dòng)物協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)能力的指標(biāo)。模型組小鼠協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)能力明顯降低，并且這種行為異?？沙掷m(xù)數(shù)日，與正常組有顯著性差異，這一結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

現(xiàn)在世界公認(rèn)的兩種帕金森病模型藥物是6－羥基多巴（6-Hydrooxydopamine, 6-OHDA）和MPTP，6-OHDA是一種神經(jīng)毒素，大鼠單側(cè)紋狀體注射微量的6－OHDA，能夠造成多巴胺能神經(jīng)元壞死，經(jīng)阿樸嗎啡誘導(dǎo)，動(dòng)物可出現(xiàn)向健側(cè)旋轉(zhuǎn)的現(xiàn)象[9－10]，6-OHDA模型存在造模周期長(zhǎng)、成功率低、癥狀不典型等問(wèn)題，限制了它的應(yīng)用。

MPTP是哌替啶的衍生物，可由腦中單胺氧化酶B催化生成MPP+，后者是一種選擇性的神經(jīng)毒素，可以損害人類(lèi)和靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物腦中黑質(zhì)中的多巴胺能神經(jīng)元，MPTP最初發(fā)現(xiàn)于吸毒患者的腦內(nèi)，經(jīng)分離獲得該化合物，注射到猴體內(nèi)可引起酷似臨床震顫麻痹患者的幾乎全部癥狀，并且嚴(yán)重程度與所用劑量和動(dòng)物年齡成正比。最初認(rèn)為嚙齒類(lèi)動(dòng)物對(duì)MPTP的毒性不敏感，后來(lái)發(fā)現(xiàn)接受MPTP注射可能導(dǎo)致該動(dòng)物出現(xiàn)震顫，但是種屬差異很大，大鼠由于腦內(nèi)MAO-B的活性或水平較低，MPTP不能被代謝成活性產(chǎn)物，因而大鼠對(duì)MPTP的毒性不敏感。MPTP注射給藥可引起小鼠震顫，特別是C57／BL、BABC等，對(duì)注射MPTP產(chǎn)生的毒性極敏感， MPTP引起的小鼠行為學(xué)異常雖不像在靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物上的癥狀典型，但造模周期短、重復(fù)性好，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物費(fèi)用低，可引起腦內(nèi)黑質(zhì)紋狀體的多巴胺含量降低，因此，MPTP小鼠模型被國(guó)外許多實(shí)驗(yàn)室廣泛采用，這種模型為研究帕金森病的發(fā)病機(jī)理和藥物治療提供了條件[11-12]。

MPTP確可引起小鼠的行為異常，但其引起的小鼠行為變化，因采用的注射劑量、注射次數(shù)、注射途徑的不同以及所采用的行為觀察方法的不同而有所不同[13-16]。本實(shí)驗(yàn)采用的是最大劑量和最常用的注射途徑，為縮短實(shí)驗(yàn)周期采用5次注射，得到比較明顯的運(yùn)動(dòng)能力降低的效用。為了檢查PD小鼠的協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)能力，本實(shí)驗(yàn)選用爬桿試驗(yàn)，即讓小鼠頭向下倒豎于垂直的金屬桿頂部，待其四肢握緊桿后，松手任其自由下行，此實(shí)驗(yàn)中，動(dòng)物被動(dòng)地下行，當(dāng)協(xié)調(diào)能力降低時(shí)，行為發(fā)生明顯改變。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， MPTP注射后，小鼠爬桿能力降低，并且這種行為異?？沙掷m(xù)幾日，以后逐漸恢復(fù)，這一結(jié)果與文獻(xiàn)使用自主活動(dòng)法觀察的結(jié)果一致，采用此方法觀察得到的銀杏平顫方及其拆方對(duì)MPTP所致小鼠運(yùn)動(dòng)能力降低的改善作用這一結(jié)論是可靠的。

3.2銀杏平顫方對(duì)PD小鼠DA神經(jīng)元形態(tài)的影響

很多實(shí)驗(yàn)證實(shí)，MPTP對(duì)黑質(zhì)DA能神經(jīng)元具有選擇性神經(jīng)毒作用，其致病的過(guò)程是MPTP進(jìn)入體內(nèi)首先穿過(guò)血腦屏障，被星形膠質(zhì)細(xì)胞、5－羥色胺能神經(jīng)元攝取并在單胺氧化酶 B迅速催化下生成吡啶類(lèi)代謝產(chǎn)物甲基－苯基吡啶離子（MPP+），MPP+與 DA的化學(xué)結(jié)構(gòu)極為相似，故可以被DA轉(zhuǎn)運(yùn)體（DAT）識(shí)別并載入DA能神經(jīng)元內(nèi)，然后通過(guò)線粒體外膜上能量依賴(lài)性轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制進(jìn)入線粒體集中起來(lái)，之后阻斷線粒體NADH氧化呼吸鏈，最終造成ATP衰竭和細(xì)胞死亡[17]，故直接損害DA能神經(jīng)元的是MPP+。因MPP+和鐵離子一樣與神經(jīng)黑色素有很高的親合性，而黑質(zhì)DA能神經(jīng)元含有較高濃度的神經(jīng)黑色素，所以 MPP+選擇性地?fù)p傷了SNpc的 DA能神經(jīng)元，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)其它部位的DA能神經(jīng)元，如腹側(cè)被蓋區(qū)DA能神經(jīng)元損傷則很小[18]。筆者在HE染色和TH免疫組化染色實(shí)驗(yàn)中也得到同樣結(jié)果。DA合成限速酶TH與PD的關(guān)系很早就受到了普遍關(guān)注。TH已經(jīng)成為DA神經(jīng)元的標(biāo)志酶。大量研究證明，PD動(dòng)物模型及PD病人體內(nèi)TH從基因表達(dá)、酶蛋白含量及分布到酶活性都存在廣泛的異常改變，筆者的另一實(shí)驗(yàn)觀察了各組小鼠中腦TH陽(yáng)性黑質(zhì)神經(jīng)元，結(jié)果顯示：模型組小鼠中腦SNpc內(nèi)TH免疫組化觀察到大量DA能神經(jīng)元脫失，因而經(jīng)黑質(zhì)－紋狀體通路投射到紋狀體的DA神經(jīng)遞質(zhì)減少，從而引起小鼠多巴胺和乙酰膽堿系統(tǒng)平衡失調(diào)而產(chǎn)生行為學(xué)障礙；HE染色結(jié)果與銀杏平顫方全方及拆方各組小鼠行為改變成正比，而且黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元的變性、退化及壞死程度較模型組均明顯改善，僅個(gè)別小鼠有輕微的軟化灶形成。HE染色和TH免疫組化染色結(jié)果相吻合，這表明中藥可減少多巴胺神經(jīng)元的丟失、增加多巴胺神經(jīng)元內(nèi)TH的表達(dá)，各組中藥在不同的時(shí)間療效各不相同，就減少多巴胺神經(jīng)元丟失的數(shù)量而言，在14天以解毒組最明顯，28天以全方組最明顯；就增加TH的表達(dá)而言，14天全方組和解毒組較明顯，28天化瘀組較明顯。這些變化說(shuō)明中藥銀杏平顫方全方及拆方能使黑質(zhì)神經(jīng)元的損傷程度減輕，結(jié)構(gòu)和功能接近正常，進(jìn)一步從形態(tài)學(xué)方面證實(shí)了銀杏平顫方全方及拆方可保護(hù)神經(jīng)組織免受MPTP引起的自由基增多及氧化損傷所造成的損害，從而為PD的防治提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。

以上結(jié)果從行為學(xué)和神經(jīng)病理角度分別證明了模型成功。停藥后小鼠行為恢復(fù)較快與腦內(nèi)的表現(xiàn)不太相符，這與其他學(xué)者的報(bào)道一致[19]，具體機(jī)制尚不清楚。中藥各給藥組（14天，28天）小鼠行為障礙有明顯恢復(fù)、TH免疫組化顯示SNpc內(nèi)DA能神經(jīng)元數(shù)目較模型組明顯增多，且全方組和化瘀組更為明顯一些。這些結(jié)果提示銀杏平顫方及其拆方能改善PD小鼠的行為障礙、對(duì)DA能神經(jīng)元的正常形態(tài)及功能有保護(hù)作用。銀杏平顫方及其拆方28天組治療效果稍好一些，但與14天各組相比兩者之間的差別并不很大，一方面提示銀杏平顫方及其拆方對(duì)PD的治療可能存在一定的量效和時(shí)效關(guān)系，同時(shí)也說(shuō)明在短時(shí)間內(nèi)銀杏平顫方及其拆方即可達(dá)到滿意的治療效果。

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第3篇：動(dòng)物行為學(xué)分析范文

關(guān)鍵詞：膠質(zhì)細(xì)胞；丙戊茶堿；疼痛

現(xiàn)在大量研究表明，以往認(rèn)為只有神經(jīng)元參與了疼痛的產(chǎn)生和維持的觀點(diǎn)是不完全正確的。在許多不同病因所致的疼痛中，膠質(zhì)細(xì)胞的激活很可能是一個(gè)共同的作用機(jī)制。膠質(zhì)細(xì)胞，特別是星形膠質(zhì)細(xì)胞可以通過(guò)多種途徑參與疼痛的調(diào)節(jié)，激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞可以產(chǎn)生大量的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，如NGF、BDNF和GDNF等，NGF和BDNF均可促進(jìn)神經(jīng)損傷后的出芽、傷害性感受器的再生，而NGF拮抗劑可在一定程度上減輕動(dòng)物模型中的炎性痛[1]，這表明膠質(zhì)細(xì)胞在損傷后釋放的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子參與疼痛的調(diào)節(jié)。膠質(zhì)細(xì)胞表面表達(dá)有大量的和疼痛有關(guān)的細(xì)菌和病毒受體，以及大量神經(jīng)遞質(zhì)和調(diào)質(zhì)如GABA、Glu、ACh、5-HT等受體，鞘內(nèi)注入細(xì)菌、病毒、神經(jīng)遞質(zhì)和調(diào)質(zhì)可以致痛[2]。此外，膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于神經(jīng)元數(shù)量，并且與神經(jīng)元的解剖位置關(guān)系緊密，它們通過(guò)多種機(jī)制調(diào)節(jié)神經(jīng)元的突觸功能和興奮性，在痛覺(jué)產(chǎn)生調(diào)節(jié)過(guò)程中具有重要的功能。

丙戊茶堿（PPF），一種甲基黃嘌呤的衍生物，是星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化抑制劑[3]，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)側(cè)腦室注射星形膠質(zhì)細(xì)胞活化抑制劑PPF探討膠質(zhì)細(xì)胞在疼痛中的作用，希望為新的鎮(zhèn)痛藥物的研究和開(kāi)發(fā)提供全新的思路。

1資料與方法

1.1一般資料 健康雄性成年SD大鼠，體重（250±10）g，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，所有動(dòng)物都在自然光暗周期的環(huán)境中飼養(yǎng)，自由覓食、飲水。

動(dòng)物隨機(jī)分為兩組（n=8）：正常對(duì)照組和丙戊茶堿組。對(duì)照組側(cè)腦室注射生理鹽水（10μl）；丙戊茶堿組側(cè)腦室注射丙戊茶堿（30mM，10μl）。側(cè)腦室注射后飼養(yǎng)1w進(jìn)行痛評(píng)分實(shí)驗(yàn)。

1.2福爾馬林致痛模型 把大鼠放入觀察臺(tái)上透明玻璃器皿中，下鋪有干燥、松軟的厚布，在安靜、避光、干燥的環(huán)境中，適應(yīng)30 min，用100μl微量注射器刺入右足跖部皮下，回吸無(wú)血迅速注入5%福爾馬林100μl。

1.3側(cè)腦室注射 用1%戊巴比妥鈉40～50 mg/kg麻醉大鼠，然后將麻醉的大鼠固定在腦立體定位儀（ST-3ND，成都儀器廠）上，顱骨，根據(jù)Paxinos and Watson圖譜定位側(cè)腦室位置（坐標(biāo)：P1.2 mm，R1.5-2 mm，H3.0 mm），用大鼠顱骨鉆鉆孔，用10μl微量注射器將藥物注入到側(cè)腦室，留針5min，然后縫合皮膚。飼養(yǎng)一星期后進(jìn)行痛評(píng)分實(shí)驗(yàn)。

1.4痛評(píng)分實(shí)驗(yàn) 側(cè)腦室給藥1w后，在大鼠右足跖部皮下注射福爾馬林。根據(jù)Dudisson評(píng)分對(duì)大鼠右后足的行為進(jìn)行評(píng)估，指標(biāo)包括：第一部分為抬起注射甲醛足的次數(shù)（Flinches），第二部分為甲醛足抬起走動(dòng)時(shí)不著臺(tái)面的時(shí)間（Lifting）和舔、咬、抖動(dòng)甲醛足的時(shí)間（Biting）。福爾馬林試驗(yàn)數(shù)據(jù)采取參照Abbott等方法，分別測(cè)定注射福爾馬林后第一時(shí)相（第0～5min）及第二時(shí)相（第15～30min）內(nèi)的Flinches誘發(fā)炎性痛行為的次數(shù)、Lifting與Biting行為痛持續(xù)的時(shí)間總和[4]。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS12.0軟件包，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用采用單因素方差分析（ANOVA），組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)方法。

2結(jié)果

側(cè)腦室注射藥物大鼠的疼痛行為學(xué)評(píng)分：第一時(shí)相丙戊茶堿組的Flinches次數(shù)和Lifting+Biting時(shí)間較對(duì)照組均有顯著性差異（P

丙戊茶堿組Flinches與對(duì)照組比較*P

3討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，各組大鼠腳底注射福爾馬林后，觀察到大鼠出現(xiàn)抬腳、舔足等行為學(xué)反應(yīng)，可見(jiàn)本實(shí)驗(yàn)福爾馬林疼痛模型得到了成功復(fù)制。福爾馬林致痛模型產(chǎn)生的行為學(xué)反應(yīng)是雙相的[4]。雙相疼痛第一時(shí)相是由于福爾馬林對(duì)局部感受傷害的感受器的化學(xué)刺激所引起的；第二時(shí)相是由于局部炎癥以及傷害性刺激產(chǎn)生炎癥致痛物質(zhì)，通過(guò)持續(xù)的C纖維刺激使腰骶部脊髓中樞致敏所致。表現(xiàn)為脊髓背角神經(jīng)的過(guò)度興奮：如神經(jīng)元的反應(yīng)閾值下降，興奮期延長(zhǎng)以及自發(fā)性放電等[5]。

側(cè)腦室注射實(shí)驗(yàn)顯示，丙戊茶堿在疼痛模型的第二時(shí)相均起到抑制疼痛的作用，而第二時(shí)相是痛覺(jué)中樞致敏有關(guān)。文獻(xiàn)顯示，丙戊茶堿可抑制膠質(zhì)細(xì)胞活化而產(chǎn)生抗傷害性刺激作用[6]。它抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞機(jī)制可能通過(guò)抑制分解環(huán)磷酸腺苷的磷酸二酯酶亞型Ⅳ，從而增加細(xì)胞內(nèi)的環(huán)磷酸腺苷來(lái)發(fā)揮作用[6]。推測(cè)丙戊茶堿通過(guò)抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)起到抗炎性痛的作用。可見(jiàn)，膠質(zhì)細(xì)胞活化、表達(dá)及信息交流與炎癥性疼痛的產(chǎn)生和維持關(guān)系緊密。

綜上所述，膠質(zhì)細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)性炎性痛的發(fā)生和維持中起到關(guān)鍵作用，但其具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

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第4篇：動(dòng)物行為學(xué)分析范文

【關(guān)鍵詞】 帕金森?。谎装Y；環(huán)氧合酶2；前列腺素e2；核因子nfκb；人參皂甙rg1

0引言

帕金森病(parkinsons disease，pd)是一種常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病. 有研究［1］認(rèn)為,炎癥可能在pd發(fā)病過(guò)程中起重要作用, 環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase2，cox2)及其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可能參與pd發(fā)病過(guò)程［2］. 核因子(nuclear factorκappab, nfκb)在炎癥反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，近期的研究顯示nfκb的激活與pd發(fā)病有關(guān)［3］. 但有關(guān)nfκb是否參與pd模型中cox2表達(dá)調(diào)控的報(bào)道少見(jiàn). 本研究采用1甲基4苯基1,2,3,6四氫吡啶（1methyl4phenyl1, 2, 3, 6tetrahydropyridine,mptp）制備亞急性pd模型,觀察模型動(dòng)物中腦黑質(zhì)nfκb和cox2及其產(chǎn)物前列腺素e2（prostaglandine2，pge2）表達(dá)與小鼠黑質(zhì)區(qū)酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，th)陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量關(guān)系及給予人參皂甙rg1后對(duì)上述變化的影響,探討nfκb在pd發(fā)病過(guò)程中的分子機(jī)制，為探索pd有效防治措施提供線索.

1材料和方法

1.1材料健康雄性c57bl/6n小鼠45只，8~12 wk齡，體質(zhì)量25~30 g［北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司scxx(京)20020003］,小鼠均自由進(jìn)食飲水,室溫（25±2）℃，單籠喂養(yǎng)，自然光照. mptp(美國(guó)sigma公司)；兔抗人pge2 mab(美國(guó)cayman公司)；小鼠抗人th mab(美國(guó)chemicon公司)；人參皂甙rg1（吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院化學(xué)教研中心）；兔抗人cox2 mab,兔抗人nfκb（p50）多克隆抗體, 濃縮型免疫組織化學(xué)超敏ultrasensitivetmsp試劑盒(福州邁新生物).

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組和模型制備實(shí)驗(yàn)隨機(jī)將小鼠分為3組，每組15只. 模型組(pd組)：給予mptp 30 mg/kg,鹽水溶，腹腔注射,1次/d,連續(xù)5 d. 人參皂甙rg1干預(yù)組 (rg1組)：除給予pd組相同的mptp處理外,mptp注射前3 d定時(shí)給予人參皂甙rg1 10 mg/kg,鹽水溶，腹腔注射，并在mptp注射前2 h注射人參皂甙rg1. 溶劑組（對(duì)照組）：注射與pd組和rg1組等體積的鹽水. 上述動(dòng)物均于mptp第5次注射后24 h處死. 于每次注射藥物后觀察小鼠是否出現(xiàn)靜止震顫、肌肉僵直、運(yùn)動(dòng)遲緩等pd行為學(xué)表現(xiàn), 判斷pd鼠模型是否成功.

1.2.2免疫組織化學(xué)檢測(cè)小鼠麻醉后,行40 g/l多聚甲醛磷酸鹽緩沖液常規(guī)灌注固定,迅速開(kāi)顱取腦,40 g/l多聚甲醛固定48 h(4℃)后,石蠟包埋切片. 實(shí)驗(yàn)時(shí)取腦組織切片常規(guī)脫蠟至水后,用tbst(ph7.4±0.2) 洗滌；組織抗原行水浴法熱修復(fù)；30 ml/l過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源過(guò)氧化物酶,正常非免疫動(dòng)物血清室溫孵育10 min；同一組織相鄰切片分別加入一抗即兔抗人cox2 mab(1∶100)、兔抗人pge2 mab（1∶300）、兔抗人nfκb（p50）多克隆抗體（1∶100）、小鼠抗人th mab(1∶400), 4℃過(guò)夜；tbst洗滌后,加入生物素標(biāo)記第二抗體室溫孵育；tbst洗滌,加入鏈霉素抗生物素蛋白過(guò)氧化酶室溫孵育20 min,dab顯色,中性樹(shù)膠封固,光鏡下觀察照相.

1.2.3western blot小鼠麻醉后取腦,分離中腦黑質(zhì)部分,置入細(xì)胞裂解液中,低溫勻漿,4℃震蕩30 min后,12 000 g 4℃離心15 min,取上清,-80℃保存?zhèn)溆? 實(shí)驗(yàn)時(shí)取標(biāo)本蛋白定量后加入4倍體積樣本緩沖液,95℃變性5 min. 取20 μg樣品在100 g/l十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（sdspage）上電泳后,電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜,以標(biāo)準(zhǔn)蛋白marker為參照，依m(xù)r大小切取條帶,取相應(yīng)條帶分別加入cox2一抗(1∶400)，pge2 一抗（1∶600），nfκb（p50）一抗（1∶200）和th一抗(1∶1000), 4℃過(guò)夜,tbst沖洗后,分別與生物素標(biāo)記的羊抗兔/小鼠igg抗血清(1∶200)室溫震蕩孵育2 h,tbst洗滌后,與卵白素辣根過(guò)氧化物酶復(fù)合物室溫下孵育0.5 h, dab顯色. 將特異性蛋白條帶掃描后,在同一條件下應(yīng)用cmias真彩醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)測(cè)定條帶平均灰度值.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:選定黑質(zhì)所在區(qū)域,采用cmias真彩色醫(yī)學(xué)圖像免疫組化自動(dòng)分析系統(tǒng)進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù). 各組每只動(dòng)物的3張腦片數(shù)值相加后取平均值,實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用spss11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析. 組間比較采用單因素方差分析和snkq檢驗(yàn)，兩變量間關(guān)系分析采用簡(jiǎn)單線性相關(guān)分析法. p<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2結(jié)果

2.1行為學(xué)觀察pd組小鼠于第1次注藥后10~ 20 min均出現(xiàn)不同程度的震顫、豎毛、翹尾,mptp第5次注射后,pd組小鼠出現(xiàn)步態(tài)蹣跚、活動(dòng)減少、動(dòng)作變慢等癥狀；對(duì)照組未出現(xiàn)上述行為學(xué)變化；rg1組與pd組相比較，上述行為學(xué)癥狀明顯減輕.

2.2免疫組化檢測(cè)

2.2.1黑質(zhì)區(qū)th陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量變化對(duì)照組黑質(zhì)致密部可見(jiàn)大量的th陽(yáng)性神經(jīng)元,且排列整齊,呈條帶狀(圖1a)；pd組（57.2±12.1）與對(duì)照組（169.7±24.6）相比較,th陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)目減少約60%(圖1b),rg1組（145.8±28.4）th陽(yáng)性神經(jīng)元的缺失較pd組明顯為輕,僅較對(duì)照組減少約32%(圖1c).

2.2.2黑質(zhì)區(qū)cox2，pge2和nfκb陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量變化pd組與對(duì)照組相比較，黑質(zhì)區(qū)可見(jiàn)大量cox2（28.2±5.1 vs 1.0±0.3），pge2(36.1±4.2 vs 3.2±0.4)和nfκb（34.6±5.6 vs 2.5±0.8）陽(yáng)性細(xì)胞（圖2a，c，e）；rg1組黑質(zhì)區(qū)cox2(1.9±0.7)；pge2(4.6±0.3)和nfκb(4.9±2.1)陽(yáng)性細(xì)胞較pd組有顯著減少（圖2b，d，f）. 圖像分析結(jié)果顯示，pd組，rg1組和對(duì)照組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01）. 同時(shí)cox2，pge2間存在正相關(guān)關(guān)系（r=0.576，p<0.05）；cox2和nfκb間也存在正相關(guān)關(guān)系(r=0.588, p<0.05).

2.3western blot檢測(cè)在預(yù)染蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量20×103，72×103，50×103和61×103處,分別可見(jiàn)pge2，cox2，nfκb和th特異性蛋白條帶. 灰度分析發(fā)現(xiàn),pd組與對(duì)照組相比，th的表達(dá)下降約為65％，而nfκb和cox2，pge2的表達(dá)則明顯升高(p<0.01)；rg1組與對(duì)照組相比較，th表達(dá)量下降約為36％，nfκb，cox2和pge2的表達(dá)較模型組均顯著降低(p<0.01)；對(duì)照組僅有少量nfκb，cox2和pge2的蛋白表達(dá)（圖3, 表1）. 表1各組小鼠中腦黑質(zhì)th，cox2，pge2和nfκb蛋白表達(dá)水平

3討論

pd是一種常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,主要病理改變是中腦黑質(zhì)da能神經(jīng)元進(jìn)行性變性缺失. 我們采用mptp復(fù)制的小鼠模型具有pd典型行為學(xué)表現(xiàn)；western blot結(jié)果顯示腹側(cè)中腦th蛋白的表達(dá)下降,提示此模型存在da能神經(jīng)元大量丟失,說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)pd模型符合實(shí)驗(yàn)要求［4］.

近年來(lái)有研究表明,pd中存在炎癥,是pd患者黑質(zhì)da缺失重要原因［5］. 炎癥介質(zhì)pge2及其合成限速酶c0x2可作為炎癥反應(yīng)的重要生物學(xué)指標(biāo)［6-7］. 實(shí)驗(yàn)中我們檢測(cè)了三者表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)pd組cox2，pge2均大量表達(dá)，同時(shí)伴有中腦腹側(cè)th表達(dá)水平急劇下降，這些都提示pd組小鼠腦內(nèi)存在嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，并可能與da能神經(jīng)元丟失有關(guān)［2］，說(shuō)明cox2可能通過(guò)介導(dǎo)炎癥反應(yīng),而參與da能神經(jīng)元丟失過(guò)程. 因此，研究cox2表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，將對(duì)探討da神經(jīng)元的保護(hù)機(jī)制起重要作用. 有研究［3］發(fā)現(xiàn)，nfκb作為促炎癥基因表達(dá)的樞紐之一,可誘導(dǎo)cox2表達(dá)，且nfκb的激活與pd的病理機(jī)制有關(guān). 為明確nfκb是否參與cox2表達(dá)及與da能神經(jīng)元變性丟失的關(guān)系，我們觀察了上述三者在中腦黑質(zhì)區(qū)的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pd組nfκb，cox2表達(dá)明顯升高，且兩者間存在正相關(guān)關(guān)系(r=0.5838, p<0.05),th表達(dá)明顯下降（p<0.01）. 我們推測(cè)，在本實(shí)驗(yàn)條件下mptp可能激活nfκb,繼而促進(jìn)cox2和pge2的表達(dá),從而影響da能神經(jīng)元的變化，其結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致［8］.

人參皂甙rg1具有抗炎、抗氧化等作用. 有報(bào)道稱(chēng)rg1對(duì)mptp致黑質(zhì)區(qū)da能神經(jīng)元的損傷有一定保護(hù)作用［9］. 為探討人參皂甙rg1對(duì)da能神經(jīng)元的保護(hù)途徑,我們對(duì)小鼠給予人參皂甙rg1干預(yù)，發(fā)現(xiàn)nfκb陽(yáng)性細(xì)胞以及蛋白水平較pd組有明顯減少，相應(yīng)黑質(zhì)區(qū)th陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量和蛋白水平較pd組降低程度減輕. 可能的原因是rg1通過(guò)減少nfκb表達(dá)來(lái)抑制cox2表達(dá),減輕其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng),使黑質(zhì)da能神經(jīng)元免于mptp誘導(dǎo)的損傷，最終起到保護(hù)da神經(jīng)元作用［10］.

綜上所述，核因子nfκb可能是mptp所致亞急性pd模型中腦黑質(zhì)cox2表達(dá)及其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的重要上游事件；人參皂甙rg1可對(duì)核因子nfκb產(chǎn)生影響進(jìn)而對(duì)黑質(zhì)da能神經(jīng)元起一定的保護(hù)作用.

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第5篇：動(dòng)物行為學(xué)分析范文

關(guān)鍵詞：中藥YN-3號(hào)；慢性應(yīng)激；GR；NMDAR

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1673-7717(2008)04-0727-03

體內(nèi)糖皮質(zhì)激素的分泌具有自身逆反饋調(diào)節(jié)的特點(diǎn)，其分泌主要受HPA軸（下丘腦-垂體前葉-腎上腺皮質(zhì)軸）調(diào)節(jié)，糖皮質(zhì)激素在血液中濃度的增加反過(guò)來(lái)又可以抑制下丘腦和垂體前葉，從而減少糖皮質(zhì)激素的分泌。海馬中富含GR（糖皮質(zhì)激素受體），可以抑制應(yīng)激條件下HPA軸的過(guò)度反應(yīng)。創(chuàng)傷性應(yīng)激和慢性應(yīng)激均可導(dǎo)致海馬GR含量改變，報(bào)道中創(chuàng)傷性的應(yīng)激主要引起海馬GR表達(dá)的升高[1]；慢性應(yīng)激損傷實(shí)驗(yàn)顯示，應(yīng)激早期海馬內(nèi)GR表達(dá)增強(qiáng)，慢性應(yīng)激后期陽(yáng)性表達(dá)減少[2]。海馬GR除了可以自我調(diào)節(jié)，還受到NMDAR (N-甲基-D-天冬氨酸受體)的影響，兩者都對(duì)HPA軸和LTP(海馬神經(jīng)元長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)效應(yīng))有影響，參與應(yīng)激和學(xué)習(xí)記憶[3]。本實(shí)驗(yàn)觀察慢性應(yīng)激對(duì)大鼠一系列行為學(xué)活動(dòng)的影響效應(yīng)，包括自主運(yùn)動(dòng)、強(qiáng)迫運(yùn)動(dòng)和學(xué)習(xí)記憶活動(dòng)，同時(shí)觀察中藥YN-3號(hào)對(duì)這一過(guò)程的干預(yù)作用。

1對(duì)象和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

雄性SD大鼠，體重160～180g（北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心），篩選40只，隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為：空白組（control）、模型組(model)、YN-3組(YN-3)、氟西汀組(Prozac)。

1.2主要實(shí)驗(yàn)器材和藥品

Noduls Ethovision軟件及攝像系統(tǒng)（荷蘭Noldus information technology 公司,型號(hào)：NOVELBAC）；MG-3Y迷宮刺激器（張家港生物醫(yī)學(xué)儀器廠）；氟西汀(百優(yōu)解，片劑，美國(guó)禮來(lái)公司，批號(hào)A019602）。

1.3模型建立

造模各組孤養(yǎng)并每日隨機(jī)給予以下刺激的一種：斷食（24h）、斷水（24h）、晝夜顛倒（24h）、夾尾（3min）、束縛（3h）、10℃冷水游泳（5min）、電擊足底（電壓為30V，電擊5s，間歇5s共進(jìn)行300s），共21天。

1.4治療組處理方法

YN-3組灌胃，使用前按照灌胃劑量煎藥濃縮,濃度1.00g/mL，貯存于4 ℃冰箱中備用，用前加熱。氟西汀組于每日進(jìn)行應(yīng)激刺激前1h灌胃給藥，用藥量為1.8mg/kg，按1mL/100g給藥，共21天。

1.5行為學(xué)檢測(cè)

1.5.1Open-Field實(shí)驗(yàn)使用Noduls Ethovision軟件及攝像系統(tǒng)對(duì)大鼠3min內(nèi)在小箱中進(jìn)行的總路程、站立次數(shù)進(jìn)行記錄。每只大鼠行為的檢測(cè)在區(qū)域?yàn)?0cm×80cm的開(kāi)放場(chǎng)內(nèi)，由紅外攝像系統(tǒng)和視頻合成器記錄大鼠的活動(dòng)情況, 計(jì)算機(jī)分析系統(tǒng)分析大鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡。

1.5.2強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)

1.5.3“Y”型電迷宮實(shí)驗(yàn)應(yīng)用MG-3Y迷宮刺激器，測(cè)試成績(jī)分為學(xué)習(xí)成績(jī)和記憶成績(jī)。宮箱設(shè)有3條通道，每臂末端有信號(hào)燈，箱底通以交流電。燈光指示為安全區(qū)，不通電。將大鼠置于一支臂端，另兩支任意一支給燈光信號(hào)，示安全區(qū)。適應(yīng)1min后給予電擊，以大鼠直接逃至安全區(qū)為正確反應(yīng)，否則為錯(cuò)誤。學(xué)習(xí)成績(jī)以大鼠達(dá)到連續(xù)9次以上正確反應(yīng)時(shí)所需的電擊總次數(shù)為準(zhǔn)，記憶成績(jī)以學(xué)習(xí)完后再電擊10次中正確反應(yīng)的次數(shù)（N/10）為準(zhǔn)，于應(yīng)激前后記錄測(cè)試成績(jī)。

1.6GR NMDAR免疫組化染色和圖像分析

斷頭后迅速取腦并切取含海馬腦段，浸入4％多聚甲醛液中固定，石蠟包埋，額狀連續(xù)切片，片厚5μm，每只動(dòng)物間隔取片，每個(gè)指標(biāo)取3張，常規(guī)SABC法染色：常規(guī)脫蠟和水化，兔抗GR、NMDAR單克隆抗體（1∶100，北京博奧森生物技術(shù)有限公司）室溫60min，生物素標(biāo)記二抗室溫孵育15min，鏈霉菌抗生物素－過(guò)氧化物酶溶液室溫15min，DAB溶液顯色（以上SP超敏試劑盒由福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）。光鏡下，歸類(lèi)每張切片海馬CA1、CA2、CA3、齒狀回等4個(gè)亞區(qū)的陽(yáng)性細(xì)胞強(qiáng)度，以每100個(gè)細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)，分為陰性(n=0)、弱陽(yáng)性(0

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

行為學(xué)成績(jī)均用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(Independent-Samples T Test)做組間差異顯著性分析；圖像分析結(jié)果用多個(gè)樣本比較的秩和檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis法)和多個(gè)樣本兩兩比較的秩和檢驗(yàn)(Nemenyi法)。

2結(jié)果

2.1中藥YN-3號(hào)對(duì)大鼠Open-Field實(shí)驗(yàn)的影響

3min內(nèi)大鼠活動(dòng)的總路程和站立次數(shù)見(jiàn)表1。結(jié)果顯示：與空白組比較，模型大鼠活動(dòng)總路程顯著下降(P

2.2中藥YN-3號(hào)對(duì)大鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)的影響

強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)成績(jī)見(jiàn)表2。結(jié)果顯示與空白組比較，應(yīng)激使模型大鼠的游泳不動(dòng)時(shí)間顯著下降(P

2.3中藥YN-3號(hào)對(duì)大鼠“Y”型電迷宮實(shí)驗(yàn)的影響

學(xué)習(xí)和記憶成績(jī)見(jiàn)表3。結(jié)果顯示應(yīng)激使模型大鼠的學(xué)習(xí)、記憶能力大幅度下降(P

2.4中藥YN-3號(hào)對(duì)大鼠海馬內(nèi)GR陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度的影響

光鏡下可見(jiàn)海馬細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)呈褐色,位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，多見(jiàn)于錐體細(xì)胞層，個(gè)個(gè)亞區(qū)都有一定表達(dá)，但主要分布于海馬CA1區(qū)。具體表達(dá)情況見(jiàn)表4，查χ2界值表得P

2.5中藥YN-3號(hào)對(duì)大鼠海馬內(nèi)NMDAR陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度的影響

表達(dá)情況基本與GR一致，但陽(yáng)性表達(dá)密集的區(qū)域主要有CA1、CA3區(qū)，具體情況見(jiàn)表5。查χ2界值表得P0.05；χ2m,N＝29.36，P

3討論

過(guò)度的應(yīng)激會(huì)引起HPA軸亢進(jìn)，機(jī)體出現(xiàn)應(yīng)激紊亂，會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的繼發(fā)性損害，例如對(duì)周?chē)挛锏呐d趣降低、生存欲望和學(xué)習(xí)記憶能力下降等。海馬內(nèi)富含兩種腎上腺皮質(zhì)激素受體：鹽皮質(zhì)激素受體(MR)和糖皮質(zhì)激素受體(GR)，MR主要參與基礎(chǔ)水平的HPA軸的調(diào)節(jié)，GR則抑制應(yīng)激條件下HPA軸的過(guò)度反應(yīng)[4]。GR的調(diào)節(jié)與NMDAR介導(dǎo)的突觸傳遞有著某種密切聯(lián)系。從應(yīng)激的角度看，海馬是HPA軸調(diào)節(jié)的高位中樞，是應(yīng)激累及的敏感部位；從學(xué)習(xí)記憶的角度來(lái)看，海馬是參與學(xué)習(xí)記憶的重要部位，而海馬的這些作用均有GR和NMDAR的介入[5]。

本文研究慢性應(yīng)激下GR與NMDAR之間的作用關(guān)系，結(jié)果顯示慢性應(yīng)激使大鼠海馬內(nèi)GR的表達(dá)強(qiáng)度降低，而同時(shí)NMDAR的表達(dá)強(qiáng)度也降低。對(duì)于GR表達(dá)降低的解釋可能是一種過(guò)度刺激的產(chǎn)生的脫敏反應(yīng)，就是當(dāng)機(jī)體受到應(yīng)激原的刺激的早期，內(nèi)源性GC（糖皮質(zhì)激素）水平升高，而GR也隨之增高，當(dāng)應(yīng)激原持續(xù)存在，累計(jì)強(qiáng)度過(guò)大、持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)， GC始終保持較高水平，導(dǎo)致GR敏感度降低，免疫強(qiáng)度減弱，繼而耗竭而表達(dá)減少。海馬GR表達(dá)降低，使得其對(duì)HPA軸的負(fù)反饋?zhàn)饔脺p弱，加重機(jī)體的損傷反應(yīng)。

既往報(bào)道認(rèn)為急性應(yīng)激或創(chuàng)傷性應(yīng)激時(shí)GR的降低受NMDAR受體通道活性增強(qiáng)的影響[6-7]，表現(xiàn)為在阻斷NMDAR通道之后，GR表達(dá)降低的程度明顯減弱。本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果并不支持在慢性應(yīng)激的情況下GR表達(dá)降低的同時(shí)NMDAR的活性增強(qiáng)，而是出現(xiàn)相反的結(jié)果。雖然兩種受體在海馬各個(gè)亞區(qū)的分布情況較為一致，但NMDAR的表達(dá)強(qiáng)度呈現(xiàn)出下降的表現(xiàn)。這一結(jié)果提示如下問(wèn)題：在慢性應(yīng)激的條件下是否存在另一條通路可以影響GR的含量下降，并且NMDAR通道的一系列病理性效應(yīng)，如興奮性毒性，在應(yīng)激的后期是否還繼續(xù)存在。但無(wú)論答案怎樣，中藥YN-3號(hào)在本次實(shí)驗(yàn)中的抗抑郁學(xué)改變的作用表現(xiàn)的很明顯，且對(duì)兩種受體的表達(dá)有趨向正常組的調(diào)節(jié)作用。

參考文獻(xiàn)

［1］王慶松，王正國(guó)，朱佩芳．創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙樣行為異常大鼠海馬糖皮質(zhì)激素與鹽皮質(zhì)激素受體表達(dá)研究[J]．中華創(chuàng)傷雜志，2003，19（3）：179－182.

［2］陳家旭，楊建新，趙歆，等.岳廣欣慢性束縛應(yīng)激大鼠中樞糖皮質(zhì)激素受體變化及中藥復(fù)方的影響[J]．中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志，2005，21(4):402-406.

［3］趙剛，蔡定芳．應(yīng)激、糖皮質(zhì)激素和海馬老化[J]．國(guó)外醫(yī)學(xué)•老年醫(yī)學(xué)分冊(cè)，2002，5(23):125-128.

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［5］Sakimura K，Kutsuwada T，Ito I，et al. Reduced hippocampal LTP and spatial learning in mice lacking NMDA receptor repsilon 1 subunit[J]．Nature，1995，373: 151-155.

第6篇：動(dòng)物行為學(xué)分析范文

[關(guān)鍵詞]開(kāi)心散類(lèi)方；阿爾茨海默??；阿爾茨海默病小鼠模型；Tau蛋白

[Abstract]The efficacy of Chinese herbal formulas in treating Alzheimer has been proved in many studies In this study， six different Kaixin San formulas were compared to investigate their effects on learning and memory decline， brainderived neurotrophic factor （BDNF） in the hippocampus， tau protein， acetylcholinesterase （AChE） and Nterminal probrain natriuretic peptide （NTproBNP） Kunming mice were selected and established a mouse model of Alzheimer′s by intraperitoneal injection of Dgalactose and sodium nitrite， continued intragastric 4 weeks， using the ability of learning and memory in Morris water maze test to evaluate the animals in each group； the content of BDNF in the hippocampus of mice with Western blotting detected； ELISA method for the detection of each group of mice hippocampal tau protein，pTau protein， Aβ，Ach，AchE and serum NTproBNP levels The results showed that， Kaixin San of Qianjin Yaofang three dose recorded significantly improved learning and memory ability of mice； increased the content of BDNF and Ach in the hippocampus； decreased the content of Aβ， Tau protein， pTau protein in the hippocampus； high， middle dose significantly decreased the serum NTproBNP and AchE in hippocampus， the effect is most significant Part dose of Kaixin San of Yixin Fang， Kaixin Wan of Yimen Fang， Dingzhi Xiaowan of Beji Qianjin Yaofang and Dingzhi Wan of Guji Luyan could improve the learning and memory ability evaluation indicators， significantly increased BDNF and Ach in the hippocampus of AD model mice， reduced the Aβ， Tau protein， pTau protein in hippocampus of AD model mice， decreased the NTproBNP and AchE in serum of AD mice， the effect is more significant Three does of Buxin Tang of Qianjin Yi had no effects of treatment in Alzheimer′s disease The results showed the treatment in AD of Kaixin San of Qianjin Yaofang is the most significant

[Key words]Kaixin San formulas； Alzheimer； Alzheimer disease mouse model； Tau protein

doi：10.4268/cjcmm20160718

阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一種進(jìn)行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其主要臨床表現(xiàn)為記憶力減退、認(rèn)知障礙及人格改變等。據(jù)流行病學(xué)研究表明，該病的發(fā)病階段與年齡有著一定的聯(lián)系，而隨著我國(guó)人口壽命的延長(zhǎng)和社會(huì)老齡化的加劇，阿爾茨海默病的發(fā)病率明顯上升，其致死率僅次于心腦血管疾病、腫瘤和腦卒中，成為威脅老人健康的最嚴(yán)重疾患之一[12]。

開(kāi)心散類(lèi)方始載于唐代孫思邈的《千金要方?卷十四》，由遠(yuǎn)志、人參、茯苓、石菖蒲4味藥材組成，還包括了《醫(yī)門(mén)方》之開(kāi)心丸、《備急千金要方》之定志小丸、《古今錄驗(yàn)》之定志丸、《醫(yī)心方》之開(kāi)心散和《千金翼》之補(bǔ)心湯，主要有益智、調(diào)節(jié)情志、防老抗衰等功效，其藥方組成完全相同但配伍比例不同，功效亦有不同（表1）。 前期的研究表明，6種開(kāi)心散類(lèi)方對(duì)Aβ2325損傷的 PC12細(xì)胞均有保護(hù)作用，有潛在治療阿爾茨海默病的作用，《千金要方?卷十四》之開(kāi)心散作用最為顯著[3]，《備急千金要方》之定志小丸可明顯改善東莨菪堿所致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙，增強(qiáng)小鼠學(xué)習(xí)記憶的能力[4]。

AD的發(fā)病機(jī)制尚不明確，主要有膽堿能學(xué)說(shuō)、β淀粉樣蛋白學(xué)說(shuō)、Tau蛋白學(xué)說(shuō)、血管因素學(xué)說(shuō)等。本文將通過(guò)觀察6種開(kāi)心散類(lèi)方對(duì)AD模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力的影響，以及對(duì)與AD可能的發(fā)病機(jī)制相關(guān)學(xué)說(shuō)進(jìn)行初步探討，如海馬中腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF），乙酰膽堿（Ach），乙酰膽堿酯酶（AchE），Aβ，Tau蛋白，pTau蛋白，血清中N端前腦鈉肽前體（NTproBNP）的影響，評(píng)價(jià)6個(gè)類(lèi)方對(duì)阿爾茨海默癥模型小鼠的影響。

1材料

健康SPF級(jí)昆明小鼠210只，雌雄各半，入組時(shí)體重18～22 g，中國(guó)人民總醫(yī)院動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)11400700084097。

人參、遠(yuǎn)志、茯苓、石菖蒲購(gòu)自北京同仁堂藥材有限責(zé)任公司，6種開(kāi)心散類(lèi)方粉劑均由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所制劑中心提供，《千金要方?卷十四》之開(kāi)心散011 g干粉/g生藥、《醫(yī)門(mén)方》之開(kāi)心丸019 g干粉/g生藥、《備急千金要方》之定志小丸021 g干粉/g生藥、《古今錄驗(yàn)》之定志丸023 g干粉/g生藥、《醫(yī)心方》之開(kāi)心散017 g干粉/g生藥和《千金翼》之補(bǔ)心湯021 g干粉/g生藥，使用時(shí)按比例配成藥液；石杉?jí)A甲膠囊（批號(hào)130501）由上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；D半乳糖（批號(hào)20140117）購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；亞硝酸鈉（許可證號(hào)XK1320100153）購(gòu)于西隴化工股份有限公司；BDNF一抗（貨號(hào)SC546）購(gòu)于Senta公司；Tau蛋白，pTau蛋白，Ach，AchE，Aβ，NTproBNP ELISA試劑盒均購(gòu)于R&D公司。

Morris水迷宮（上海移數(shù)公司）；DNM9602G酶標(biāo)分析儀（北京普朗新技術(shù)有限公司）；3K15低溫離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司）；VC150超聲破碎儀，渦旋混合儀（SCI logex公司）；UVP凝膠成像系統(tǒng)EC3 Imaging System（美國(guó)BIORAD公司）。

2方法

21分組、造模及給藥所有小鼠適應(yīng)環(huán)境3 d后，通過(guò)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)排除個(gè)體差異，篩選出170只小鼠（雌雄各半），隨機(jī)選取10只作為正常組，其余小鼠作為AD模型組。正常組動(dòng)物腹腔注射等體積生理鹽水，模型組動(dòng)物每日腹腔注射D半乳糖120 mg?kg-1和亞硝酸鈉45 mg?kg-1，連續(xù)60 d后，將模型小鼠隨機(jī)分為模型組，陽(yáng)性對(duì)照組，以及6個(gè)開(kāi)心散類(lèi)方高、中、低劑量組，正常組和模型組每天灌胃25 mL? kg-1蒸餾水，陽(yáng)性對(duì)照組給藥劑量為005 mg?kg-1，各開(kāi)心散類(lèi)方給藥組高劑量為每天3570 g?kg-1，中劑量為1785 g?kg-1，低劑量為0892 g?kg-1，Morris水迷宮測(cè)定期繼續(xù)給藥，共給藥35 d。模型組與各給藥組給藥同時(shí)每日進(jìn)行腹腔注射D半乳糖120 mg?kg-1和亞硝酸鈉45 mg?kg-1，正常組腹腔注射等體積的生理鹽水。

22Morris水迷宮訓(xùn)練及測(cè)試造模60 d后和給藥30 d后的第1天至第4天為Morris水迷宮訓(xùn)練，每天訓(xùn)練1次，于第5天進(jìn)行定位導(dǎo)航試驗(yàn)，利用行為學(xué)分析軟件記錄小鼠60 s內(nèi)找到平臺(tái)所需的時(shí)間（即逃避潛伏期）；第6天撤出平臺(tái)，進(jìn)行空間探索試驗(yàn)，記錄小鼠在60 s內(nèi)穿越原平臺(tái)所在位置的次數(shù)（穿越平臺(tái)次數(shù)）、第3象限（即目的象限）游泳路程及游泳總路程。計(jì)算得出目的象限游泳路程百分比=目的象限游泳路程/游泳總路程。

23采集樣品及相關(guān)物質(zhì)測(cè)定行為學(xué)試驗(yàn)結(jié)束后，立即對(duì)小鼠麻醉進(jìn)行摘眼球取血，迅速在冰上剝離海馬，置于凍存管中，-80 ℃凍存，待測(cè)。將血在室溫靜置一段時(shí)間后，4 ℃ 3 000 r?min-1離心10 min，取上層血清置于-80 ℃凍存，待測(cè)。Western blot法測(cè)定各組動(dòng)物海馬中BDNF的表達(dá)水平，用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)。將各組蛋白調(diào)成等濃度，并加入上樣緩沖液，用12% SDSPAGE分離膠和5% SDSPAGE濃縮膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到02 μm BVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，孵一抗（1∶200），4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，每次10 min，加入二抗室溫?fù)u床90 min，TBST洗膜3次，每次10 min，用UVP凝膠成像系統(tǒng)得出條帶，并計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參βacting的吸光度（A）比值；按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定各組動(dòng)物海馬中Tau蛋白，pTau蛋白，Ach，AchE和Aβ的含量以及各組動(dòng)物血清中NTproBNP的含量

24數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 200統(tǒng)計(jì)軟件處理，采用單因素方差分析，組間差異采用Dunnet′s檢驗(yàn)，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用±s表示，以P

3結(jié)果

31對(duì)各組小鼠定位導(dǎo)航試驗(yàn)的影響腹腔注射D半乳糖和亞硝酸鈉后，模型組小鼠的潛伏期明顯升高，與正常組相比有顯著性差異（P

32對(duì)各組小鼠空間探索試驗(yàn)的影響Morris水迷宮空間探索試驗(yàn)結(jié)果顯示，腹腔注射D半乳糖和亞硝酸鈉后模型組小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)和目的象限游泳路程百分比均明顯小于正常組（P

33對(duì)各組小鼠海馬中BDNF含量的影響與正常組相比，模型組小鼠海馬中BDNF表達(dá)明顯降低；

與模型組相比，陽(yáng)性組，《千金要方?卷十四》之開(kāi)心散高、中劑量組，《醫(yī)心方》之開(kāi)心散中劑量組，《醫(yī)門(mén)方》之開(kāi)心丸中劑量組，《備急千金要方》之定志小丸高、中劑量組均能不同程度降低AD模型小鼠海馬中BDNF相對(duì)含量，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各組低劑量均未表現(xiàn)出顯著性差異（圖1）。

34各組小鼠海馬中Ach，AchE含量的影響與正常組相比，模型組小鼠海馬中Ach含量明顯降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組，《古今錄驗(yàn)》之定志丸中劑量組，《醫(yī)門(mén)方》之開(kāi)心丸高、中劑量組，《備急千金要方》之定志小丸中劑量組，《千金要方?卷十四》之開(kāi)心散高、中劑量組均能不同程度升高小鼠海馬中AchE活性，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各組低劑量均未表現(xiàn)出顯著性差異（表3）。

與正常組相比，模型組小鼠海馬中AchE含量明顯增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組，《古今錄驗(yàn)》之定志丸中劑量組，《醫(yī)門(mén)方》之開(kāi)心丸中劑量組，《備急千金要方》之定志小丸中劑量組，《千金要方?卷十四》之開(kāi)心散高、中劑量組均能不同程度降低小鼠海馬中AchE活性，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而各組低劑量均未表現(xiàn)出顯著性差異（表3）。

35各組小鼠海馬中Aβ含量的影響與正常組相比，模型組小鼠海馬中Aβ含量明顯增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

36對(duì)各組小鼠海馬中Tau蛋白、pTau蛋白含量的影響與正常組相比，模型組小鼠海馬中Tau蛋白含量明顯增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組相比，

陽(yáng)性對(duì)照組，《醫(yī)心方》之開(kāi)心散中劑量組，《醫(yī)門(mén)方》之開(kāi)心丸高、中劑量組，《備急千金要方》之定志小丸中劑量組，《千金要方?卷十四》之開(kāi)心散高、中劑量組均能不同程度升高小鼠海馬中AchE活性，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各組低劑量均未表現(xiàn)出顯著性差異（表4）。

與正常組相比，模型組小鼠海馬中pTau蛋白含量明顯增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組，《醫(yī)心方》之開(kāi)心散中劑量組，《醫(yī)門(mén)方》之開(kāi)心丸高、中劑量組，《備急千金要方》之定志小丸高、中劑量組，《千金要方?卷十四》之開(kāi)心散高、中劑量組均能不同程度降低小鼠海馬中AchE活性，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各組低劑量均未表現(xiàn)出顯著性差異（表4）。

37對(duì)各組小鼠血清中NTproBNP含量的影響與正常組相比，模型組小鼠血清中NTproBNP含量明顯增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

4討論

本實(shí)驗(yàn)采用腹腔注射D半乳糖聯(lián)合亞硝酸鈉模型，D半乳糖可造成急性亞衰老模型，亞硝酸鈉可使全身臟器缺氧導(dǎo)致記憶力下降，在一定程度上模擬了AD的發(fā)病特點(diǎn)[58]，較多的與AD相關(guān)的研究均使用了類(lèi)似模型，該模型需連續(xù)腹腔注射60 d，治療時(shí)連續(xù)給藥35 d，給藥期間持續(xù)腹腔注射造模，避免動(dòng)物自然恢復(fù)。本實(shí)驗(yàn)造模后動(dòng)物的行為學(xué)研究結(jié)果顯示，模型組的逃避潛伏期比正常組明顯增加，而穿越平臺(tái)次數(shù)和目的象限路程百分比明顯減少，并且模型組小鼠普遍出現(xiàn)掉毛、毛色無(wú)光澤的衰老現(xiàn)象。給藥35 d后，與模型組相比，各給藥組逃避潛伏期有所減少，穿越平臺(tái)次數(shù)和目的象限路程百分比有所增加。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，各類(lèi)方低劑量與模型組相比均無(wú)顯著性差異，因此不作為重點(diǎn)研究對(duì)象。

AD的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，涉及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)、膽堿能、β淀粉樣蛋白、Tau蛋白、血管因素等多方面。BDNF是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族的一個(gè)重要成員，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，腦內(nèi)BDNF水平下降是AD早期的信號(hào)之一[9]；乙酰膽堿（Ach）是中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)主要的神經(jīng)遞質(zhì)，是維持學(xué)習(xí)記憶正常進(jìn)行的必要條件[10]；Aβ的集聚被認(rèn)為是AD發(fā)病的環(huán)節(jié)之一，多種因素均可導(dǎo)致β淀粉樣前體蛋白（APP）的主要代謝途徑失衡而產(chǎn)生不溶性Aβ，通過(guò)一系列途徑產(chǎn)生神經(jīng)毒性，從而參與AD的病理[11]；以磷酸化Tau蛋白為主要成分的神經(jīng)元纖維纏結(jié)是阿爾茲海默癥主要病理表現(xiàn)，同時(shí)也是AD中發(fā)生認(rèn)知和記憶功能障礙的重要原因[12]。NTproBNP是心率衰竭常見(jiàn)的檢測(cè)指標(biāo)，研究表明，NTproBNP水平升高可能預(yù)示著認(rèn)知功能下降[13]。

本研究除觀察6種開(kāi)心散類(lèi)方對(duì)AD模型動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力的影響外，還選取了上述較有代表性的相關(guān)靶蛋白BDNF，Ach，AchE，Aβ，Tau蛋白，pTau蛋白，NTproBNP進(jìn)行了作用機(jī)制的初步研究。結(jié)果表明，6個(gè)類(lèi)方對(duì)AD模型小鼠相關(guān)靶蛋白均有不同程度的影響，但各有側(cè)重。將相關(guān)靶蛋白指標(biāo)運(yùn)用主成分分析轉(zhuǎn)化為權(quán)重[14]，首先用分析軟件得出2個(gè)主成分，求出各個(gè)指標(biāo)在各主成分線性組合中的系數(shù)，利用各主成分的方差貢獻(xiàn)率將系數(shù)歸一化，由此得出各個(gè)指標(biāo)所占權(quán)重。結(jié)果顯示，BDNF占007，Ach占019，AchE占008，Aβ占019，Tau蛋白占021，pTau蛋白占005，NTproBNP占020，由此得出Tau蛋白所占權(quán)重最多，因此，開(kāi)心散類(lèi)方治療阿爾茨海默病模型小鼠的作用在Tau蛋白方面可能較為突出。

6個(gè)開(kāi)心散類(lèi)方對(duì)AD模型動(dòng)物的作用不同，可能與它們的配伍比例不同、發(fā)揮作用的有效成分含量不同有關(guān)?！肚Ы鹨?卷十四》之開(kāi)心散人參、茯苓、遠(yuǎn)志、石菖蒲的比例為1∶5∶1∶25，其重用茯苓與石菖蒲2味藥材，表現(xiàn)出較明顯的治療AD效果；與之相比，《醫(yī)心方》之開(kāi)心散和《醫(yī)門(mén)方》之開(kāi)心丸減少了茯苓的配比，治療AD的效果有所減弱。有研究證實(shí)去茯苓開(kāi)心散對(duì)AD模型動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力沒(méi)有改善作用或作用減弱[15]；而本實(shí)驗(yàn)室前期關(guān)于6個(gè)開(kāi)心散類(lèi)方對(duì)抑郁的作用研究中表明《備急千金要方》之定志小丸對(duì)抑郁大鼠的影響最為明顯，《千金要方?卷十四》之開(kāi)心散在抑郁動(dòng)物模型上未見(jiàn)顯著的治療作用，進(jìn)一步針對(duì)入血成分的研究中表明《備急千金要方》之定志小丸的入血成分中人參和遠(yuǎn)志的有效成分明顯較《千金要方?卷十四》之開(kāi)心散多，說(shuō)明人參和遠(yuǎn)志的含量對(duì)于抗抑郁作用的發(fā)揮至關(guān)重要[16]。結(jié)合以上分析，本研究中《千金要方?卷十四》之開(kāi)心散在AD小鼠模型中的作用最佳，且該方重用茯苓和石菖蒲，提示茯苓和石菖蒲可能是其發(fā)揮治療AD作用的主要因素之一，其進(jìn)一步的作用及機(jī)制，需更深入的研究。

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第7篇：動(dòng)物行為學(xué)分析范文

【關(guān)鍵詞】 P2X3受體；神經(jīng)病理性疼痛；L5前根切斷；背根神經(jīng)節(jié)

［Abstract］Objective: To observe the P2X3 receptor expression in lumbar 5 dorsal root ganglion（L5 DRG）with lumbar 5 ventral root transection (L5 VRT). Methods: Thirty male SpragueDawley rats were randomly pided into 5 groups， group A 3 days after L5 VRT， group B 7 days， group C 14 days， group D 21 days and group E of sham operation， whose left spine cords were exposed by hemilaminectomy. Rats in each group were respectively perfused with paraformaldehyde and materials were taken from L5 dosal root ganglions and the changes of expression of P2X3 receptor were observed with immunofluorescence staining. Results: (1) Compared with the control group， rats after operation could generate bilateral mechanical allodynia which could persist for at least 4 weeks (P

［Key words］P2X3 receptor; Neuropathic pain; Lumbar 5 ventral root transection; Dorsal root ganglion

神經(jīng)病理性疼痛是由于外周或中樞神經(jīng)系統(tǒng)的直接損傷或功能紊亂所致，在損傷修復(fù)后疼痛仍可能長(zhǎng)期存在，它以自發(fā)性疼痛、痛覺(jué)過(guò)敏、異常性疼痛為特征，其機(jī)制復(fù)雜，目前認(rèn)為與外周和中樞敏化相關(guān)［13］。背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion，DRG）作為痛覺(jué)傳入的第一級(jí)神經(jīng)元，在痛覺(jué)的外周機(jī)制中起著極為重要的作用。近年來(lái)研究表明，DRG神經(jīng)元在炎性痛和神經(jīng)源性痛的情況下可發(fā)生顯著的可塑性變化，如神經(jīng)肽、受體、酶和細(xì)胞表面分子的表達(dá)都發(fā)生了不同水平的上下調(diào)變化。P2X3受體屬于嘌呤受體（purinergic receptors），它選擇性地表達(dá)在DRG神經(jīng)元中與疼痛感覺(jué)相關(guān)的中、小神經(jīng)元［4］。L5前根切斷模型（L5 VRT）是一種較新的疼痛模型，該模型在椎管內(nèi)切斷L5的前根，而不影響感覺(jué)神經(jīng)，但是會(huì)出現(xiàn)很明顯的機(jī)械痛敏和短暫的熱痛敏，并且會(huì)出現(xiàn)明顯的鏡像痛［5］。本文通過(guò)觀察該模型中背根神經(jīng)節(jié)P2X3受體表達(dá)的變化，探討其機(jī)械痛敏的產(chǎn)生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及器材

手術(shù)器械（無(wú)菌手術(shù)刀、有齒鑷、咬骨鉗、線剪、眼科剪、三棱針、玻璃分針等）；Von Frey Filament（stoelting，USA）及相關(guān)設(shè)備；動(dòng)物灌注裝置（自制）；冰凍切片機(jī)（leica CM3050，德國(guó)）；熒光顯微鏡 （leica DFC 350FX，德國(guó)）；10%水合氯醛（購(gòu)自中山大學(xué)第一附屬醫(yī)院）；兔抗 P2X3 受體血清（neuromics， Minneapolis，MN，USA)；羊抗兔的IgGcy3（chemicon）；正常羊血清（北京中山金橋）；牛血清白蛋白（北京中山金橋）；多聚甲醛（sigma，USA）；TritonX100（sigma，USA）。

1.2 動(dòng)物及分組

選用SpragueDawley（SD）雄性大鼠，體重180～220 g，由廣州中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為5組（n=6），L5 VRT術(shù)后3 d（A組）、7 d（B組）、14 d（C組）、21 d（D組）模型組和假手術(shù)組（E組），E組僅行半椎板切除術(shù)暴露左側(cè)脊髓。

1.3 L5 VRT模型的制作

用10%水合氯醛麻醉（3.5 mL/kg，i.p.）大鼠，按照Li 等［5］描述的方法對(duì)大鼠行L5 前根切斷手術(shù)。先在L4 至L5間進(jìn)行半椎板切除術(shù)，暴露脊髓后，用三棱針輕輕劃破外側(cè)脊膜，然后用一特制的玻璃分針輕輕從背根下方提起前根，用虹膜剪剪去2～3 mm 的前根，分層縫合。假手術(shù)組僅行半椎板切除術(shù)，暴露脊髓，不行前根切斷。

1.4 行為學(xué)測(cè)試

用Von Frey纖維絲測(cè)定大鼠的機(jī)械刺激撤足閾值（paw withdrawal threshold，PWT）。測(cè)試時(shí)將大鼠放置于測(cè)試的有機(jī)玻璃箱中，采用Chaplan等［6］報(bào)道的UpDown方法，檢測(cè)大鼠50%的機(jī)械刺激撤足閾值。選8根強(qiáng)度呈對(duì)數(shù)遞增方式的Von Frey Filament（0.41、0.70、1.20、2.04、3.63、5.50、8.51、15.14 g）分別對(duì)大鼠后肢左右腳足心部進(jìn)行機(jī)械性刺激，每次刺激持續(xù)時(shí)間為6～8 s。首先用力度為2.04 的Von Frey Filament 開(kāi)始測(cè)試，測(cè)試時(shí)Von Frey Filament 垂直，微彎，在大鼠足心部保持6～8 s，出現(xiàn)快速撤足為陽(yáng)性反應(yīng)，若撤足反應(yīng)為陰性則選用刺激強(qiáng)度呈對(duì)數(shù)遞增的相鄰von Frey filament 繼續(xù)刺激，若撤足反應(yīng)為陽(yáng)性，則選擇相鄰遞減的刺激強(qiáng)度給予刺激。如此反復(fù)，以第一個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)的前一點(diǎn)為起點(diǎn)，連續(xù)6次的刺激結(jié)果為最終的撤足反應(yīng)模式（撤足反應(yīng)呈持續(xù)陽(yáng)性則為5 次刺激，撤足反應(yīng)呈持續(xù)陰性則為4次刺激，刺激次數(shù)最多為9 次）。

1.5 動(dòng)物灌注及標(biāo)本處理

大鼠腹腔注射10%水合氯醛3.5 mL/kg麻醉，開(kāi)胸暴露心臟，灌注用針經(jīng)左心室置入主動(dòng)脈灌注生理鹽水至流出液不含紅色，然后灌注含4%多聚甲醛約400 mL，固定30 min，取大鼠同側(cè)及對(duì)側(cè)L5 DRG后，放入4%的多聚甲醛中固定3 h，再轉(zhuǎn)入4 ℃ 30%蔗糖溶液經(jīng)24～48 h至組織沉底。用恒冷冰凍切片機(jī)（Leica CM3050，德國(guó)）切片，DRG切片厚度為16 μm，置于含有0.01 M PBS 的24 孔板內(nèi)，4 ℃短暫保存。

1.6 免疫熒光染色

DRG冰凍切片用0.01 M PBS液洗3 次，每次 5 min，然后在室溫下加封閉液，1 h 后吸去封閉液并加入兔抗大鼠P2X3抗體（1∶1 000；Neuromics，USA），置在 4 ℃ 冰箱24～48 h，吸去一抗，用0.01 M PBS 液洗3 次，加入標(biāo)記Cy3 的羊抗兔二抗（1∶200，chemicon，USA），避光室溫下作用1 h，再用0.01 M PBS液洗3 次，隨機(jī)挑選切片貼于載玻片上，立即于熒光顯微鏡（德國(guó)Leica DFC 350FX）下觀察并拍照。

1.7 數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

行為學(xué)測(cè)試結(jié)果均采用非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行分析。同一組大鼠不同測(cè)試時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)用配對(duì)的秩和檢驗(yàn)（Wilcoxon matched pairs test）；兩個(gè)不同實(shí)驗(yàn)組某個(gè)測(cè)試日間的數(shù)據(jù)比較采用u 檢驗(yàn)（MannWhitney u test）。

免疫熒光染色結(jié)果處理方法：每只大鼠隨機(jī)（用隨機(jī)數(shù)表法）挑取雙側(cè)L5 DRG切片各6張，在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)每張切片上的P2X3 陽(yáng)性細(xì)胞百分比，并由此算出每只大鼠P2X3陽(yáng)性細(xì)胞百分比的均數(shù)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組共計(jì)數(shù)6 只大鼠，最后計(jì)算出每組P2X3陽(yáng)性細(xì)胞百分比的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SEM）。先用單因素方差分析處理數(shù)據(jù)，然后用Tukey post hoc test檢測(cè)組間差異。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析通過(guò)SPSS進(jìn)行，所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SEM）表示，P

2 結(jié)果

2.1 一般行為學(xué)及足部形態(tài)的觀察

在L5前根切斷手術(shù)后的觀察時(shí)間內(nèi)，所有大鼠均保持良好的健康狀態(tài)。體重增加正常，沒(méi)有明顯的傷口感染征象，總體活動(dòng)狀態(tài)與正常大鼠沒(méi)有明顯的差別。但L5前根切斷側(cè)的足趾并攏，足呈輕度的外翻狀。見(jiàn)圖1A、圖1B。

2.2 L5 VRT模型組與假手術(shù)組大鼠機(jī)械痛敏比較

Von Frey纖維測(cè)定手術(shù)側(cè)及對(duì)側(cè)后肢50%撤足閾值。手術(shù)前動(dòng)物對(duì)這種輕微的機(jī)械性刺激反應(yīng)微弱，大部分的動(dòng)物對(duì)最粗的Von Frey纖維（15.14 g）的刺激毫無(wú)反應(yīng)，而術(shù)后幾乎所有的動(dòng)物對(duì)實(shí)驗(yàn)中所用的2.04 g的機(jī)械刺激撤足反應(yīng)均為陽(yáng)性，部分痛敏明顯的動(dòng)物對(duì)0.41 g的機(jī)械刺激都有明顯的撤足陽(yáng)性反應(yīng)。

從圖2可發(fā)現(xiàn)，L5 VRT術(shù)后不同時(shí)間機(jī)械痛敏明顯，與假手術(shù)組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

2.3 L5 VRT模型大鼠同側(cè)L5 DRG的P2X3受體的表達(dá)變化

A 組的雙側(cè)L5 DRG的P2X3表達(dá)與E組相比無(wú)明顯變化（P>0.05）。B組及C組、D組的對(duì)側(cè)L5 DRG的P2X3受體的表達(dá)與E組相比無(wú)明顯變化（P>0.05），但同側(cè)L5 DRG的P2X3受體的表達(dá)與E組相比明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立L5 VRT大鼠疼痛模型，應(yīng)用免疫熒光技術(shù)觀察了該模型中不同時(shí)間點(diǎn)的P2X3受體在大鼠的DRG上的表達(dá)，P2X3受體主要表達(dá)在DRG的小神經(jīng)元和中等神經(jīng)元上，與文獻(xiàn)報(bào)道［4］一致。

在疼痛的基礎(chǔ)研究中，既往很多外周神經(jīng)損傷的模型，如CCI（chronic constriction injury）、SNI（spared nerve injury）、SNL（spinal nerve ligation）、PLSN （partial ligation of the sciatic nerve）等都是損傷軸突或初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元，從而模擬損傷區(qū)異位放電而研究疼痛的機(jī)制［7］。近年來(lái)很多研究表明，鄰近未受損的神經(jīng)元也參與了疼痛的發(fā)生和維持［8］。在本實(shí)驗(yàn)研究中，我們采用的是一種比較新的疼痛模型，即L5前根切斷的模型，其主要特點(diǎn)是不損傷感覺(jué)纖維的初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元及軸突，術(shù)后次日行為學(xué)測(cè)試發(fā)現(xiàn)雙足明顯的機(jī)械痛敏，這種痛敏狀態(tài)可持續(xù)至少4周，與Xu等［9］的研究一致，這可能是因?yàn)榍袛嗲案缶植康纳窠?jīng)纖維脫髓鞘，感覺(jué)神經(jīng)元完全暴露在華勒變性的環(huán)境中，從而通過(guò)細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)等作用于初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元，引起初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元異位放電同時(shí)伴有膠質(zhì)細(xì)胞激活，而產(chǎn)生明顯的病理性疼痛。

外周神經(jīng)損傷可以調(diào)節(jié)P2X3受體的表達(dá)，其變化程度取決于損傷的類(lèi)型。被ATP活化的P2X3受體在傷害性神經(jīng)元上有表達(dá)，在CCI模型中P2X3受體在DRG小神經(jīng)元中的表達(dá)是增加的［10］。Tsuzuki等［11］用原位雜交的方法發(fā)現(xiàn)神經(jīng)損傷后在未受損的神經(jīng)元中的P2X3 mRNA表達(dá)增加，但神經(jīng)纖維被切斷的神經(jīng)元P2X3 mRNA表達(dá)下降。在L5 SNL（the L5 spinal nerve ligation）術(shù)后3 d直至整個(gè)實(shí)驗(yàn)觀察期間未發(fā)現(xiàn)L4 DRG P2X3 mRNA 表達(dá)的改變［12］。這意味著在不同的神經(jīng)病理性疼痛模型中，未受損的神經(jīng)元中存在著不同的表型變化和病理機(jī)制。在我們的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)不同時(shí)間點(diǎn)同側(cè)L5 DRG中P2X3受體的表達(dá)增加，主要考慮L5 DRG受到鄰近的神經(jīng)損傷引起華勒變性的影響。Fukuoka等［12］認(rèn)為，直接損傷的神經(jīng)元其周?chē)哪z質(zhì)細(xì)胞激活，神經(jīng)元釋放的神經(jīng)遞質(zhì)和膠質(zhì)細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子等的協(xié)同作用，可能對(duì)這種鄰近未受損的神經(jīng)元中的P2X3受體表達(dá)的增加起了相當(dāng)?shù)淖饔谩?/p>

實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)行L5前根切斷后，能產(chǎn)生明顯的雙足機(jī)械痛敏，即鏡像痛。有研究指出鏡像痛的產(chǎn)生可能與脊髓背角中間神經(jīng)元的交互作用、膠質(zhì)細(xì)胞激活及細(xì)胞因子（TNFα、IL1β及IL6等）的參與有關(guān)［9，13，14］。而在我們的實(shí)驗(yàn)中觀察到手術(shù)對(duì)側(cè)P2X3 受體的表達(dá)無(wú)明顯改變，說(shuō)明在該模型中手術(shù)對(duì)側(cè)的機(jī)械痛敏的改變與該側(cè)P2X3 受體的表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)性，具體的機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

總之，我們的實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立L5前根切斷的大鼠疼痛模型，產(chǎn)生雙足的機(jī)械痛敏，在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用免疫熒光染色的方法觀察了L5 DRG中P2X3 受體的表達(dá)特點(diǎn)，其同側(cè)L5 DRG中P2X3 受體表達(dá)的時(shí)間規(guī)律性可能參與了該模型痛敏發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。預(yù)先給予選擇性的P2X3受體拮抗劑A317491，再觀察L5 VRT大鼠的機(jī)械痛敏，進(jìn)一步明確在該模型中P2X3 受體的影響作用，這將是我們進(jìn)一步研究的問(wèn)題。

致謝：本實(shí)驗(yàn)大部分工作在中山大學(xué)疼痛研究中心完成，得到各位老師及同學(xué)的幫助，特此表示感謝。

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第8篇：動(dòng)物行為學(xué)分析范文

【關(guān)鍵詞】 隔山消

摘要：目的探討隔山消對(duì)藥物所致小鼠空間學(xué)習(xí)記憶障礙的作用，并初步探討其作用機(jī)理。方法50只昆明小鼠隨機(jī)平均分為空白對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組(刺五加注射液)、隔山消高、低劑量組，各組動(dòng)物在作相應(yīng)的處理之后，于Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中測(cè)試其潛伏期。各組動(dòng)物完成行為實(shí)驗(yàn)后頸椎脫臼處死。在低溫下取其腦組織，用羥胺比色法測(cè)定腦組織中Ach含量和Ach-E的活性。結(jié)果模型組動(dòng)物達(dá)岸時(shí)間(即潛伏期)明顯延長(zhǎng)，表明空間學(xué)習(xí)記憶產(chǎn)生障礙；陽(yáng)性對(duì)照組，隔山消高、低劑量組潛伏期均明顯低于模型組，且第3天成績(jī)好于空白對(duì)照組。三者相互比較，隔山消高劑量組第3天成績(jī)最好。隔山消高，低劑量組的Ach含量明顯高于模型組，而隔山消高低劑量組的AchE活性均略高于模型組，且均低于陽(yáng)性對(duì)照組。結(jié)論隔山消對(duì)于藥物所致的空間學(xué)習(xí)記憶障礙有一定的作用。

關(guān)鍵詞：隔山消； 空間記憶障礙； Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)； 小鼠

The Effects of Cynachum uilfordii (Maxim) Hemsl on the Learning Memory Disorder Caused by Drug in Mouse

Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of Cynachum uilfordii (Maxim) Hemsl on the mouse space learning memory disorder caused by drug and to investigate the mechanism of effection.Methods50 mouse were randomly pided into blank matched group，model group，positive control group(manyprickle acanthopanax root injection)，Cynachum uilfordii high dosage group(15 g/kg) and low dosage group (7.5 g/kg).Each group was deal with severally，then measured the latent periods in Morris Water Maze test.The mouse of each group were put to death by dislocating their cervical vertebras after the behavior tests.The brain was hydroxylamine colorimetric method.ResultsThe reachingbank time (latent period)of model group prolonged obviously，which showed the space learing memory disorder;The latent periods of positive control group，Cynachum uilfordii high dosage group and low dosage group prolonged control group，Cynachum uilfordii high dosage group was the best of the three above.The content of Ach of Cynachum uilfordii high dosage group and low dosage group was visibly high dosage group and low dosage group were appreciably higher than that of model group，and both of them were lower than of positive control group.ConclusionThe results indicated the Cynachum uilfordii(Maxim)Hemsl has effect on the space learing memory disorder caused by drug.

Key words:Cynachum uilfordii(Maxim) Hemsl; Learning memory disorder; Morris Water Maze test; Mouse

學(xué)習(xí)記憶屬高級(jí)神經(jīng)活動(dòng)。學(xué)習(xí)和記憶的基本過(guò)程大致可分為三個(gè)階段：獲得，鞏固和再現(xiàn)。了解學(xué)習(xí)記憶過(guò)程，提高學(xué)習(xí)記憶能力，無(wú)疑是當(dāng)今社會(huì)一個(gè)值得關(guān)注的課題。根據(jù)學(xué)習(xí)記憶的生理生化基礎(chǔ)，目前多選用一些化學(xué)藥品致記憶損傷。從而復(fù)制出學(xué)習(xí)記憶障礙模型，以研究各種藥物對(duì)某些藥物所致的學(xué)習(xí)記憶障礙方面的改善作用。近年來(lái)，我國(guó)傳統(tǒng)的中藥越來(lái)越受到重視，中藥在許多疾病的治療上，顯示出的優(yōu)越性是許多西藥所不及的。隔山消Cynachum uilfordii(Maxim)Hemsl又名白首烏，是祖國(guó)傳統(tǒng)中藥，具有養(yǎng)血益肝，固腎益精，烏須黑發(fā)和延年益壽的功效?，F(xiàn)在研究發(fā)現(xiàn)白首烏中含有多種有效成分，具有抗腫瘤，抗衰老等多方面的藥理活性，其主要成分為羥基馬甾烷酯苷，其中富含磷脂類(lèi)成分，可以抗腫瘤抗衰老，而且對(duì)腦細(xì)胞具有保護(hù)作用。據(jù)此設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)，研究隔山消對(duì)藥物所致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的影響，并測(cè)定其大腦中Ach含量和Ach-E活性的改變，以初步探討其可能的作用機(jī)理。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物與藥品選用成年健康的昆明種小鼠，雌雄各半，體重20～30 g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隔山消，中藥原材料，購(gòu)自湖北省中藥材公司，由湖北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)部進(jìn)行加工粉粹過(guò)篩120目，實(shí)驗(yàn)時(shí)取7 g粉末，加入45 g純凈水，文火加熱至沸騰，靜置10 min后，過(guò)濾兩次取其過(guò)濾液。4℃保存，灌胃前適當(dāng)加溫。刺五加注射液(有效成分黃酮5 mg/ml，批號(hào)ZZ5397黑衛(wèi)藥準(zhǔn)字(1990)第200416號(hào))，黑龍江烏蘇里江制藥有限公司。戊巴比妥鈉粉劑，上海試劑分購(gòu)度試劑廠，批號(hào)：860603，用蒸餾水配置成1.5%溶液，供腹腔注射。溴化乙酰膽堿，其他試劑均為市售分析純或化學(xué)純。

1.1.2 儀器Morris水迷宮系統(tǒng)：水桶直徑76 cm，桶高36 cm，水深12.9 cm，安全島高：11.4 cm，計(jì)算機(jī)軟件系統(tǒng)：泰盟Bio2000實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)；攝像機(jī)；SONY；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)TL16R(上海離心機(jī)研究所)；722型分光光度計(jì)；上海申化儀表自控公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組與模型的建立將50只小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，①空白對(duì)照組：不給予任何藥物，于每次訓(xùn)練前1 h灌胃(NS，0.5 ml/20 g)②模型組：于實(shí)驗(yàn)前3 d開(kāi)始每天腹腔注射戊巴比妥鈉1次(劑量：1.5 mg/ml，0.1 ml/10 g體重)。開(kāi)始實(shí)驗(yàn)后，每次訓(xùn)練前30 min戊巴比妥鈉腹腔注射(劑量同上)③陽(yáng)性對(duì)照組：于實(shí)驗(yàn)前6 d開(kāi)始每天腹腔注射1次刺五加注射液(劑量：1.5 mg/ml，0.1 ml/10 g體重)。開(kāi)始實(shí)驗(yàn)后于訓(xùn)練前1 h腹腔注射剌五加注射液，劑量同上。④隔山消低、高劑量組：實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前6 d開(kāi)始每天灌胃(隔山消，7.5，15 g/kg)實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后每天提前1 h灌胃。其中，陽(yáng)性對(duì)照組，隔山消低、高劑量組在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后，于每天訓(xùn)練前30 min腹腔注射戊巴比妥鈉1次(劑量：1.5 mg/ml，0.1 ml/10 g體重)。

1.2.2 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)方法用過(guò)圓心的兩條相互垂直線分水迷宮為A，B，C，D 4個(gè)象限，安全島位于A象限，位置固定。每天將小鼠依次從B，C，D區(qū)面朝桶壁放入水迷宮中，記錄其自下水到抵達(dá)并停留在安全島(A區(qū))上所用的時(shí)間，即潛伏期。以120 s為限，若此時(shí)間內(nèi)動(dòng)物不能到達(dá)安全島，在將此小鼠安置于安全島上10 s，讓其熟悉環(huán)境。

1.2.3 Ach含量和Ach-E活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，于冰臺(tái)上以頸椎脫臼法處死，并迅速取出全腦，去其腦干及小腦，用水生理鹽漂洗，濾紙吸干后稱(chēng)重，樣品以冰生理鹽水配制成20%勻漿液，4℃ 4 500 r/min離心5 min，取其上清液，按羥胺比色法進(jìn)行Ach含量，Ach-E活性測(cè)定。

轉(zhuǎn)貼于

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s表示，各組間差異用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 隔山消對(duì)戊巴比妥鈉所致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的影響連續(xù)3 d的水迷宮試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型組的潛伏期成績(jī)明顯延長(zhǎng)，說(shuō)明模型復(fù)制成功。陽(yáng)性對(duì)照組第3天的潛伏期明顯縮短，與模型組比較(P＜0.05)；隔山消高劑量組第3天的潛伏期與模型組比較(P＜0.01)；隔山消低劑量組第3天的潛伏期與模型組比較(P＜0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1，圖1。

表1 隔山消對(duì)戊巴比妥鈉所致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的影響(略)

圖1 隔山消對(duì)戊巴比妥鈉所致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的影響

2.2 隔山消對(duì)小鼠腦組織Ach含量，Ach－E活性的影響在低溫下取小鼠腦組織勻漿，用羥胺比色法測(cè)定各組小鼠腦組織中Ach含量及AchE活性，其結(jié)果顯示：隔山消高，低劑量組小鼠腦組織中的Ach含量明顯高于模型組小鼠腦組織中的Ach含量(P≤0.01)，隔山消高，低劑量組小鼠腦組織中的AchE活性均高于模型組。結(jié)果見(jiàn)表2，圖2～3。

表2 隔山消對(duì)戊巴比妥鈉所致學(xué)習(xí)記憶障礙（略）

3 討論

隔山消，又名白首烏，是傳統(tǒng)補(bǔ)腎良藥，具有養(yǎng)血益肝，固腎益精，烏須黑發(fā)和延年益壽的功效。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)該中藥含有多種有效成分，具有抗腫瘤，抗衰老等多方面的藥理活性，其主要成分為羥基馬甾烷酯苷，其中富含磷脂類(lèi)成分，可以抗腫瘤抗衰老，而且對(duì)腦細(xì)胞具有保護(hù)作用。中醫(yī)認(rèn)為“腎藏精，精生髓，通于腦”，“腦為髓?！?，故腦功能與腎精盛衰密切相關(guān)。補(bǔ)腎可益精生髓，健腦促智，中醫(yī)藥臨床上運(yùn)用補(bǔ)腎法延緩衰老，防止腦功能減退有悠久歷史。而用隔山消對(duì)抗藥物引起的空間學(xué)習(xí)記憶障礙尚未見(jiàn)報(bào)道。

圖2 隔山消對(duì)戊巴比妥鈉所致學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠腦組織Ach含量的影響

圖3 隔山消對(duì)戊巴比妥鈉所致學(xué)習(xí)記憶障礙

小鼠腦組織AchE活性的影響本實(shí)驗(yàn)從動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)和生化測(cè)定實(shí)驗(yàn)兩方面探討隔山消在對(duì)抗藥物引起的空間記憶障礙的作用。先用藥物造成小鼠空間學(xué)習(xí)記憶障礙，即制作動(dòng)物一種記憶障礙的模型，采用水迷宮實(shí)驗(yàn)方法，觀察藥物對(duì)動(dòng)物行為功能的影響，同時(shí)用生化測(cè)定方法，初步分析藥物作用機(jī)制。為獲得穩(wěn)定可靠的模型，需注意以下問(wèn)題：實(shí)驗(yàn)環(huán)境對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有非常大的影響。本實(shí)驗(yàn)宜在隔音或半隔音室內(nèi)進(jìn)行，同內(nèi)溫度，濕度光照度應(yīng)適宜并保持一致。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)物品擺放及實(shí)驗(yàn)人員在實(shí)驗(yàn)中所處的位置保持一致。本實(shí)驗(yàn)觀察到上午與下午進(jìn)行的測(cè)試會(huì)有所差別，可能與上、下午小鼠分泌的激素或神經(jīng)甾體的量有關(guān)。光線的強(qiáng)弱、室內(nèi)物品的擺放，和實(shí)驗(yàn)人員站位對(duì)小鼠測(cè)試也有較大影響。小鼠在一定的空間、光線下訓(xùn)練，經(jīng)條件反射形成記憶，改變上述實(shí)驗(yàn)條件，會(huì)影響條件反射的形成，從而使實(shí)驗(yàn)結(jié)果有較大差異。通過(guò)水迷宮實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)性對(duì)照組(刺五加組)和隔山消組(高、低劑量組)對(duì)小鼠尋找平臺(tái)的潛伏期均明顯小于模型組。結(jié)果顯示，隔山消對(duì)藥物所致的空間學(xué)習(xí)記憶障礙，有明顯改善作用。Ach是腦內(nèi)的經(jīng)典神經(jīng)遞質(zhì)，與認(rèn)識(shí)、學(xué)習(xí)、記憶等大腦高級(jí)神經(jīng)功能有關(guān)。學(xué)習(xí)記憶任務(wù)的完成伴隨著腦內(nèi)的Ach的變化。AchE是Ach的分解酶，它的活力變化可間接反映腦內(nèi)Ach含量的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)采用羥胺比色法測(cè)定腦組織乙酰膽堿和膽堿酯酶的含量，結(jié)果提示，模型組小鼠腦組織中Ach含量和Ach-E活性均低于正常對(duì)照組和給藥組鼠，隔山消組小鼠腦組織中Ach含量及AchE活性明顯高于模型組。表明隔山消對(duì)戊巴比妥鈉所致的小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的改善可能與影響中樞膽堿能系統(tǒng)功能有一定關(guān)系。大腦的空間學(xué)習(xí)記憶能力涉及到多種機(jī)制參與，而不是單一的膽堿能系統(tǒng)來(lái)發(fā)揮作用的，因此有關(guān)其他作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

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第9篇：動(dòng)物行為學(xué)分析范文

現(xiàn)代質(zhì)譜技術(shù)作為蛋白質(zhì)組學(xué)支撐技術(shù)之一，在蛋白質(zhì)和肽段的鑒定、定量和結(jié)構(gòu)分析方面起著非常重要的作用。質(zhì)譜分析進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定和序列測(cè)定的基本原理是使用電噴霧離子化和基質(zhì)輔助激光解吸離子化的軟電離方法，經(jīng)酶切后的蛋白質(zhì)肽段或完整蛋白質(zhì)帶上電荷，然后根據(jù)不同離子間的質(zhì)荷比的差異來(lái)分離并確定相對(duì)質(zhì)量。樣品分子進(jìn)行上述方法電離時(shí)能保留整個(gè)分子，確保了完整性而不會(huì)形成碎片離子，稱(chēng)為肽質(zhì)量指紋圖譜（PMF）技術(shù)。PMF是一種現(xiàn)在運(yùn)用最廣的用來(lái)鑒定2-DE分離出來(lái)的蛋白質(zhì)和肽的方法，伴隨著現(xiàn)代質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展，其在蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用將越來(lái)越廣泛。

高效液相色譜及多維液相色譜高效液相色譜（HPLC）技術(shù)最初被用于分離蛋白質(zhì)或多肽?，F(xiàn)在，HPLC已成功應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，它是基于樣品分子在固定相（柱填料）和流動(dòng)相（淋洗液）間的特殊相互作用而實(shí)現(xiàn)樣品分離的。無(wú)須變性處理樣品，可實(shí)現(xiàn)上樣收集及在線分析的自動(dòng)化。利用液相色譜結(jié)合電噴霧質(zhì)譜（ESI-MS）而不依賴(lài)于2-DE，也可以分析磷肽或糖肽，先由特異性的胰蛋白酶消化，產(chǎn)生的多肽由強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱和反相HPLC分離后經(jīng)ESI-MS/MS分析。液相色譜與MS聯(lián)用，采用高速且高靈敏度的色譜分離法來(lái)代替耗時(shí)的2-DE蛋白質(zhì)分離法，故其與經(jīng)典的2-DE-MS法相比，具有快速、樣品需要量少和多肽分離的通用性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，將會(huì)在不同酪蛋白形式的分子特性描述中得到更進(jìn)一步的應(yīng)用。但由于層析填充物對(duì)許多蛋白質(zhì)組分有吸附作用，且難以實(shí)現(xiàn)多組分蛋白質(zhì)樣品的多維層析，因此僅適用于研究單一蛋白質(zhì)或簡(jiǎn)單樣品蛋白質(zhì)組。多維液相色譜（MLC）則是利用與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用，可以檢測(cè)低豐度肽段，是目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究最新的技術(shù)，可快速并高通量鑒定復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物。

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在畜禽動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)中的應(yīng)用

傳統(tǒng)肉類(lèi)生產(chǎn)中的飼養(yǎng)管理、飼料結(jié)構(gòu)、飼喂方式和飼養(yǎng)密度在基于動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)和飼料工業(yè)的現(xiàn)代肉類(lèi)生產(chǎn)的出現(xiàn)后，發(fā)生了本質(zhì)性的改變。同時(shí)，大規(guī)模的現(xiàn)代肉類(lèi)生產(chǎn)影響到了飼養(yǎng)動(dòng)物的生理學(xué)、行為學(xué)和生物化學(xué)過(guò)程，隨之導(dǎo)致了肉品品質(zhì)的下降。同時(shí)生產(chǎn)者為了增大產(chǎn)量和減少疾病風(fēng)險(xiǎn)，在養(yǎng)殖過(guò)程中濫用抗生素等化學(xué)藥物，加劇了肉類(lèi)品質(zhì)的惡化。此外，為了追求提高肉類(lèi)的某些性能，忽視了飼養(yǎng)動(dòng)物的體質(zhì)健康、外部形狀與內(nèi)在機(jī)能的協(xié)調(diào)，生理學(xué)的平衡和整體適應(yīng)性，從而導(dǎo)致現(xiàn)代肉用動(dòng)物（豬和雞）對(duì)周?chē)h(huán)境條件的高度敏感性，最終導(dǎo)致了肉品的食用品質(zhì)，如：色澤、風(fēng)味和嫩度等下降，PSE肉的比例升高，肉中的抗生素殘留現(xiàn)象極為突出。鑒于此，對(duì)肉品品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)并對(duì)其進(jìn)行可能的等級(jí)標(biāo)注及對(duì)其生產(chǎn)過(guò)程控制，對(duì)于現(xiàn)代肉品生產(chǎn)至關(guān)重要。蛋白質(zhì)是肌肉組織的重要組成成分，研究表明：肉類(lèi)品質(zhì)研究與功能蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)研究間密不可分，蛋白組變化可能與肉的嫩度相關(guān)。肌纖維分紅肌纖維和白肌纖維2種類(lèi)型，這2種類(lèi)型在代謝水平上存在著結(jié)構(gòu)和功能的差異。纖維類(lèi)型與肉質(zhì)性狀，如：性、風(fēng)味和嫩度等的關(guān)系存在著很多爭(zhēng)議，尤其是纖維類(lèi)型對(duì)肉嫩度的影響仍然不清。Lametsch等首次利用蛋白質(zhì)組學(xué)分析屠宰后豬肌肉的變化情況，采集了剛屠宰至屠宰后48h的肌肉蛋白質(zhì)組樣品，這些肌肉蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量介于5000~20萬(wàn)不等，pH在4~9，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)組模式發(fā)生了15種顯著的變化。此后的研究中Lametsch等最終確定了可作為肉品質(zhì)標(biāo)記的20多種蛋白質(zhì)，包括結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)（肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白和肌鈣蛋白）和代謝酶（肌激酶、丙酮酸激酶和糖原磷酸化酶）。在這些標(biāo)記蛋白中，人們發(fā)現(xiàn)肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白重鏈與肌肉的剪切力間存在極顯著的相關(guān)，這就清楚地表明屠宰后肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白重鏈的降解會(huì)影響肉的質(zhì)量。Remignon等直接對(duì)肌肉蛋白質(zhì)片段進(jìn)行分析，認(rèn)為蛋白質(zhì)的改變很可能是導(dǎo)致家禽PSE肉綜合征的直接原因。Molette等研究發(fā)現(xiàn)火雞屠宰后胸肌糖酵解的速度比較快（屠宰后每20minpH比正常的多下降0.5），從而使得肉品質(zhì)發(fā)生改變，如：系水力下降、加工產(chǎn)量降低和嫩度降低等。同樣報(bào)道了糖酵解快的動(dòng)物肉的系水力低，并且提取到的肌漿蛋白含量低，這表明當(dāng)pH下降的速率加快時(shí)蛋白質(zhì)功能發(fā)生了改變。

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)中的應(yīng)用

蛋白質(zhì)組學(xué)方法在水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)特別是魚(yú)的品質(zhì)鑒定中已有應(yīng)用，目前也被廣泛應(yīng)用到了對(duì)蝦和海蜇等的品質(zhì)控制中。隨著對(duì)魚(yú)類(lèi)水產(chǎn)品的需求日益增長(zhǎng)，保障和控制其安全生產(chǎn)具有重要的意義。在以數(shù)量增長(zhǎng)為主的水產(chǎn)集約化養(yǎng)殖、運(yùn)輸和銷(xiāo)售過(guò)程中，擁擠應(yīng)激是常見(jiàn)的影響水產(chǎn)品食用品質(zhì)的因素，解凍程序同樣深刻地影響水產(chǎn)的品質(zhì)。近年來(lái)，蛋白質(zhì)組學(xué)已被廣泛地應(yīng)用到了水產(chǎn)品品質(zhì)控制。Inger等利用2-DE技術(shù)研究新鮮的鱈魚(yú)與死后鱈魚(yú)肌肉，發(fā)現(xiàn)有11個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的豐度發(fā)生了變化，其中8個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的豐度顯著增加，后續(xù)分析表明：這些蛋白質(zhì)點(diǎn)是肌原蛋白、肌漿蛋白和肌肉纖維等肌肉組織的分解產(chǎn)物。由此可見(jiàn)，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)評(píng)價(jià)魚(yú)肉鮮度等品質(zhì)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。Kjaersgard等通過(guò)對(duì)11種不同冷凍儲(chǔ)存條件下對(duì)鱈魚(yú)肌肉蛋白質(zhì)圖譜進(jìn)行研究分析，發(fā)現(xiàn)不同冷凍儲(chǔ)存溫度對(duì)蛋白質(zhì)圖譜并無(wú)顯著影響，但經(jīng)過(guò)不同的冷凍儲(chǔ)存時(shí)間（3、6和12個(gè)月），肌漿球蛋白輕鏈、磷酸丙糖異構(gòu)酶、醛縮酶A和2-α肌動(dòng)蛋白片段等蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度發(fā)生了顯著變化，從而導(dǎo)致魚(yú)肉的質(zhì)地和味道發(fā)生了變化。Martinez等通過(guò)研究人工養(yǎng)殖的鱈魚(yú)與野生的鱈魚(yú)，比較發(fā)現(xiàn)人工養(yǎng)殖的鱈魚(yú)2-DE圖上蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量在3.5萬(wàn)~4.5萬(wàn)間存在顯著差異。然而目前蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖和貯藏加工過(guò)程中的研究還處于起步階段，隨著相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，將在水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)中起到更加重要的作用。